METODICHE DI IMMUNOCHIMICA
IMMUNOCHIMICA permette la determinazione quantitativa di proteine in tessuti e omogenati
INTERAZIONI ANTIGENE-ANTICORPO L immunochimica si basa sulle interazioni antigene-anticorpo Idealmente, l anticorpo dovrebbe riconoscere l antigene che è stato usato per la sua produzione È tuttavia possibile che peptidi sintetici riescano a riprodurre le caratteristiche di un antigene, e questo può essere vantaggioso a fini sperimentali anticorpi molto specifici
ANTIGENE proveniente da animale A (es: topo) inoculazione animale B (es: coniglio) ANTICORPO attivo contro l antigene proveniente da animale A risposta immunitaria complesso antigene-anticorpo
ANTIGENE epitopo gli epitopi sono i siti dell antigene a cui si lega l anticorpo un antigene può contenere più di un epitopo
ANTICORPO POLICLONALE lega più di un epitopo ANTICORPO MONOCLONALE lega solo un epitopo alta standardizzazione, caratterizzazione, selettività e riproducibilità dei risultati applicazioni terapeutiche
TECNICA IBRIDOMA MULTIPLO l animale vivo produce anticorpi policlonali le cellule di ibridoma producono anticorpi monoclonali
splenociti cellule di mieloma formazione ibridi formazione ibridi colonie ibridomi (7gg) colonie ibridomi (10gg)
METODI IMMUNOCHIMICI ELISA (Enzyme-Linked Immunoassorbent Assay) Western blot Radioimmunotest Immunoistochimica
METODO ELISA determina la presenza di antigeni o anticorpi può essere qualitativo, semi-quantitativo o quantitativo a seconda di come viene svolto prevede delle curve di competizione a diversi valori di enzima (legato all anticorpo) per evidenziare l affinità antigene-anticorpo
METODO ELISA presenza antigene presenza anticorpi contro antigene
METODO ELISA un applicazione analoga dell ELISA è il dosaggio ormonale
IMMUNOBLOTTIG (WESTERN BLOTTING) metodica quantitativa che permette di identificare proteine mediante elettroforesi e reattività con anticorpi spesso è usato per confermare ELISA basato sulla migrazione elettroforetica delle proteine
PRINCIPI DI ELETTROFORESI Macromolecole cariche positivamente o negativamente (acidi nucleici e proteine) sono separate per mezzo di un campo elettrico. La velocità alla quale una molecola migra è: direttamente proporzionale al voltaggio applicato e alla carica elettrica della molecola inversamente proporzionale alle dimensioni della molecola e alla viscosità della soluzione Matrici: AGAROSIO, POLIACRILAMMIDE
IMMUNOBLOTTIG (WESTERN BLOTTING) 1. Separazione delle proteine (caricate negativamente) sulla base del peso molecolare con gel elettroforesi 2. Trasferimento delle proteine separate dal gel ad una membrana di supporto elettroforetico (es:nitrocellulosa) 3. Immuno-rilevazione delle proteine di interesse con anticorpo
2 1 3 4
ESEMPI DI WESTERN BLOT E APPLICAZIONI analisi proteine della famiglia bcl-2 analisi proteine in fluorescenza
ESEMPI DI WESTERN BLOT E APPLICAZIONI analisi recettori purinergici P2 proteine del cytomegalovirus il Western Blot non è utile solo come metodica per la ricerca di base, ma può essere impiegato come test per confermare la sieropositività a HIV e epatiti
RADIOIMMUNOTEST O DOSAGGIO RADIOIMMUNOLOGICO
RADIOIMMUNOTEST test quantitativo per dosaggi immunogenici che utilizza composti marcati test molto sensibile, preciso e riproducibile presenta costi significativi è applicabile ad analisi cliniche di vario tipo (ormoni, stupefacenti)
RADIOIMMUNOTEST ANTICORPO ANTIGENE MARCATO (*) ANTIGENE NON MARCATO competizione QUANTITA DI ANTIGENE NEL CAMPIONE
RADIOIMMUNOTEST 125 I CCK cpm max O + Ab CARBONE 1000 min BK no Ab CARBONE 100 1 +Ab CARBONE 900 CURVA 5 +Ab CARBONE 800 STANDARD 10 +Ab CARBONE 600 CCK 20 +Ab CARBONE 400 50 +Ab CARBONE 200 il carbone adsorbe il complesso antigene-anticorpo ad alto peso molecolare
CURVA DI CALIBRAZIONE sostanza non marcata = ridotta radioattività rilevata l utilizzo della curva di calibrazione permette di calcolare la concentrazione di un campione ignoto, confrontando i valori di radioattività rilevati
RADIOIMMUNOTEST
IMMUNOISTOCHIMICA metodo qualitativo con applicazioni quantitative valuta peptidi (es:enzimi) recettori canali ionici LOCALIZZAZIONE COESISTENZA TRACCIANTI trasportatori
IMMUNOISTOCHIMICA -fissazione tessuto (in vivo) -post-fissazione tessuto (ex vivo) -taglio (criostato o vibratomo) -incubazione con anticorpo primario -incubazione con anticorpo secondario -visualizzazione della reazione -eventuale quantificazione dei risultati
STRUMENTI PER PERFUSIONE
STRUMENTI PER IMMUNOISTOCHIMICA CON FETTINE FLUTTUANTI
IMMUNOISTOCHIMICA tecniche dirette un solo anticorpo due livelli il marker si lega all anticorpo primario
IMMUNOISTOCHIMICA tecniche indirette più anticorpi più di due livelli il marker si lega all anticorpo secondario o terziario, se presente
IMMUNOISTOCHIMICA INDIRETTA CON LA TECNICA PAP l anticorpo primario lega la CAT (proteina bersaglio), gli anticorpi secondario e terziario servono per amplificare il segnale
IMMUNOISTOCHIMICA INDIRETTA CON LA TECNICA ABC sfrutta il reticolo di legami formato dalle proteine avidina e biotina con l anticorpo secondario che permette una notevole amplificazione del segnale -l avidina ha 4 siti di legame per la biotina e i suoi coniugati -numerose molecole di biotina possono reagire con una molecola di perossidasi e a loro volta interagire con l avidina -regolando il rapporto avidina/biotina si può formare un reticolo esteso con la perossidasi -è possibile regolare la sensibilità modificando il numero di molecole di perossidasi
ESEMPI DI COLORAZIONI IMMUNOISTOCHIMICHE neuroni dopaminergici positivi alla tirosina idrossilasi astroglia astroglia attivata in corso di neuroinfiammazione
ISTOCHIMICA traccianti anterogradi traccianti retrogradi può essere combinata all immunoistochimica