sirna Strategie di silenziamento genico post-trascrizionale
RNAi Introduction RNAi = RNA interference Il termine è utilizzato per descrivere l interferenza dell RNA come meccanismo naturale e anche come strumento scientifco di ricerca. Silenziamento dell espressione di un gene mediante l introduzione in cellula di RNA a doppia elica.
RNAi Introduction In natura l RNAi è un meccanismo di difesa genica. L obiettivo è quello di silenziare tipi di RNA che non sono normalmente prodotti da una cellula come l RNA virale. L RNAi serve anche a mettere in evidenza la funzione di un gene attraverso esperimenti di loss of function knock-out inattivazione permanente di un gene knock-down inattivazione transiente dell espressione di un gene (può essere effettuata sfruttando l RNAi)
RNAi Introduction Silenziamento genico post-trascrizionale Scoperto in c. elegans e piante (petunia) Ruolo protettivo: resistenza a parassiti e virus. Mammiferi L RNAi avviene (difesa-regolazione dell espressione genica)
sirna Introduction Gli sirna sono piccole molecole di dsrna - strands di 21 nucleotidi di RNA in un duplex temporaneo - double-strands di 19 nucleoti, con 2 basi protrudenti. P-5 OH-3 5 -P 3 -OH
sirna Introduction Prima fase Gli sirna si producono quando un enzima chiamato DICER taglia dsrnas in piccoli duplex noti come sirna. Questi dsrna sono codificati dal genoma della cellula o portati da trasposoni, virus, transgeni.
sirna Introduction Dicer DICER genera RNAs con 2 nt protrudenti al 3 idrossilato e al 5 fosforilato, entrambi richiesti per l attivita Dicer negli insetti richiede ATP per il suo funzionamento.
sirna Introduction Seconda fase 3 5 5 CAP
sirna Introduction RISC Le proteine di RISC hanno attivita di elicasi, esonucleasi, endonucleasi e di ricerca di omologia. Inizialmente RISC e inattivo, poi si trasforma in attivo dopo lo srotolamento dell RNA duplex e perdita della strand senso (passeggero). La strand antisenso (guida) determina la specificita dell RNAi
sirna Introduction Focus on RNA interference - A user s guide September 2006 Nature Genetics June 2006 Supplement
sirna Introduction Sintesi chimica degli sirnas Sequenza 50-100 bp a valle dello start codon circa 21 nucleotidi contenuto in GC : 30-70% 5 fosfato, 3 idrossilato sono molto costosi non vengono amplificati in cellule di mammifero per cui il silenziamento è in genere transiente.
sirna Introduction Espressione stabile di sirnas 2 vie per generare sirnas de novo promotore U6 1a via: 2 promotori per RNA pol IIIs ognuno trascrive o il senso o l antisenso che si appaiano nel nucleo per creare un dsrna de novo dsrna promotore H1
sirna Introduction Espressione stabile di sirnas U6 Sequenza senso Sequenza senso Sequenza antisenso antisenso Hair-pin loop
Vectors expressing shrnas
sirna Introduction Vettori di espressione per sirnas Vettori plasmidici Natura transiente (le cellule ricombinanti vanno selezionate) Efficienza di trasfezione bassa o variabile vettori virali Alta efficienza Migliori dei plasmidici Vettori plasmidici basati su promotori tessuto-specifici
sirna Introduction in vitro Metodi di transfezione Transfezione chimica con lipidi cationici (Lipofectamine, Oligofectamine ) Elettroporazione in vivo Iniezione intramuscolare Trasfezione idrodinamica in mammiferi
sirna Introduction
sirna Introduction
RNAi Experiment Overview Due obiettivi principali Buon Knockdown del Target Metodo di trasfezione Quantita di sirna Disegno temporale del saggio Alta vitalita cellulare Salute delle cellule Densita cellulare Bassa tossicita
Experiment: Basic Requirements I Controlli negativi ü Scrambled sirna Nessuna omologia con geni noti Stessa composizione nucleotidica ma con sequenza casuale (scrambled) Mostra variazioni del fenotipo dovute a presenza di corpi estranei ü Mock, Cellule controllo non transfettate Cellule trattate con gli stessi buffers ed agenti transfettanti ma senza sirna. Per verificare variazioni dell espressione dovute alla presenza dei reagenti di trasfezione e buffers. Whither RNAi, Nature Cell Biology 5, 489-490 (2003)
Experiment: Basic Requirements I Controlli positivi ü Test per efficienza di silenziamento La quantità di mrna o di proteina devono essere verificati mediante q-rtpcr o western blotting rispettivamente ü Test per l efficienza della trasfezione Si possono utilizzare sirna marcati con molecole fluorescenti per verificare l effettiva transfezione in cellula Whither RNAi, Nature Cell Biology 5, 489-490 (2003)
Experiment: Basic Requirements II ü Disegni multipli di sirna Disegnati su posizioni diverse del gene (esoni) Conferma il knockdown dovuto alla presenza dell sirna ü Monitorare le variazioni di mrna (RT-PCR/real time) ü Monitorare le variazioni di livelli proteici (Western blotting) ü Monitorare effetti Off-Target e l eventuale risposta antivirale appaiamento con un mrna non specifico produzione di risposta aspecifica all introduzione di RNA (interferone)
Experiment: Basic Requirements II Controllo dell abbondanza della proteina e del relativo mrna mediante western blotting e PCR scrambled I scrambled II sirna I sirna II Whither RNAi, Nature Cell Biology 5, 489-490 (2003)
Experiment Optimization ü Scelta del reagente per la transfezione Depende dal tipo cellulare usato ü Quantita di reagente di trasfezione Troppo e tossico, troppo poco riduce l efficienza di transfezione ü Densita di piastramento (cellule) Alta densita : difficile accesso dell sirna alle cellule Bassa densita : materiale insufficiente per la sperimentazione Goal: Buon livello di Knock-Down con sufficiente livello di cellule per la sperimentazione. ü Quantita di sirna L obiettivo e quello di minimizzare la quantita richiesta per esperimento per ridurre i costi (in genere ~10-30nM) Ridurre l effetto off target!
Experiment Optimization Tips ü Le condizioni ideali vanno trovate utilizzando una sequenza di sirna gia testata. ü Cercare in letteratura gli sirna gia utilizzati ed i protocolli utilizzati. ü Il silenziamento tipicamente dura per 3-4 giorni prima che i livelli di mrna riprendano a salire. Il silenziamento a lungo termine richiede l uso di sistemi di espressione basati su vettori(shrna).
http://www.nature.com//focus/rnai/animations/animation/animation.htm