LABORATORIO DI MICROBIOLOGIA DFC
Genetica batterica Trasformazione : l uccisione di una cellula non distrugge il DNA che mantiene le sue proprietà, nel caso penetri in una nuova cellula batterica. Coniugazione : due cellule batteriche entrano in contatto tramite una struttura detta sex pilus che permette il trasferimento di materiale genetico (plasmidi). Trasduzione (conversione fagica) : il trasferimento genetico è mediato da batteriofagi, sono virus capaci di infettare i batteri, può essere ristretta o generalizzata. 3
TRASFORMAZIONE
TRASDUZIONE Materiale genetico può essere trasferito da batterio a batterio mediante batteriofagi o virus. La trasduzione può essere generalizzata quando il batterio infettato viene lisato, parti del DNA batterico vengono inglobate dai fagi neosintetizzati, in una successiva infezione caratteristiche del DNA del batterio possono comparire in altri batteri infettati. La trasduzione di tipo ristretto prevede l inclusione del DNA virale in quello cromosomico, (ciclo lisogeno), in un secondo tempo si ha la lisi del batterio, con fuoriuscita dei fagi maturi che conterrano all interno del loro Dna materiale genetico batterico. La conversione fagica è un tipo di particolare trasduzione che comporta l acquisizione di nuove caratteristiche da parte di una specie batterica, C. diphteriae dopo infezione con fago beta produce tossina difterica. (ce FAGO BETA tossina botulinica in ceppi di C. botulinum) 6
Trasduzione generalizzata
Trasduzione ristretta Il DNA fagico non contiene una porzione del DNA dell ospite Il DNA fagico contiene una porzione del DNA dell ospite
Genetica batterica Trasformazione : l uccisione di una cellula non distrugge il DNA che mantiene le sue proprietà, nel caso penetri in una nuova cellula batterica. Coniugazione : due cellule batteriche entrano in contatto tramite una struttura detta sex pilus che permette il trasferimento di materiale genetico (plasmidi). Trasduzione (conversione fagica) : il trasferimento genetico è mediato da batteriofagi, sono virus capaci di infettare i batteri, può essere ristretta o generalizzata. 9
CONIUGAZIONE La coniugazione avviene tramite una particolare struttura detta sex pilus, non si tratta di un mezzo di riproduzione non c è fertilità ma è un passaggio di porzioni di DNA. La differenza tra cellula donatrice e ricevente è nella presenza di un plasmide (DNA circolare extracromosomiale) che è indipendente nella replicazione rispetto al DNA cromosomico. Il plasmide contiene l informazione genetica per codificare il plasmide. Il plasmide può anche essere integrato nel DNA cromosomale (episoma). Le cellule che hanno una copia del fattore F (plasmide) sono dette F +, quelle che non hanno il plasmide F-. Il donatore fa una copia del fattore F per trasferirlo in batteri che non l hanno. Esistono numerosi plasmidi che possono rimanere all interno della cellula batterica in assenza del fattore F. 11
CONIUGAZIONE Il plasmide può contenere anche geni che inducono l antibiotico resistenza. Donatori HFR: si tratta di batteri che hanno il plasmide integrato (ma possono revertire), fanno una copia del loro cromosoma che viene passato al batterio ricevente, comunque in questo passaggio che si realizza in poco tempo il fattore F non viene trasferito per cui i riceventi rimangono F-. Comunque le cellule riceventi acquisiscono altre caratteristiche veicolate dal plasmide. Il fattore R responsabile di questa trasmissione è trasferibile per tutti gli enterobatteri. Questo plasmide contiene sia geni che codificano per la resistenza che geni che codificano per il sex pilus. (fattore R e fattore TF transfer factor). I plasmidi sono elementi trasmissibili che possono contenere anche informazioni che riguardano il metabolismo e l assunzione delle sostanze. 12
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BIOTECNOLOGIE Procedure tramite le quali si possono ottenere quantità commerciali di prodotti utili, mediante l uso di agenti biologici che possono essere batteri lieviti, cell. Vegetali, cell. Animali. Le biotecnologie vengono usate da sempre in agricoltura, per le attività fermentative dei microrganismi. Ingegneria genetica BIOTECNOLOGIE Produzione di anticorpi Ingegneria proteica Chimica degli oligonucleotidi 15
BIOTECNOLOGIE Ingegneria genetica : produzione di farmaci, vaccini prodotti a indirizzo terapeutico. (organismi transgenici, con miglioramento p della resistenza alle malattie infettive, piante, e alle avverse condizioni ambientali, migliore resa nella produzione dei cereali). Ingegneria proteica: modifiche strutturali che modificano l attività in vitro o in vivo di proteine ad uso terapeutico. Chimica degli oligonucleotidi: sintesi di geni 16
INGEGNERIA GENETICA Procedura di manipolazione del DNA: produzione di nuove combinazioni di materiale ereditabile, ottenute mediante inserzione di materiale genico di qualunque provenienza. La tecnica permette di trasferire materiale genetico da un organismo a un altro in condizioni non naturali anche se le cognizioni su cui si basa e gli strumenti impiegati sono tutti derivati dall osservazione dei fenomeni naturali. Tecnica del DNA ricombinante : modifica le caratteristiche genetiche di piante e animali, in modo da migliorare la produzione agricola e zootecnica in senso sia qualitativo che quantitativo. Alterazione artificiale del corredo genetico: sia inserzione che ablazione di un gene. (GMO). 17
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STRUMENTI DELL INGEGNERIA GENETICA ENZIMI : consentono di tagliare il DNA in punti specifici, in modo da separare il tratto di DNA desiderato, di legarlo al vettore prescelto, o modificato in vitro, in modo conveniente alle proprie necessità. VETTORI: consentono l ingresso del gene scelto nella cellula ospite, provvedono alla replicazione del DNA eterologo ed alla sua espressione. ORGANISMI OSPITI: batteri, cellule animali e e vegetali, lieviti. Sono dotati di caratteristiche altamente specifiche. Le loro caratteristiche genetiche o biochimiche li rendono più o meno adatti a detrminate applicazioni pratiche o ad ospitare vettori. 19
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STRUMENTI DELL INGEGNERIA GENETICA Enzimi di restrizione: prodotti da diverse specie batteriche per le quali rappresentano un mezzo di difesa, contro l invasione dei batteriofagi, in quanto degradano ogni DNA riconosciuto come stampo. Questi enzimi tagliano la doppia elica del DNA in punti precisi caratteristici per ognuno di essi. Le dimensioni delle sequenze vanno da 4 a 8 paia di basi. Le sequenze riconosciute sono dette palindromi, sono sequenze con simmetria binaria in direzione di lettura 5 3 sono praticamente identiche. 21
Modalità di taglio da enzimi di restrizione AA TT TT AA Blunt end: le due eliche sono uguali G AA TT C C TT AA G Sticky end: eliche a lunghezza differente estremamente adesive, produzione di molecole chimeriche in notevole quantità. 22
Vettore VETTORI: trasferiscono il DNA esogeno nella cell. ospite in modo da farlo replicare e trasmetterlo alle cellule figlie, mediante il vettore è possibile introdurre un frammento di DNA qualsiasi in una cellula eucariota o procariota, sia mediante microinieizione che ricorrendo a metodi chimico fisici adeguati per rendere permeabile la membrana. Il frammento deve esser stabile si deve replicare insieme con il DNA ad ogni replicazione cellulare, eventualmente il DNA può essere anche fornito di segnali appropriati che lo rendono un informazione genetica comprensibile. Le funzioni di espressione, stabilità sono caratteristiche del vettore prescelto. 23
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Tipi di vettore Elemento genetico extracromosomico (cosmide o plasmide) VIRUS ANIMALI FAGI 28
Tipi di vettore Vettori di clonaggio Plasmidi di piccole dimensioni facili da isolare e purificare, con capacità di replicazione autonoma, conferita anche da un origine di replicazione autonoma. Esitono vettori sintetici in forma plasmidiale che sono atti a varie operazioni clonaggio, espressione, trascrizione. pbr322. Fagi : fago lambda con genoma completamente sequenziato e fornito di appropriate mutazioni, in modo da adattarlo alle necessità del clonaggio, vengono eliminati alcuni geni del fago che sono sostituiti dal DNA esogeno. I fagi presentano il vantaggio di ospitare frammenti di DNA più lunghi. 29
Vettori virus animali I vettori considerati consentono trasferimento di geni nelle cellule batteriche e di lievito. Per introdurre DNA esogeno nelle cellule superiori si adottano come vettori i virus animali in grado di infettare cellule in vitro o in vivo di replicarsi e in alcuni casi di integrarsi nel genoma. Papovirus scimmia (SV$0), papilloma virus bovino, virus herpes,, possono infettare e in alcuni casi trasformare una varietà di linee cellulari. Efficienza di introdurre il proprio DNA nella cellula ospite. 30
Clonaggio Significa fare una copia identica; un frammento di DNA inserito in un vettore che viene replicato un numero elevato di volte una volta che il vettroe raggiunge la cellula ospite, si può anche riferire ad un organismo che produce una popolazione di cellule o individui identici a se stesso (clone) 31
Biotecnologie innovative Prima dello sviluppo delle biotecnologie del DNA ricombinante la maggior parte dei farmaci umani, di natura proteica era disponibile in quantità limitata, a questo va aggiunto la trasmissione di malattie infettive in seguito alle trasfusioni di sangue o la comparsa di serie manifestazione di ipersensibilità. Sfruttando la tecnologia del DNA ricombinante è stato possibile produrre un ampia serie di farmaci in quantità sufficiente molto efficaci e soprattutto sicuri. Attualmente 300 proteine con attività terapeutica vengono prodotte dai microrganismi, contenenti lo specifico gene codificante. 32
INSULINA DA DNA RICOMBINANTE Formata da due catene A e B, difficile ricavare il gene proinsulinico (forma immatura della proteine che viene poi trasformata in insulina) direttamente dalle cellule umane. Di provenienza bovina o suina presentava notevoli problemi di allergia, di costi, di produzione, di minore efficacia dovute ai mezzi di estrazione e purificazione. Estrazione del RNAm dalle cellule beta del pancreas retrotrascrizione in DNA, sintesi chimica in laboratorio il gene della proinsulina o delle singole catene A e B. Dopo avere ottenuto il gene si ha l immissione nel batterio E. coli (ospite) che sarà commissionato alla produzione di insulina umana. 33
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Prodotti da ricombinazione genetica Ormoni peptidici Proteine del sangue fattori di coagulazione Peptidi atriali e neuropeptidi antibiotici Vaccini ricombinanti 36
Vaccini ricombinanti In una cellula eucariota o procariota viene clonato il gene del microrganismo che codifica per la principale proteina immunogena che induce nell ospite la produzione di anticorpi protettivi. Vaccini virali, capside o envelope, vaccini batterici fimbrie, pili etc. L applicazione maggiormente conosciuta è quella del vaccino contro l epatite B, in genere per la produzione vaccinica si usano sempre cellule eucariote per mantenere inalterate tutte le forme di modificazioni postraduzionale. Si isola il gene per l antigene HbsAg detto antigene australia, vien espresso in una cellula di S. cerevisiae. Purezza del 98%. Nessuna rischio di ipersensibilità o intolleranza rispetto a vaccini ottenuti con raccolta di sangue umano. 37