LA SEPSI: ANTIBIOGRAMMA E LABORATORIO DI MICROBIOLOGIA Francesco Luzzaro Laboratorio di Microbiologia e Virologia
Diagnostica microbiologica: prelevare al più presto 2 o più emocolture (prima di cominciare la terapia antibiotica) insieme a colture eseguite a partire da altri siti secondo le indicazioni cliniche
Ricerca della fonte settica: uno specifico sito di infezione dovrebbe essere stabilito il più rapidamente possibile (entro le prime 6 ore di presentazione)
Gram-negativi non fermentanti e carbapenemi P. aeruginosa (COS) A. baumannii (CRAB) Antibiotico MIC mg/l (S/I/R) Antibiotico MIC mg/l (S/I/R) Pip-Tazo > 16 (R) Ceftazidime > 8 (R) Cefepime > 8 (R) Aztreonam > 1 (R) Imipenem > 8 (R) Meropenem > 8 (R) Amikacina > 16 (R) Gentamicina > 4 (R) Ciprofloxacina > 1 (R) Colistina 2 (S) Imipenem > 16 (R) Meropenem > 16 (R) Doripenem > 8 (R) Amikacina > 32 (R) Gentamicina > 16 (R) Tobramicina > 16 (R) Ciprofloxacina > 4 (R) Colistina 2 (S) Tigeciclina 2 Amp-sulbactam 16
EMOCOLTURE: DIAGRAMMA DI FLUSSO Paziente settico Mediamente 96 h Risultato finale Esecuzione dei prelievi Invio al laboratorio Identificazione ed antibiogramma Crescita su piastra Incubazione delle bottiglie 100 Semina su terreno % Positive samples 90 80 70 60 50 40 30 20 10 BACTEC 9240 BacT/Alert 0 0 8 16 24 32 40 48 56 64 72 Incubation time (hrs) Emocoltura positiva Colorazione di Gram Mediamente 48 h prima del risultato diagnostico
Esame microscopico (colorazione di Gram)
Identificazione dei batteri nella routine del Laboratorio di Microbiologia
MALDI-TOF Il sistema è costituito da Sorgente (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization) Analizzatore (Time Of Flight) PC Fornisce accurate informazioni su struttura e peso molecolare di biomolecole: peptidi proteine oligonucleotidi carboidrati polimeri sintetici ID microbica rapida (pochi minuti)
VITEK MS: IDENTIFICAZIONE CON TECNOLOGIA MALDI-TOF
Identificazione da colonia mediante spettrometria di massa
Chiusura del vuoto Principio del MALDI-TOF-MS Sistema sotto vuoto Piastra del Griglie di accelerazione campione Molecole di analita immerse nella matrice Tubo di volo Spettro di Massa Rilevatore di Ioni Lo spettro di massa riflette essenzialmente le molecole di analita
Profilo MALDI Identificazione basata su proteine ribosomiali Spettri di massa specifici per famiglia, genere e specie Intens. [a.u.] 5000 4000 3000 2000 4364.06 5096.01 5380.64 6254.64 6315.49 6410.90 7157.65 7273.87 ribosomal Protein m/z RL36 4364,33 RS32 5095,82 RL34 5380,39 RL33meth. 6255,39 RL32 6315,19 RL30 6410,60 RL35 7157,74 RL29 7273,45 RL31 7871,06 RS21 8368,76 1000 7870.62 8368.99 0 4000 4500 5000 5500 6000 6500 7000 7500 8000 m/z Escherichia coli
Tempo per l identificazione di specie ridotto di 28.8 h Terapia inappropriata dopo 24 h: 4.5% (-10.1%) Appropriato trattamento antibiotico entro 24 h: 75.3% (+11.3%)
Analisi diretta degli estratti batterici mediante MALDI-TOF Staphylococcus aureus resistente alla meticillina (MRSA) Produzione di beta-lattamasi (ESBL, MBL, KPC) Enterococcus faecalis/faecium resistente alla vancomicina (VRE)
Escherichia coli ß-lattamasi-negativo Escherichia coli ß-lattamasi-positivo Escherichia coli ß-lattamasi-positivo dopo aggiunta di acido clavulanico Prodotti di idrolisi dell ampicillina
Isolato produttore di carbapenemasi (KPC): recupero della sensibilità dopo aggiunta di acido boronico S KPC KPC + AB
] ] Isolato produttore di carbapenemasi (MBL): recupero della sensibilità dopo aggiunta di EDTA Intens. [a.u.] x10 4 1.0 0.8 381.372 ceppo1a 0:G2 MS R aw S 0.6 0.4 0.2 300.291 476.067 498.388 520.280 Intens. [a.u.] x10 4 1.0 0.8 0.6 Intens. [a.u.] 0.0 x10 4 1.0 0.8 0.6 ceppo1b 0:H2 MS R aw ceppo2a 0:C 4 MS R aw MBL 0.4 0.2 300.270 0.4 0.2 476.181 498.383 520.788 520.796 Intens. [a.u.] 0.0 x10 4 1.0 0.8 0.6 300.446 Intens. [a.u.] 0.0 x10 4 1.0 0.8 0.6 300.446 ceppo2b 0:D4 MS R aw MBL + EDTA 0.4 0.4 0.2 0.2 476.150 498.477 520.797 Intens. [a.u.] 0.0 x10 4 1.0 0.8 0.0 x10 4 ceppo3b 0:H4 MS R aw 0.6 0.4.u.] 0.2 0.0 x10 4 MixB 0 :D 2 MS R a w
Antibiogramma diretto: Staphylococcus aureus Isolato resistente alla meticillina (MRSA)
Antibiogramma diretto: Escherichia coli Isolato produttore di ESBL (CTX-M-15)
Escherichia coli produttore di ESBL < 10% 10-15% 16-20% > 20% Tot. isolati: 1278 Tot. testati: 555 ESBL-pos.: 15.1% STUDIO OASIS
Klebsiella pneumoniae produttore di ESBL < 10% 10-30% 31-50% > 50% Tot. isolati: 552 Tot. testati: 258 ESBL-pos.: 26.7% STUDIO OASIS
Proteus mirabilis produttore di ESBL < 15% 15-30% 31-50% > 50% Tot. isolati: 204 Tot. testati: 152 ESBL-pos.: 32.2% STUDIO OASIS
Enterobatteri e beta-lattamici I breakpoint per cefalosporine ed aztreonam sono in grado di rilevare tutti i meccanismi di resistenza clinicamente importanti (incluse ESBL e AmpC mediate da plasmidi). Alcuni isolati produttori di beta-lattamasi sono sensibili o intermedi alle cefalosporine di 3 o 4 generazione con questi breakpoints e dovrebbero essere riportati SENZA MODIFICARE LA CATEGORIA INTERPRETATIVA In molte aree, la rilevazione e la caratterizzazione delle ESBL è raccomandata o obbligatoria per scopi di controllo delle infezioni.
E consigliabile continuare a ricercare la produzione di ESBL con i metodi convenzionali o con i sistemi automatici in tutti gli isolati di enterobatteri clinicamente significativi In caso di positività del test, l interpretazione categorica della sensibilità alle cefalosporine a spettro esteso non sarà modificata ma si raccomanda di segnalare nel referto, mediante apposita nota esplicativa, la presenza del meccanismo di resistenza e le possibili implicazioni cliniche ed epidemiologiche
Antibiogramma diretto: Klebsiella pneumoniae Isolato produttore di carbapenemasi (KPC)
Il laboratorio deve comunicare tempestivamente al reparto il sospetto di presenza di batteri produttori di carbapenemasi in modo da consentire l instaurarsi di misure di isolamento da contatto Il paziente infetto va collocato in una stanza singola Se la stanza singola non fosse disponibile, andrà individuata un area delimitata all interno di una stanza In caso di più pazienti infetti è possibile effettuare l isolamento per coorte
Enterobatteri e carbapenemi I breakpoint per i carbapenemi sono in grado di rilevare tutti i meccanismi di resistenza clinicamente importanti (inclusa la maggior parte delle carbapenemasi). Alcuni isolati produttori di carbapenemasi sono sensibili con questi breakpoints e dovrebbero essere riportati SENZA MODIFICARE LA CATEGORIA INTERPRETATIVA In molte aree, la rilevazione e la caratterizzazione delle carbapenemasi è raccomandata o obbligatoria per scopi di controllo delle infezioni.
Klebsiella pneumoniae resistente ai carbapenemi 2009 2010 2% 52% 15.2% 49% Rimini, Pavia, 98 novembre febbraio 2013 2011
Klebsiella pneumoniae resistente ai carbapenemi EARS-NET 2011 Italia: 26.7% Figura 4.12
Comitato di Studio per gli Antimicrobici Studio carbapenemasi 25 Centri (2011) Coordinatori: F. Luzzaro L. Pagani G.M. Rossolini Maggio Giugno 2011 Resistenza ai carbapenemi confermata mediante test fenotipici e molecolari in 270 enterobatteri isolati in 23/25 Centri ospedalieri
Enterobatteri resistenti ai carbapenemi (Totale isolati, n=270/13749) 86.7% K. pneumoniae 5.6% E. cloacae 2.2% 1.9% 1.9% 0.7% K. pneumoniae E. cloacae E. aerogenes E. coli S. marcescens H. alvei C. freundii K. oxytoca P. mirabilis Sorveglianza nazionale 2011
Meccanismi di resistenza ai carbapenemi in Klebsiella pneumoniae (n=234) 87.2% KPC-type 6.8% MBL 1.7% 4.3% KPC MBL Perdita di porine OXA-48 Sorveglianza nazionale 2011
KPC MBL Isolati di Klebsiella pneumoniae produttore di KPC in 21/25 Centri Isolati di Klebsiella pneumoniae produttore di MBL in 6/25 Centri Sorveglianza nazionale 2011
Klebsiella pneumoniae produttore di KPC (n=204) 21.2% 38.2% Area chirurgica Area critica 32% Area medica Ambulatorio Area medica Area critica RSA Area chirurgica Area riabilitativa 2.9% 2.9% 2.9% Sorveglianza nazionale 2011
Emocolture: algoritmo operativo EMOCOLTURA GRAM ISOLAMENTO IDENTIFICAZIONE E ANTIBIOGRAMMA 24-48 h 18-24 h 18-24 h TERAPIA EMPIRICA TERAPIA MIRATA TERAPIA OTTIMALE
Grazie per l attenzione! Francesco Luzzaro Laboratorio di Microbiologia e Virologia Azienda Ospedaliera della Provincia di Lecco