Donatella Nava Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Mezzogiorno
Definizione La citrometria a flusso è un metodo di conteggio, ed eventualmente di selezione e isolamento, di elementi corpuscolati (cellule) che, dopo essere state marcate con un colorante,vengono fatti passare singolarmente attraverso un sistema ottico di rilevazione a flusso laminare e quindi conteggiate. Per utilizzare la citometria nella ricerca di target non corpuscolati, quali gli allergeni, è necessario farli adsorbire a strutture cromaticamente inerti, aventi dimensioni assimilabili a quelle di una cellula (microsfere in lattice).
Principio di funzionamento della citometria a flusso 1) Le cellule di una popolazione eterogenea vengono aspirate dalla provetta e immesse in una camera di flusso dove vengono separate le une dalla altre. 2) Ogni singola cellula viene poi attraversata da un fascio di luce che eccita i fluorocromi e determina l emissione di un segnale Fluorescente 3) Il segnale passando attraverso un sistema di filtri e specchi raggiunge un rivelatore. 4) Viene quindi processato elettronicamente, trasformato da analogico a digitale e inviato all analizzatore, che elabora il dato e lo visualizza tramite un grafico. 5) Attraverso piastre di deflessione le cellule analizzate possono essere raccolte separatamente tramite un processo definito sorting.
In seguito alla riorganizzazione dell Istituto, non è stato possibile esaminare i campioni nei nostri laboratori. L analisi è stata effettuata dal laboratorio di immunologia della facoltà di Agraria di Portici.
E stato utilizzato un FACScan flow cytometer (Becton Dickinson USA)
L analisi è stata eseguita seguendo il protocollo messo a punto nel laboratorio per la ricerca della gliadina
Diagramma di flusso Estrazione in etanolo Diluizione estratto Adsorbimento sulle microsfere Aggiunta anticorpi anti target Incubazione con anticorpi anti IgG di ratto marcati Lettura al citofluorimetro
L approccio diagnostico è basato sull utilizzo di particelle in latex di 3 µm (Polysciences, Warrington, PA, USA) trattate con 1 ml di estratto in etanolo (60%) del campione in esame. Quindi lavate 2 volte in PBS e trattate con soluzione di arresto (Kirkegaard & Perry Laboratory). Le microsfere venivano incubate in successione con anticorpi di ratto (1:50 PBS) verso i target ricercati (anti b- lattoglobulina o anti ovoalbumina) (Sigma-Aldrich) specifici verso l antigene, quindi con anticorpi anti IgG di ratto marcati con isotiocianato (RαG - FITC) (Sigma-Aldrich) diluito 1:600 in PBS
L indagine è stata eseguita esclusivamente sui campioni di biscotti e polpette di carne inviati al laboratorio per l esecuzione dei test immunoenzimatici. Alcuni campioni non sono stati sottoposti all analisi citofluorimetrica in quanto utilizzati interamente per i saggi ELISA.
La titolazione è stata effettuata diluendo β- lattoglobulina e ovoalbumina (Sigma-Aldrich) in PBS
Come controllo negativo si è utilizzato un campione nel quale gli anticorpi marcati erano sostituiti con PBS Le indagini sono state eseguite separatamente per la ricerca di lattoglobulina e ovolabumina.
OVOALBUMINE - BISCOTTI ELISA Test Cf analysis ppm First replicate (ppm) Sec. replicate (ppm) Third replicate (ppm) mean SD 0 0 0 0 0 0 5 NE NE NE NE NE 15 18,28456 13,65489 21,98547 17,97497333 4,173909883 30 35,25647 31,25658 39,32654 35,27986333 4,035030859 60 65,21455 68,29865 61,25455 64,92258333 3,531114499
OVOALBUMINE - BISCOTTI Biscuits 80 60 40 20 0 L0 L1 L2 L3 L4 Samples ELISA test Citofluorimetric analysis
POLPETTE - LATTE ELISA Test Cf analysis ppm First replicate (ppm) Second replicate (ppm) Third replicate (ppm) mean SD 0 0 0 0 0 0 1 NE NE NE NE NE 3 8,26599 5,32221 9,36598 7,651393333 4,173909883 6 10,25648 13,23254 8,23658 10,5752 4,035030859 12 14,14897 12,65984 15,25885 14,02255333 3,531114499
POLPETTE - LATTE Meat 20 15 10 5 0 L0 L1 L2 L3 L4 Samples ELISA test Citofluorimetric analysis
CONCLUSIONI La citometria a flusso sembra più sensibile dell ELISA, anche se il divario rilevato con il test immunoenzimatico in relazione alla ricerca delle ovoalbumine, pone il dubbio di una possibile tendenza alla sovrastima dell analisi citofluorimetrica. Ha però il limite di prevedere protocolli più sofisticati e dispendiosi che non ne giustificano l impiego nella routine diagnostica. In questo lavoro sono stati posti i preliminari per una futura applicazione della citofluorimetria nella ricerca degli allergeni in diagnostica
I campioni sono stati omogeneizzati (2 min in un omogeneizzatore a lame ) e quindi trattati con etanolo. Come controllo positivo sono stati allestiti campioni (1 mg) di carne e sfarinati, uova-latte free, contaminati con l aggiunta di latte e uova (da 1 a 10-3 ppm), sono stati utilizzati e trattati per l estrazione come sopra descritto. Particelle in latex (10 5 ) con un diametro di 3 micron (Polysciences) sono state incubate overnight con 1 ml di proteine standard di uovo o latte (Sigma-Aldrich), quindi cimentate con 1 ml di estratto ottenuto come sopra descritto.