AGRICOLA TRE VALLI SOTTOPRODOTTI DELL INDUSTRIA DELLE CARNI: COSTO O RISORSA? 10 dicembre 2009 Centro Residenziale Universitario di Bertinoro Aspetti del controllo degli idrolizzati proteici e della farina di piume: la sicurezza microbiologica e la digeribilità Luigi Sperati Ruffoni, Elisa Bertoletti, Graziano Muzzolon
AGRICOLA TRE VALLI: I CONTROLLI FUNZIONALI Messa a punto di un metodo per studiare l efficacia di prodotti antiossidanti nella carne, il più possibile correlato alla prova organolettica Valutazione e sviluppo di metodi per valutare la digeribilità delle farine di penna Elisa Bertoletti Emanuele Nalin Paolo Gelmini Valentina Gola Graziano Muzzolon
AGRICOLA TRE VALLI: I CONTROLLI PER LA SICUREZZA Individuazione dei criteri microbiologici per FAP ed FPH Ricerca di metodi di prova per il controllo dei prodotti Loro automazione Elaborazione di un protocollo PCR per l identificazione di specie animale nei prodotti (solo avicolo) Davide Giovanardi Patrizia Pesente Luigi Sperati Ruffoni
FAP (Functional Animal Proteins) SCELTA DEI CRITERI MICROBIOLOGICI (Reg 2073/2005) BATTERIO CRITERI MICROBIOLOGICI METODO ISO Listeria monocytogenes < or = 100 cfu/g ISO 11290-2 Salmonella Assenza in 25 g ISO 6579 Conta mesofila totale 50.000cfu/g ISO 4833 Escherichia coli m = 50 cfu/g M = 500 cfu/g n = 5; c = 2 ISO 16649-2 n = numero di unità che costituiscono il campione M = massimo valore tollerato c = numero di unità campionarie i cui valori si situano tra m e M
FARINA DI PENNE: SCELTA DEI CRITERI MICROBIOLOGICI (1774/2002 1069/2009) BATTERIO LIMITI METODI ISO Salmonella Assenza in 25 g ISO 6579 n = 5 C = 0 M = 0 Enterobacteriaceae n = 5 C = 2 m = 10 M = 300 in 1 g ISO 21528-2
SALMONELLA: scelta dei metodi da utilizzare Metodi testati Vantaggi del protocollo Svantaggi Risultati della prova (colonie pure, flora batterica mista, prove di campo) ISO 6579:2002 Corr.2004 Metodo ufficiale proposto dal Regolamento 2073/2005 Lungo Salmonella ISO Equivalente Metodo facile e veloce (48gg), ISO equivalente, tecnologia classica Metodo relativamente nuovo Risultati equivalenti a quelli ottenuti con la ISO 6479 PCR Salmonella (diverse PCR, real time, metodi di estrazione) Metodo veloce Sensibilità alta Metodo ISO equivalente Costoso, necessita di personale addestrato, identifica batteri morti e vivi Positività con PCR, negative con ISO 6579: alta sensibilità? Amplificazione di batteri morti? Crosscontaminazione?
SALMONELLA: metodi testati Metodi testati Vantaggi del protocollo Svantaggi Risultati della prova (colonie pure, flora batterica mista, prove di campo) ISO 6579:2002 Corr.2004 Metodo ufficiale proposto dal Regolamento 2073/2005 Lungo (minimo 4 giorni) Salmonella ISO Equivalente Metodo facile e veloce (48gg), ISO equivalente, tecnologia classica Metodo relativamente nuovo Risultati equivalenti a quelli ottenuti con la ISO 6479 PCR Salmonella (diverse PCR, real time, metodi di estrazione) Metodo veloce Sensibilità alta Metodo ISO equivalente Costoso, necessita di personale addestrato, identifica batteri morti e vivi Positività con PCR, negative con ISO 6579: alta sensibilità? Amplificazione di batteri morti? Crosscontaminazione?
SALMONELLA: metodi testati Metodi testati Vantaggi del protocollo Svantaggi Risultati della prova (colonie pure, flora batterica mista, prove di campo) ISO 6579:2002 Corr.2004 Metodo ufficiale proposto dal Regolamento 2073/2005 Lungo (minimo 4 giorni) Salmonella ISO Equivalente Metodo facile e veloce (48gg), ISO equivalente, tecnologia classica Metodo relativamente nuovo Risultati equivalenti a quelli ottenuti con la ISO 6479 PCR Salmonella (diverse PCR, real time, metodi di estrazione) Metodo veloce Sensibilità alta Metodo ISO equivalente Costoso, necessita di personale addestrato, identifica batteri morti e vivi Positività con PCR, negative con ISO 6579: alta sensibilità? Amplificazione di batteri morti? Crosscontaminazione?
SALMONELLA: metodi testati Metodi testati Vantaggi del protocollo Svantaggi Risultati della prova (colonie pure, flora batterica mista, prove di campo) ISO 6579:2002 Corr.2004 Metodo ufficiale proposto dal Regolamento 2073/2005 Lungo (minimo 4 giorni) Salmonella ISO Equivalente Metodo facile e veloce (48gg), ISO equivalente, tecnologia classica Metodo relativamente nuovo Risultati equivalenti a quelli ottenuti con la ISO 6479 PCR Salmonella (diverse PCR, real time, metodi di estrazione) Metodo veloce Sensibilità alta Metodo ISO equivalente Costoso, necessita di personale addestrato, identifica batteri morti e vivi Positività con PCR, negative con ISO 6579: alta sensibilità? Amplificazione di batteri morti? Crosscontaminazione?
SALMONELLA: metodi testati Metodi testati Vantaggi del protocollo Svantaggi Risultati della prova (colonie pure, flora batterica mista, prove di campo) ISO 6579:2002 Corr.2004 Metodo ufficiale proposto dal Regolamento 2073/2005 Lungo (minimo 4 giorni) Salmonella ISO Equivalente Metodo facile e veloce (48gg), ISO equivalente, tecnologia classica Metodo relativamente nuovo Risultati equivalenti a quelli ottenuti con la ISO 6479 PCR Salmonella (diverse PCR, real time, metodi di estrazione) Metodo veloce Sensibilità alta Metodo ISO equivalente Costoso, necessita di personale addestrato, identifica batteri morti e vivi Positività con PCR, negative con ISO 6579: alta sensibilità? Amplificazione di batteri morti? Crosscontaminazione?
Conta Listeria monocytogenes: metodi testati Metodi testati Vantaggi Svantaggi Risultati test (su colonie pure, colonie miste, studi interlaboratorio) ISO 11290-21998 Amd1:2004 Metodo ufficiale EEC Lungo (5-6 day) Ottimo isolamento e discriminazione Salmonella ISO equivalente metodo A Veloce (2 gg) ISO equivalente Non ISO Più selettivo ma meno sensibile? Salmonella ISO equivalente metodo B Veloce (2 gg) ISO equivalente In vendita solamente in piastra Può non essere utilizzabile con apparecchiature automatiche
Conta Listeria monocytogenes: metodi testati Metodi testati Vantaggi Svantaggi Risultati test (su colonie pure, colonie miste, studi interlaboratorio) ISO 11290-21998 Amd1:2004 Metodo ufficiale EEC Lungo (5-6 day) Ottimo isolamento e discriminazione Salmonella ISO equivalente metodo A Veloce (2 gg) ISO equivalente Non ISO Più selettivo ma meno sensibile? Salmonella ISO equivalente metodo B Veloce (2 gg) ISO equivalente In vendita solamente in piastra Può non essere utilizzabile con apparecchiature automatiche
Conta Listeria monocytogenes: metodi testati Metodi testati Vantaggi Svantaggi Risultati test (su colonie pure, colonie miste, studi interlaboratorio) ISO 11290-21998 Amd1:2004 Metodo ufficiale EEC Lungo (5-6 day) Ottimo isolamento e discriminazione Salmonella ISO equivalente metodo A Veloce (2 gg) ISO equivalente Non ISO Più selettivo ma meno sensibile? Salmonella ISO equivalente metodo B Veloce (2 gg) ISO equivalente In vendita solamente in piastra Può non essere utilizzabile con apparecchiature automatiche
Conta Listeria monocytogenes: metodi testati Metodi testati Vantaggi Svantaggi Risultati test (su colonie pure, colonie miste, studi interlaboratorio) ISO 11290-21998 Amd1:2004 Metodo ufficiale EEC Lungo (5-6 day) Ottimo isolamento e discriminazione Salmonella ISO equivalente metodo A Veloce (2 gg) ISO equivalente Non ISO Più selettivo ma meno sensibile? Salmonella ISO Equivalente metodo B Veloce (2 gg) ISO equivalente In vendita solamente in piastra Può non essere utilizzabile con apparecchiature automatiche
Sistema automatico per l analisi microbiologica quantitativa
Produzione di pollo e di penna Produzione di pollo (Numero di animali) Italia 478.708.000 EU 25 5.713.109.000 Mondiale 17.836.376.000 Farina di penne (Kg) Italia 31.116.000 EU 25 371.150.000 Mondiale 1.160.000.000
Opportunità per la farina di penne ad alta digeribilità Pet food produzione mondiale 22 milionidi tonnellate Acquacultura Il consumo globale tra 1973 e 2003 si è raddoppiato AD OGGI: > 1.3 milioni di tonnellate di pesce; 760,000 tonnellate di crostacei
LA FARINA DI PIUME Farina di piume: buona fonte proteica per alimentazione animale per il suo elevato contenuto di proteine (80 90%). Contiene cisteina, glicina arginina e fenilalanina Le piume, tuttavia, sono poco digerite dai non ruminanti per il loro alto contenuto di cheratina, proteina caratterizzata dai numerosi ponti disolfuro della cisteina Tale struttura deve essere idrolizzata per distruggere i legami S-S in modo da permettere agli enzimi proteolitici di attaccare i legami peptidici della proteina. In tal modo si aumenta la digeribilità della farina di piume. L idrolisi dei legami S-S si ottiene agendo su temperatura, pressione, aggiunta di acidi o basi, aggiunta di enzimi. La riuscita del trattamento si misura attraverso la determinazione della digeribilità.
METODI PER DETERMINARE LA DIGERIBILITA METODI IN VIVO : dispendiosi in termini di tempo e denaro, invasiva per l animale. METODI IN VITRO : simulano la digestione ileale e\o fecale; i più usati sono i METODI PER FILTRAZIONE enzima Farina di piume Tempo e temperatura controllati Soluzione di acido o base Termostato o bagnomaria Filtrazione
METODI UFFICIALI Attualmente non esiste un metodo per filtrazione universalmente accettato, né esistono campioni di riferimento certificati a digeribilità nota. Tra i metodi per filtrazione i più diffusi sono quelli pepsinici, in questa classe i due metodi riconosciuti come ufficiali sono: AOAC (Association of Official Analytical Chemists) 971.09 Pepsin Digestibility of Animal Protein Feeds ISO (International Organization for Standardization) 6655 Animal feeding stuffs Determination of soluble nitrogen content after treatment with pepsin in dilute hydrochloric acid
METODI ISO E AOAC Metodo ISO 6655 Metodo AOAC 971.09 Parametri fissati Parametri fissati Farina di piume: 2,0 gr (macinazione e setaccio 20) Farina di piume: 0,5 gr (macinazione e setaccio 20) Pepsina (1:12500): 0,09 gr in 450 ml di HCl 0,075 N Pepsina (1:10000): 0,3 gr in 150 ml di HCl 0,075 N Temperatura: 40 C Temperatura: 45 C Tempo incubazione: 48 ore Tempo incubazione: 16 ore Agitazione: manuale ogni 8 ore Agitazione: meccanica e continua ph: < 1,7 ph: / Ogni variazione nei parametri fissati porta ad una variazione nel risultato della digeribilità
VALIDAZIONE Validazione Metodo ISO Farina Generica ISO 6655 requisiti richiesti Laboratorio Tre Valli Risultati Farina Generica Laboratorio Tre valli Risultati Proteine Solubili % 57,43 40,91 Digeribilità% 52,30 SD % 0,78 0,52 SD % 0,61 CV % 1,40 1,28 CV % 1,16 Ripetibilità % 2,21 1,74 Ripetibilità % 2,03 Riproducibilità % 16,63 Validazione Metodo AOAC Farina Generica Laboratorio Tre Valli Risultati Farina Generica Laboratorio Tre Valli Risultati Soluble Crude Protein % 54,55 Digestibility% 64,77 Standard Deviation %r 0,83 Standard Deviation %r 0,98 Coefficient of variation %(CV) 1,51 Coefficient of variation %(CV) 1,51 Repeatability limit ( r ) % 2,64 Repeatability limit ( r ) % 3,14
Analisi Farine PROSPARE: armonizzazione metodi con partner russi Campione Risultato Digeribilità % Laboratorio Tre Valli Metodo Risultato Digeribilità% Partner Russi (AOAC) F/22/09/09-5L F/26/08/09-4L F/09/04/09-2L F/10/10/08-3L 91,32 ISO 6655 93,11 AOAC 85,86 ISO 6655 91,80 AOAC 91,83 ISO 6655 95,10 AOAC 80,40 ISO 6655 89,79 AOAC 93,71 89,17 91,3 80,6 47,05 ISO 6655 F/12/02/09-1L 55,6 57,05 AOAC 44,48 ISO 6655 FARINA GENERICA / 50,23 AOAC
RIPRODUCIBILITA PROVE CONFRONTO CON LABORATORI ESTERNI farina Laboratorio Digeribilità % Metodo farina Laboratorio Digeribilità % Metodo farina Laboratorio Digeribilità % Metodo TRE VALLI 45,76 ISO 6655 sul filtro TRE VALLI 47,05 ISO 6655 sul filtro TRE VALLI 91,32 ISO 6655 sul filtro TRE VALLI 55,50 AOAC TRE VALLI 57,05 AOAC TRE VALLI 93,11 AOAC FARINA GENERICA ISO6655 sul LAB 1 64,48 F/12/02/09 1L ISO6655 sul LAB 1 33,47 F/22/09/09 5L ISO6655 sul LAB 1 96,61 filtrato FARINA filtrato FARINA filtrato PROSPARE PROSPARE POCO MOLTO LAB 2 47,80 ISO 6655 sul filtro LAB 2 41,70 ISO 6655 sul filtro LAB 2 91,80 ISO 6655 sul filtro DIGERIBILE DIGERIBILE LAB 3 60,90 ISO6655 sul filtrato LAB 3 64,10 ISO6655 sul filtrato LAB 3 94,80 ISO6655 sul filtrato LAB 3 74,40 BOISEN LAB 3 67,70 BOISEN LAB 3 94,00 BOISEN Media SD Riproducibilità 58,14 51,85 93,61 10,76 13,36 1,97 39,12 48,55 7,15 FARINA GENERICA FARINA PROSPARE poco digeribile FARINA PROSPARE molto digeribile Digeribilità% 100 95 90 85 80 75 70 65 60 55 50 45 40 35 30 25 20 TRE VALLI ISO TRE VALLI AOAC LAB 1 DIR CE ISO LAB 2 ISO LAB 3 DIR CE ISO LAB 3 BOISEN Digeribilità% 100 95 90 85 80 75 70 65 60 55 50 45 40 35 30 25 20 TRE VALLI ISO TRE VALLI AOAC LAB 1 DIR CE ISO LAB 2 ISO LAB 3 DIR CE ISO LAB 3 BOISEN Digeribilità% 100 95 90 85 80 75 70 65 60 55 50 45 40 35 30 25 20 TRE VALLI ISO TRE VALLI AOAC LAB 1 DIR CE ISO LAB 2 ISO LAB 3 DIR CE ISO LAB 3 BOISEN Laboratorio e metodo Laboratorio e metodo Laboratorio e metodo
VARIABILI DIGERIBILITA' VS CONCENTRAZIONE PEPSINA: CONFRONTO FARINE 100 95 90 85 80 75 DIGERIBILITA' % 70 65 60 55 50 45 40 35 30 25 Campione Metodo Modifiche DIGERIBILITA' % Farina Generica AOAC agitazione 48,92 Farina Generica AOAC agitazione 46,27 Farina Generica Farina Generica AOAC AOAC senza agitazione senza agitazione 37,34 36,76 20 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 1,1 1,2 1,3 1,4 1,5 1,6 1,7 1,8 1,9 2,0 2,1 2,2 2,3 2,4 2,5 2,6 2,7 2,8 2,9 3,0 3,1 3,2 3,3 3,4 3,5 3,6 3,7 3,8 3,9 4,0 CONCENTRAZIONE PEPSINA FARINA RUSSA FARINA GENERICA
CONCLUSIONE Risultati ottenuti: 1. Scelta dei metodi e validazione 2. Studio variabili 3. Confronto risultati tra diversi laboratori 4. Analisi della farina Prospare: DIGERIBILITA > 85% In Futuro: 1. Armonizzazione metodi: proposta di un metodo di riferimento per la matrice farina di piume 2. Divulgazione dei risultati ottenuti