MANIPOLAZIONE GENETICA DEGLI ANIMALI
Perché creare animali transgenici Per studiare la funzione e la regolazione di geni coinvolti in processi biologici complessi come lo sviluppo di un organismo e l insorgenza di malattie Per la produzione di bioreattori, animali in grado di produrre proteine ricombinanti su vasta scala: anticorpi, ormoni, fattori di crescita, citochine e farmaci Animali transgenici più comuni: topo, Drosophila melanogaster, Xenopus laevis. Negli ultimi anni si sta cercando di ottenere anche animali transgenici di allevamento, come polli, maiali, bovini e pecore
Stadi iniziali dello sviluppo embrionale di topo Per ottenere animali transgenici è necessario che tutte le cellule dell organismo, incluse le cellule germinali, contengano il transgene Metodi per la generazione di topi transgenici Microiniezione nel pronucleo Trasfezione delle cellule ES Trasferimento nucleare
Microiniezione nel pronucleo Il DNA viene iniettato nel pronucleo maschile subito dopo la fecondazione. Gli embrioni iniettati vengono coltivati in vitro fino allo stadio di morula e poi impiantati nell utero di topine pseudogravide, precedentemente incrociate con maschi vasectomizzati. Vantaggi: Il DNA esogeno non deve essere necessariamente clonato in un vettore. Frammenti di DNA si integrano nel genoma in maniera casuale e in copie multiple. Svantaggi: La casualità dell evento di integrazione può avere conseguenze notevoli sull espressione del transgene per l effetto di posizione. Produzione solo di transgeni e non di KO L efficienza del metodo è molto variabile (5-40%).
Cellule staminali embrionali Il DNA viene introdotto per trasfezione o trasduzione nelle cellule ES. Dopo selezione, le cellule ES ricombinanti vengono introdotte nel blastocele di un embrione ricevente allo stadio di blastocisti. La progenie risultante sarà chimerica Vantaggi Selezione delle cellule che hanno acquisito il DNA esogeno Utili per il gene targeting, ossia per l integrazione mirata del DNA esogeno nel genoma, poiché sono efficienti nei meccanismi di ricombinazione omologa Produzione di animali KO
Vantaggi della clonazione: 1) Conservazione di specie animali in via d estinzione 2) Scopi terapeutici (xenotrapianti) Svantaggi della metodica: 1) Il processo è molto inefficiente. Nel caso di Dolly soltanto 1 su 277 fusioni cellulari ha dato origine ad una prole 2) Gli animali prodotti con il trasferimento nucleare mostrano anomalie e tendenza a invecchiamento e morte precoce Clonazione per trasferimento nucleare
Mutazione genomica o Gene targeting Sostituzione di un segmento di genoma endogeno con un segmento omologo di DNA esogeno. Utile per Sostituire geni endogeni con copie non funzionali Introdurre piccoli cambiamenti sito-specifici Sostituire copie di geni non funzionali con copie wt (terapia genica)
Gene targeting per ricombinazione omologa Doppia selezione, positiva-negativa Il ganciclovir è un analogo sintetico della 2 deossiguanosina c he, fosforilato dalla timidina-chinasi, inibisce l attività della DNA polimerasi uccidendo le cellule
La ricombinazione sito-specifica specifica La sequenza interposta tra i due siti loxp orientati come ripetizioni dirette viene deleta La sequenza interposta tra i due siti loxp orientati come ripetizioni invertite viene invertita Sito loxp riconosciuto dalla ricombinasi Cre del batteriofago P1. I siti loxp sono sequenze di 34 bp che comprendono due ripetizioni invertite di 13 bp che fiancheggiano un elemento centrale di 8 bp
Knock-out out condizionali mediante la ricombinazione sito-specifica specifica La tecnica del knock-out condizionale permette di studiare negli individui adulti l effetto di mutazioni caratterizzate da un fenotipo embrionale letale
Attivazione genica mediante ricombinazione sito-specifica specifica
Rimozione del marcatore mediante ricombinazione sito-specifica specifica
Le applicazioni della ricombinazione sito-specifica specifica Delezioni sito-specifiche di sequenze del transgene Eliminare il marcatore di selezione Creare animali con KO di tipo condizionale Attivazione sito-specifica dei transgeni Ingegneria cromosomica delezioni cromosomiche traslocazioni inversioni