Metodi di conta microbica esistono differenti metodiche per la determinazione quantitativa dei microrganismi tecniche colturali e non colturali conta diretta ed indiretta il tipo di microrganismo/i ed il tipo di campione possono necessitare di specifiche tecniche
Conta in piastra Si basa sulla produzione di colonie microbiche, a partire da singole cellule, su terreni agarizzati Unità formanti colonia = UFC Le cellule devono essere vive e vitali (viable( cell count) Il terreno deve essere appropriato al tipo di conta Fase critica: preparazione del campione
Preparazione del campione Stato fisico del campione (solido, liquido, ecc.) Prelievo e trasporto del campione (sterilità e tempi) Rappresentatività del campione Uso del mixer o dello stomacher Uso delle diluizioni seriali
diluizioni
diluizioni
Semina in piastra
Conta in piastra Si contano le piastre con 20-200/30 200/30-300300 colonie Si moltiplica il numero delle colonie contare per l inverso del fattore di diluizione Si riporta tutto al ml o g di campione È preferibile operare la semina in doppio o in triplo per aumentare la precisione
Conta in piastra Sistema alternativo: N= ΣC C _ V(n 1 + 0,1n 2 ). d ΣC C = somma delle colonie nelle piastre considerate V = volume dell inoculo seminato n 1 = numero delle piastre considerate, per la prima diluizione n 2 = numero di piastre considerate, per la seconda diluizione d = fattore di diluizione corrispondente alla prima diluizione
esempio Volume inoculo 1,0 ml Prima diluizione 10-2 : 168 e 215 colonie Seconda diluizione 10-3 : 14 e 25 colonie N = 168 + 215 + 14 + 25 = 422 = 19812 1 X [(1x2) + (0,1 x 2)] x 0,01 0,022 19812 = 1,9 x 10 4 UFC/g-ml
Sensibilità della metodica Qual è la concentrazione limite che posso determinare? Se non ho nessuna colonia in piastra, come esprimo il risultato? Quante diluizioni devo fare?
Pregi e difetti Tecnica versatile e relativamente economica Permette di contare le sole cellule vive e vitali Si può selezionare il terreno per contare solo specifici microrganismi Utile per campioni a concentrazione microbica medio- alta Poco sensibile Non tiene conto dei VBNC Richiede molto tempo (almeno 24h)
MPN most probable number Si basa sull utilizzo di terreni liquidi È un metodo statistico Utile per test di conferma e per ricercare specie microbiche in campioni a bassa concentrazione Il più utilizzato è l MPN simmetrico a 3 o 5 serie di provette
MPN Si allestiscono 3 o 5 serie di diluizioni decimali (3-5 5 provette per ciascuna diluizione) Si inocula una aliquota di campione in ciascuna serie di provette Si mette ad incubare in termostato per 24-48 48 ore Si leggono i risultati riportando il numero di provette (per ciascuna diluizione) in cui c è torbidità dovuta alla crescita microbica
MPN Il risultato si confronta con delle tabelle statistiche (Mac( Crady) MPN = N x F Vs V N = valore letto sulla tabella F = fattore di diluizione della serie V = fattore di diluizione base della tabella (1 0,1-0,5) Vs = quantità di riferimento (es. 1ml, 25 g)
MPN 1:10 1:100 3-2-1 = MPN tab. 15 MPN = 15 x 10 x 1 ml = 150 1 1:1000
Membrane filtranti Metodica utilizzata per l analisi delle acque Utile per campioni aventi una carica microbica molto bassa Concentrazione del campione Uso di membrane sterili a porosità inferiore al diametro delle cellule batteriche
Membrane filtranti In questo caso la conta microbica richiede la moltiplicazione del numero di colonie cresciute sulla piastra per il fattore di concentrazione
Conta diretta al microscopio È un sistema di conta diretta rapido Permette di contare le cellule senza doverle coltivare su terreni specifici Non è possibile distinguere cellule vive da cellule morte Non permette di identificare particolari specie microbiche
Misura della resistenza elettrica Il contatore coulter permette di quantificare le cellule misurando il variare della conducibilità elettrica di un fluido in un elettrocapillare al passare delle cellule microbiche. Non distingue cellule vive da morte È molto rapido Può dare informazioni anche sulle dimensioni cellulari
Quantificazione spettrofotometrica Lo spettrofotometro è uno strumento che misura la assorbanza o transmittanza di un fascio di luce che attraversa un campione in soluzione Relazione lineare tra assorbanza e concentrazione di un soluto Densità ottica (1 OD 600nm 8,0 x 10 8 cellule di E. coli)
Misurazione della massa microbica Si può determinare il determinare il peso secco di una soluzione contenente biomassa cellulare Il peso è proporzionale al numero di cellule presenti nel campione Occorre standardizzare per ogni tipologia di microrganismo E una tecnica laboriosa Utile per batteri filamentosi e muffe
Misurazione della massa microbica Si centrifuga il campione cellulare Si sottopone a 2-32 3 lavaggi Si porta a secco in stufa 80-100 C Si misura il peso secco del campione
Metodi chimici Misurare la concentrazione di DNA, RNA, proteine, ATP Misurare la fluorescenza emessa da fluorocromi selettivi (FISH, Baclight live/dead cell) Misurare la quantità di substrato consumata/prodotta nell unità di tempo PCR quantitativa