DEMETRA LIFE. il progetto LIFE+ DEMETRA. Regione Toscana. OGM, Ambiente & Biodiversità

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1 Regione Toscana Sviluppo di uno strumento per il monitoraggio ambientale degli OGM il progetto LIFE+ DEMETRA DEMETRA LIFE OGM, Ambiente & Biodiversità

2 Sviluppo di uno strumento per il monitoraggio ambientale degli OGM il progetto LIFE+ DEMETRA Riferimenti del progetto: Coordinatore del progetto e responsabile scientifico Cristina Vettori CNR-IGV Madonna del Piano Sesto Fiorentino Firenze (Italia) Uff Fax cristina.vettori@cnr.it Project Manager Laura Bartalucci Regione Toscana Via di Novoli, Firenze (Italia) Uff Fax laura.bartalucci@regione.toscana.it Website Coordinamento tecnico Regione Toscana: Alvaro Fruttuosi, Marco Sulas, Simonetta Demuro, Laura Bartalucci CNR-IGV: Cristina Vettori Revisione giornalistica a cura di Lucia Lunghini Dorado Communication Firenze Hanno collaborato i partner di progetto: CNR-IGV: Cristina Vettori, Anna Buonamici, Catia Boggi, Valeria Tomaselli, Giambattista Polignano, Pasquale Cataldo, Francesca Donnarumma, Elena Balducci, Enrico Casalone (DIBE - UNIFI), Stefano Biricolti (DIPSA - UNIFI) CNR-ISE: Lorenzo Chelazzi, Isabella Colombini, Mario Fallaci CNR-IBIMET: Alessandro Materassi, Gianni Fasano DEISTAF-UNIFI: Davide Travaglini, Donatella Paffetti, Francesca Bottalico, Silvia Fiorentini, Susanna Nocentini PARCO REGIONALE SAN ROSSORE MASSACIUCCOLI: Antonio Perfetti, Olga Mastroianni REGIONE TOSCANA: Fabio Boscaleri, Laura Bartalucci, Alvaro Fruttuosi, Marco Sulas, Simonetta Demuro, Filippo Cimò e Giuliana Senatore Foto: archivio fotografico LIFE-DEMETRA Grafica e impaginazione Centro stampa Giunta Regione Toscana Marzo 2012

3 Introduzione Definire una metodologia innovativa di valutazione del rischio ambientale delle colture transgeniche ai fini di monitorare gli effetti sugli ecosistemi naturali. E questo l obiettivo principale del progetto DEMETRA che svilupperà un indice sintetico di monitoraggio, il Quick Monitor Index (QMI), capace di determinare in modo previsionale l impatto potenziale delle colture transgeniche sugli ecosistemi e, quindi, restituire indicazioni preziose per definire le modalità operative di monitoraggio ambientale. Si tratta di un progetto innovativo attivato in Toscana e unico nel panorama europeo. Ad oggi non esiste una metodologia standard riconosciuta a livello comunitario per il monitoraggio degli effetti degli OGM nell ambiente. Il progetto DE- METRA ha l obiettivo di colmare tale lacuna. Nel 2008, con il programma comunitario LIFE+, si è creata l opportunità di presentare delle idee progettuali per approfondire la tematica legata alla valutazione del rischio OGM, attraverso il finanziamento di approcci innovativi al monitoraggio. La Regione Toscana ha colto tale opportunità presentando un progetto della durata di tre anni ( ) per contribuire alla definizione di strumenti standardizzati di monitoraggio ambientale degli OGM e contemporaneamente rispondendo alle esigenze di tutela del proprio territorio dai rischi delle coltivazioni transgeniche. Lo studio infatti ha anche lo scopo di fornire indicazioni utili alla Regione per poter effettuare un monitoraggio efficace ed efficiente a tutela del proprio territorio. Il progetto di ricerca non prevede l impiego di organismi transgenici, e la metodologia adottata si basa sull analisi dettagliata degli ecosistemi e delle risorse ambientali dell area scelta. Lo studio applica su quest area una matrice di rischio collegata alle piante transgeniche esistenti a livello internazionale potenzialmente coltivabili e utilizza i dati bibliografici, i parametri ecologici e biologici raccolti.

4 Poster 1 Sintesi del Poster Il progetto DEMETRA La ricerca è condotta nel Parco Regionale di Migliarino San Rossore e Massaciuccoli, dove sono state identificate tre differenti aree di studio. Area di studio 1 Zona lago di Massaciuccoli Questa area di studio denominata Lago e Padule di Massaciuccoli ricopre una superfi cie complessiva di 1.908,01 ettari. Il lago e l area palustre circostante costituiscono una delle zone umide pianeggianti più importanti d Italia. E un vasto specchio d acqua dolce, circondato da formazioni elofi tiche, in particolare canneti e cladieti, torbiere e vegetazione igrofi la, tutte specie che hanno l apparato radicale costantemente immerso nell acqua. L area è, inoltre, caratterizzata da sporadici arbusteti, dovuti a stadi seriali avanzati di interramento, e specchi d acqua profondi, originati dall estrazione della sabbia. Il Lago di Massaciuccoli è Zona a Protezione Speciale, in quanto posta lungo le rotte di migrazione della fauna aviaria, e anche di sosta per alcune specie come le forapaglie castagnolo e le morette tabaccate. Sono inoltre presenti tarabusi, falchi di palude e aironi rossi. L area circostante il lago, in particolare quella meridionale, è caratterizzata da un agricoltura orientata prevalentemente verso le colture erbacee di pieno campo: mais, frumento tenero, girasole per primi. Nella zona ci sono anche colture ortive. Una delle aree di studio si trova presso il Fiume Serchio ed è costituita da un tratto di foresta a prevalenza di pioppo e da aree non coltivate. La zona è caratterizzata da prati-pascoli e medicaio, per cui il suolo resta coperto da vegetazione tutto l anno. L altra area, situata in prossimità del Fiume Arno, è caratterizzata da superfi ci destinate alla coltivazione agricola, da boschi misti di latifoglie, pinete e zone umide. L area agricola presenta un alta percentuale di seminativi annuali a ciclo autunno-vernino con la gran parte del suolo scoperto da luglio a novembre. Attività Nelle aree di studio vengono rilevati dati relativi a: Condizioni meteorologiche (pioggia, umidità e temperatura dell aria e del suolo, direzione ed intensità del vento, radiazione solare globale e diffusa, eliofania). Allo scopo sono state installate stazioni meteorologiche: tre fi sse del progetto DEMETRA ed una mobile della Regione Toscana; Biodiversità mediante la quantificazione delle specie microbiche, vegetali e animali presenti e lo studio delle loro relazioni a livello di catena trofica e di ecosistema tramite l uso degli isotopi stabili; Diffusione del polline delle specie vegetali studiate (mais, girasole, colza e pioppo), mediante la cattura del polline tramite trappole polliniche o dagli impollinatori e con successive analisi di laboratorio. Area di studio 2 (Zona fiume Serchio) e Area di studio 3 (Zona fiume Arno) Le due aree sono caratterizzate da una superfi cie di 9.658,34 ettari. La tipologia ambientale prevalente è quella di un sistema interno di dune e interdune fossili con alternanza di pinete a pino marittimo e pino domestico, lecci, macchia alta, aree umide salmastre e vasti boschi. Le coste sabbiose sono caratterizzate dalla tipica vegetazione dunale. Le aree umide interne si caratterizzano per la presenza di diverse essenze arboree ed erbacee. Gli ecosistemi dunali e le aree umide retrodunali ospitano particolari habitat e rare specie di fl ora. Le zone umide rivestono importanza nazionale e internazionale per lo svernamento di uccelli acquatici e costituiscono una fondamentale area di sosta per i migratori lungo la rotta della costa tirrenica.

5 maize sunflower maize sunflower maize Poster - Boscaleri F. et al. Presentato al 54th Italian Society of Agricultural Genetics Annual Congress, Matera, Italy 27/30 September, 2010 DEvelopment of a quick Monitoring index as a tool to assess Environmental impacts of TRAnsgenic crops The LIFE+ programme is the EU s funding instrument to promote implementation, updating and development of EU environmental policy and legislation. The Nature & Biodiversity LIFE+ co-finances innovative or demonstrative projects that contribute to the attainment of the european objective of arresting biodiversity loss. THE PROJECT DEVELOPMENT OF A QUICK MONITORING INDEX AS A TOOL TO ASSESS ENVIRONMENTAL IMPACTS OF TRANSGENIC CROPS: THE LIFE+ DEMETRA PROJECT BOSCALERI F. 1, PERFETTI A. 2, RUSSU R. 3, TRAVAGLINI D. 4, VETTORI C. 5 1) DG Competitività del sistema regionale e sviluppo delle competenze, Regione Toscana, Via di Novoli 26, Firenze (Italy) 2) Regional Park of Migliarino San Rossore Massaciuccoli, Loc. Cascine Vecchie, Pisa (Italy) 3) Regional Agency for the Development and Innovation in the Agricultural and forestry sector (ARSIA Toscana), via Pietrapiana 30, Firenze (Italy) 4) Department of Agricultural and Forest Economics, Engineering, Sciences and Technologies, University of Florence, Via San Bonaventura 13, Firenze (Italy) 5) Institute of Plant Genetics CNR, UOS Firenze, Via Madonna del Piano 10, Sesto Fiorentino (Italy) The project aims to develop a quick monitoring index (QMI) to establish a monitoring network to rapidly assess the potential risk generated by a selected range of transgenic crops in well determined ecosystems or biotopes. The study is based on a detailed analysis of the different ecosystem components through correlations of environmental data with transgenic crops without the use of genetically modified organisms (GMO). THE STUDY The study is carried out in the Migliarino San Rossore Massaciuccoli Regional Park (North Tuscany, Italy), and three different ecosystems are analysed: Agricultural ecosystem Forest ecosystem Wetland Area Different varieties of maize, sunflower and oilseed rape, identified by known molecular markers, are cropped. Cultivations will be repeated for three consequent years so as to obtain information on: a) the mechanisms of pollen dispersal of the different species; b) the biodiversity in association to the crops; c) the trophic pathways at ecosystem level. Permanent and specific study sites (mixed and natural poplar forests, and non cultivated areas) were identified bordering cropped fields. Here the aim is to assess: a) the influence of pollen flow on plants present in the site; b) the biodiversity in the site; c) the influence of pollen flow of cultivated poplar on natural populations given their presence in the site. In Migliarino S. Rossore Massaciuccoli Regional Park there are extensive wetland areas directly bordering cropped zone characterised by high levels of biodiversity. Permanent study sites were identified to assess: a) the influence of pollen flow on plants present in the site; b) the biodiversity of the site; c) the trophic pathways at ecosystem level. ACTIVITIES In each study area the following data are assessed: a) meteorological conditions (rainfall, air temperature and humidity, wind speed and direction, diffused and global radiation, sunshine duration). To this aim three weather stations were placed (figure 1); b) biodiversity (figure 2 and 3) through the quantification of microbial, plant and animal species and through the study of trophic webs using stable isotope analysis ( 13 Cand 15 N); c) pollen flows of the study plant species (maize, sunflower, oilseed rape and poplar) with pollen samples collected by pollinators (figure 4) and by pollen traps (figure 5), and consequent laboratory analysis by molecular markers (figure 6). Figure 2 Collection of insects on sunflowers Figure 3 Sorting of collected samples Figure 4 Pollinator Figure 5 Pollen trap Figure 6 Laboratory of molecular analysis Figure 1 Meteorological station Data are elaborated and used to define the Quick monitoring index (QMI) that will be applied within a Geographical Information System (GIS). Map of the project study area. 1. Wetland area of Massaciuccoli lake; 2. Natural poplar forests and non cultivated areas; 3. Mixed and pine forests, wetlands, cropped area. Partnership: with the collaboration of:

6 Poster 2 Sintesi del Poster Il trasporto pollinico Il trasporto pollinico è un fenomeno condizionato da vari fattori tra i quali assumono particolare importanza le condizioni meteorologiche presenti durante il periodo di emissione del polline. Al fi ne di valutare le potenzialità di trasporto del polline delle specie esaminate dal progetto, in ciascuna delle tre aree di studio è stata installata una stazione meteorologica per raccogliere dati sulle principali variabili meteorologiche. Le stazioni differiscono tra loro nel numero di parametri misurati. In particolare, nell area in cui vengono eseguite le coltivazioni e nell area caratterizzata dalla presenza del pioppo, la misura del vento viene effettuata a tre quote (2.5, 5 e 10 m). Tutti i parametri vengono acquisiti ogni minuto e ogni 15 minuti viene memorizzata la media dei valori rilevati per ciascun parametro. Inoltre, con frequenza giornaliera i dati memorizzati sono trasmessi ad una banca dati centrale attraverso un collegamento GPRS. Contemporaneamente alla raccolta dei dati meteo, durante il periodo di produzione di polline viene eseguita la cattura del polline delle specie analizzate per mezzo di trappole polliniche, installate a diverse distanze rispetto alle zone di coltivazione tenendo conto del vento dominante. Dall inizio del progetto sono state installate in tutto 66 trappole polliniche: 16 nel 2010 e 50 nel Ciascuna trappola è dotata di un nastro adesivo sul quale si deposita il polline trasportato dal vento. Il nastro viene rimosso dalle trappole al termine del periodo di emissione del polline e il campione raccolto viene analizzato in laboratorio tramite un indagine microscopica. Contestualmente vengono condotti studi sul trasporto pollinico anche per via entomofi la, impollinazione dovuta agli insetti, per meglio valutare la distanza a cui possono arrivare i pollini. Quando ritenuto necessario, viene eseguito anche un controllo tramite marcatori molecolari per verifi care se il polline catturato, tramite le trappole o gli insetti, appartiene alle specie studiate nel progetto. L analisi combinata dei dati misurati con le stazioni meteorologiche e dei dati raccolti con le trappole polliniche consente di stimare la distanza percorsa dal polline in funzione delle principali variabili climatiche. Informazione questa, indispensabile qualora venissero utilizzate coltivazioni OGM, ai fi ni della messa a punto dell indice di monitoraggio.

7 Poster - Bottalico F. et al. Presentato al 54th Italian Society of Agricultural Genetics Annual Congress, Matera, Italy 27/30 September, 2010 DEvelopment of a quick Monitoring index as a tool to assess Environmental impacts of TRAnsgenic crops The LIFE+ programme is the EU s funding instrument to promote implementation, updating and development of EU environmental policy and legislation. The Nature & Biodiversity LIFE+ co-finances innovative or demonstrative projects that contribute to the attainment of the european objective of arresting biodiversity loss. POLLEN FLOW EVALUATION OF CROPS CULTIVATED IN THE MIGLIARINO - SAN ROSSORE MASSACIUCCOLI REGIONAL PARK (NORTH TUSCANY, ITALY) BOTTALICO F. 1, CHELAZZI L 2, FALLACI M. 2, FASANO G. 3, MATERASSI A. 3, MAZZANTI L. 4, PAFFETTI D. 1, PERFETTI A. 4, TOMASELLI V. 5, TRAVAGLINI D. 1, VENDRAMIN G.G. 6, VETTORI C. 6 1) Department of Agricultural and Forest Economics, Engineering, Sciences and Technologies, University of Florence, Via San Bonaventura 13, Florence (Italy) 2) Institute of Ecosystem Study CNR, UOS FI, Via Madonna del Piano 10, Sesto Fiorentino (Italy) 3) Institute for Biometeorology CNR, UOS SS, Via Traversa la Crucca 3, Località Baldinca, Li Punti, Sassari (Italy) 4) Migliarino, San Rossore, Massaciuccoli Regional Park, Località Cascine Vecchie, Pisa (Italy) 5) Institute of Plant Genetics CNR, Via Amendola 165/A, Bari (Italy) 6) Institute of Plant Genetics CNR, UOS FI, Via Madonna del Piano 10, Sesto Fiorentino (Italy) OBJECTIVE To develop a quick monitoring index (QMI) to rapidly assess the potential risk generated by a selected range of transgenic crops in well determined ecosystems or biotopes is important to define pollen dispersal of some local species (crops and trees) which could potentially be converted in transgenics in the near future, and cropped (or potentially cropped) in proximity of protected ecosystems. ACTIVITIES Meteorological stations Data provided with this study will be correlated with meteorological data (air humidity, air temperature, rainfall and wind speed and direction), which influence pollen flows. In addition, measures are taken to determine: soil moisture and soil temperature, solar radiative fluxes: global, diffuse, ultraviolet A and B and sunshine duration. Meteorological stations were set in three sites within three test area (cropped site, non cultivated site, Massaciuccoli lake), to collect data for the above listed parameters. In order to obtain data not influenced by the type of vegetation (grass or trees), in cropped and non cultivated sites meteorological parameters (except for solar radiation fluxes) were measured in an "open" zone of the field at 2.5 m of height, while wind speed and direction were registered at 5 and 10 m of height. All parameters are recorded every 3 minutes and averages are performed and memorized every 15 minutes. Pollen traps Some pollen traps will be installed in strategic positions around marked crops (maize, sunflower, oilseed rape) and the poplar stand to estimate how close pollen flows can encroach ecosystem protected area. This instrument consists of a cylindrical sedimentation chamber covered by a cylindrical hood. Inside the chamber with an eased air volume particles suspended in the air sediment onto a transparent adhesive foil or slide that can be removed for subsequent microscopic analysis. The pollen sampler is designed to determine a pollen deposition rate. Wind-dispersed pollen grains enter the trap through the laterally shifted slits of the deposition sampler. The pollen sediment on the adhesive foil at the bottom of the sampler. Thus, the deposition takes place in the turbulence-depleted interior of the sampler which provides protection from wind and rain. The average pollen deposition rate for the time exposure is calculated from pollen counts determined on a defined area of the adhesive carrier removed after a known period of time. The following species are included in the project: maize, sunflower, oilseed rape and poplar. Some marked crops (maize, sunflower, oilseed rape: 3 different varieties for each species) that can be identified by known molecular markers, have been dislocated in arable surfaces and have been cropped in at least 3 different distances from the test ecosystem protected area for biodiversity evaluation. The information provided is needed to collect data concerning the possible distance covered by transgenic pollen that potentially could impact biodiversity and target species. This will be also necessary to identify potential periods and conditions that increase the risk of pollen dispersal. Impact on biodiversity GPS - GIS The location of both meteorological stations and pollen traps will be acquired by Global Positioning Systems (GPS). Meteorological and pollen dispersal data will be stored within the project database, then meteorological data, pollen dispersal data and biodiversity data will be elaborated and used to define the quick monitoring index. In addition, the data will be used to develop a GIS based model of the quick monitoring index by multi-criteria spatial analysis. Breeding Some local plants able to hybridize with transgenic canola (oilseed rape, cruciferous) and a local poplar stand (located in the test sites in which native poplar is present) will be genotyped with nuclear molecular markers to evaluate possible hybridization with planted oilseed rape or possible breeding with the natural poplar. Partnership: with the collaboration of:

8 Poster 3 Sintesi del Poster La biodiversità Nelle tre aree di studio viene stimata la diversità degli invertebrati, della vegetazione spontanea, dei microrganismi e dei funghi a livello dell apparato radicale (rizosfera) delle piante oggetto di studio: Per la stima della biodiversità dei macroinvertebrati, condotta tramite indici ecologici, i campionamenti vengono eseguiti sia in primavera sia in autunno per avere un quadro più completo. Gli stessi indici sono usati anche per valutare la diversità dei macroinvertebrati presenti nei fi ori delle coltivazioni sperimentali, campionando le colture in tre differenti orari del giorno (alba, mezzogiorno e tramonto) e durante tutto il periodo della fi oritura. Per quanto riguarda la biodiversità vegetale vengono censite le piante (erbacee e arboree), di cui viene anche analizzata la variabilità genetica. Con questo studio viene valutata anche la possibilità di incroci delle piante coltivate con quelle di colture adiacenti o con piante selvatiche. Per la diversità microbica e fungina della rizosfera, vengono prelevati campioni di suolo e successivamente messi in coltura in laboratorio. Anche di questi è valutata la variabilità genetica. La biodiversità viene inoltre studiata a livello ecosistemico, evidenziando le relazioni trofiche tra microrganismi, piante e macroinvertebrati, allo scopo di valutare i potenziali rischi dovuti all ingresso di materiale vegetale transgenico nelle catene alimentari. Questa indagine permetterà di valutare l infl uenza nella catena trofi ca delle eventuali specie target del prodotto del transgene. I dati sulla biodiversità vengono integrati con quelli meteorologici e dei fl ussi pollinici ed usati per defi nire l indice sintetico di monitoraggio del rischio di impatto ambientale delle colture OGM (QMI). La massa dei dati raccolti una volta georeferenziati viene usata per produrre, tramite GIS, cartografi e tematiche utili per le pubbliche amministrazioni.

9 Poster - Buonamici A. et al. Presentato al 54th Italian Society of Agricultural Genetics Annual Congress, Matera, Italy 27/30 September, ha ricevuto Premio SIGA 2010 DEvelopment of a quick Monitoring index as a tool to assess Environmental impacts of TRAnsgenic crops The LIFE+ programme is the EU s funding instrument to promote implementation, updating and development of EU environmental policy and legislation. The Nature & Biodiversity LIFE+ co-finances innovative or demonstrative projects that contribute to the attainment of the european objective of arresting biodiversity loss. ASSESSMENT OF LOCAL BIODIVERSITY IN THE SAN ROSSORE MIGLIARINO - MASSACIUCCOLI REGIONAL PARK (NORTH TUSCANY, ITALY) BUONAMICI A. 1, CASALONE E. 2,1, CHELAZZI L. 3, COLOMBINI I. 1, DONNARUMMA F. 2, FIORENTINI S. 1,4, MESSANA G. 3, PAFFETTI D. 4, PERFETTI A. 5, TOMASELLI V. 6, TRAVAGLINI D. 4, VETTORI C. 1 1) Institute of Plant Genetics CNR, UOS FI, Via Madonna del Piano 10, Sesto Fiorentino (FI, Italy) 2) Department of Evolutionary Biology University of Florence, Via Romana 17/19, Florence (Italy) 3) Institute of Ecosystem Study CNR, UOS FI, Via Madonna del Piano 10, Sesto Fiorentino (FI, Italy) 4) Department of Agricultural and Forest Economics, Engineering, Sciences and Technologies, University of Florence, Via San Bonaventura 13, Florence (Italy) 5) Migliarino, San Rossore, Massaciuccoli Regional Park, Località Cascine Vecchie, Pisa (Italy) 6) Institute of Plant Genetics CNR, Via Amendola 165/A, Bari (Italy) OBJECTIVES 1. Evaluation of biodiversity in three study areas at three levels: weeds/trees, invertebrates, soil/rhizosphere microrganisms 2. Study of the interactions among the three levels in trophic chains 3. Individuation of species sensitive to GM crops 4. Identify diversity indexes to monitor biodiversity changes related to crops which could potentially be converted in transgenics The data will identify sensitive or relevant species providing the information needed to define a QMI in order to assess the potential risk generated by the use of GMPs in the ecosystems ACTIVITIES Plant biodiversity Invertebrate diversity and food webs Faunal diversity on crop flowers Spring and autumn 12 I week Identification of weed and tree species 06 am 06 pm II week III week Assesment of diversity indexes: Shannon and diversity Study genetic diversity among areas using microsatellite markers Select and monitor sensitive species as indicators of environmental quality status sampling on wild flowers pollen-feeding beetle sampling of soil fauna rove beetle Sampling was conducted on crop flowers in three different hours of the day. Different stages of field flowering were taken into account. Diversity indices α-diversity Shannon index Evenness index Food webs IV week V week Isotopic analysis of 13 Cand 15 N will be conducted on wild plants, crops and invertebrates to assess trophic links of food chains. Microbial rhizosphere biodiversity pollen..... flow Transgenic crops pollen crop residues wild plants & weeds non transgenic crops wind weather conditions aquatic & terrestrial macroinvertebrates channel Direct and indirect target species of genetically modified crops are considered. Plants with pollinators present on the cropped areas or possibly breeding with local crops will be the object of a detailed investigation. In the three selected areas biodiversity data will be integrated with information on their interaction in food chains. The resulting data will permit to identify sensitive or relevant species providing information necessary to define a QMI to assess the potential risk generated by the use of GM crops in the ecosystem. Target plant Rhizosphere soil Microbial rhizosphere community ANALYSIS microbes DNA profile Cultural approach Bacteria and fungi count Identification and characterization of specific component Identification of possible target microbes Molecular approach T-RFLP analysis Community DNA profiles for quantitative and qualitative biodiversity evaluation and comparison rhizoshere meiofauna Hypothetical food web According to the biodiversity study, three hypothetical food webs are defined starting from three different primary producers: 1) soil bacteria, algae, moss, lichens; 2) wild plants and crops; 3) aquatic bacteria and algae. Through trophic levels food chains get interconnected. Some predator invertebrates can act at different levels. Pollen enters trophic chians not only through pollinators but also through microrganisms, algae, mosses and lichens present on soil or water surfaces or directly pollen soil bacteria, algae, pollen wild plants and crops pollen moss, lichens bacteria and aquatic algae from filter feeders and freshwater molluscs. Field plots location will be acquired by Global Positioning Systems (GPS). Animal and plant biodiversity data will be stored within the project database, then biodiversity data, meteorological data and pollen dispersal data will be elaborated and used to define the quick monitoring index. In addition, the data will be used to develop a GIS based model of the quick monitoring index by multi-criteria spatial analysis. Partnership: with the collaboration of:

10 Poster 4 Sintesi del Poster Monitoraggio della biodiversità vegetale Il monitoraggio della biodiversità vegetale (con riferimento alle piante erbacee), avviene in quattro aree campione selezionate all interno dei confi ni del Parco Regionale di San Rossore Massaciuccoli, tenendo conto anche della loro prossimità a superfi ci coltivate o potenzialmente coltivabili in cui potrebbero essere usate colture geneticamente modifi cate. Tali superfi ci sono riconducibili essenzialmente a queste tipologie: 1. campi adiacenti a boschi naturali misti 2. campi abbandonati 3. prati umidi 4. pioppeti naturali Al fi ne di defi nire la densità e la composizione delle specie vegetali, è stato posto in ciascun sito di studio, un numero di aree permanenti o di plot variabile in base all estensione della zona. Ogni plot ha una superfi cie variabile: 1.000, 100 e 10 mq. L approccio statistico utilizzato, è quello standardizzato multi-scala proposto dadengler, e serve per valutare i modelli di diversità vegetale: di singoli appezzamenti; lungo gradienti ambientali che rilevano la presenza o la produttività di una specie in funzione della variazioni delle componenti ambientali (luce, umidità, tipo di suolo) entro specifi ci tipi di vegetazione; per settori del paesaggio. Le aree permanenti o plot sono utilizzate, sia per il censimento fl o- ristico, sia per l analisi delle comunità vegetali. Al fi ne di defi nire le possibili variazioni di distribuzione e/o densità delle specie vegetali, è stata valutata la loro abbondanza relativa all interno dei singoli plot (utilizzando, in questo caso, l approccio di Braun Blanquet). I dati così ottenuti hanno permesso di catalogare le comunità delle specie vegetali rilevate. Per valutare infi ne, il potenziale incrocio tra specie selvatiche e specie coltivate, dall elenco fl oristico generale è stato estratto un gruppo di quelle varietà potenzialmente suscettibili all ibridazione con quelle messe a coltura nei siti sperimentali. Al tempo stesso, per ogni specie vegetale così individuata, sono stati registrati i dati fenologici (cioè relativi allo sviluppo della pianta) grazie a osservazioni effettuate sul campo a cadenza mensile. Particolare attenzione è stata rivolta alle specie di piante erbacee appartenenti alla famiglia delle Brassicaceae, in grado di ibridare con la colza (Brassica napus), qualora si verifi chi una sincronia di fi oritura.

11 Poster - Tomaselli V. et al. Presentato al 106 Congresso Nazionale della Società Botanica Italiana, Genova, Italia - 21/23 Settembre, 2011 A LIFE+ PROJECT (DEMETRA) FOR EVALUATING THE IMPACTS OF TRANSGENIC CROPS ON NATURAL ENVIRONMENTS TOMASELLI V. (1), PAFFETTI D. (2), TRAVAGLINI D. (2), CHELAZZI L. (3), BIRICOLTI S. (4), BOSCALERI F. (5), BOTTALICO F. (2), BUONAMICI A. (6), CIMÒ F. (3), COLOMBINI I. (3), FASANO G. (7), FIORENTINI S. (2), MASTROIANNI O. (8), MATERASSI A. (7), PERFETTI A. (8), RUSSU R. (5), VETTORI C. (6) (1) Plant Genetics Institute, CNR, Via Amendola 165/A, Bari (2) Department of Agricultural and Forest Economics, Engineering, Sciences and Technologies, University of Florence, Via San Bonaventura 13, Firenze (3) Institute of Ecosystem Study, CNR, UOS FI, Via Madonna del Piano 10, Sesto Fiorentino (FI) (4) Department of Agronomy and Land Management, University of Florence, piazzale delle Cascine 22, Firenze (5) DG Competitiveness of regional system and development of competencies, Regional Government of Tuscany, Via di Novoli 26, 50127, Firenze (6) Plant Genetics Institute, CNR, UOS FI, Via Madonna del Piano 10, Sesto Fiorentino (FI) (7) Institute for Biometeorology, CNR, UOS SS, Via Traversa la Crucca 3, Località Baldinca, Li Punti, Sassari (8) Migliarino, San Rossore, Massaciuccoli Regional Park, Località Cascine Vecchie, 56122, Pisa The project LIFE+ DEMETRA (DEvelopment of a quick Monitoring index as a tool to assess Environmental impacts of TRAnsgenic crops) arises from the need to analyze standardised numerical data within a Geographical Information System supporting Genetically Modified Organisms (GMOs) monitoring. In particular, the project is aimed to the creation of a Quick Monitoring Index (QMI) to rapidly assess the potential risk generated by a selected range of transgenic crops in well determined ecosystems a) fields adjacent to natural mixed forests b) abandoned fields The study area is the San Rossore - Migliarino - Massaciuccoli Regional Park, characterized mainly by wetlands, lowland forests, natural poplar groves and pine forests. The protected area stretches along the coastline of the provinces of Pisa and Lucca and covers a surface of over 23,000 ha For carrying out the experimental field activities, four test areas have been selected within the boundaries of the Regional Park, also taking into account their proximity to cropped (or potentially cropped) surfaces in which Genetically Modified (GM) crops could be used. Different environments have been selected: a) fields adjacent to natural mixed forests; b) abandoned fields; c) wet meadows; d) natural poplar groves Map of the study area: 1 - Massaciuccoli lake, wetlands 2 - Natural poplar groves and abandoned fields 3 - Fields adjacent to mixed forests, pine plantations and wet meadows Potential breeding Potential impact on biodiversity d) natural poplar groves c) wet meadows The project consists of several Actions. Main issues are: Pollen flow evaluation (Action A.6); Meteorological physical data (Action A.7); Assessment of local biodiversity (Action A.8) Local biodiversity will be evaluated at three levels: weeds/trees, invertebrates, soil/rhizosphere microrganisms and in relation to target species Analyses on local biodiversity are carried out to assess a) local ecosystem biodiversity in relation to the target crops species; b) the interactions among the three levels in trophic chains; c) definition of potential relationships between transgene-environment-plant-animal-food chain in the study plots; d) individuation of species sensitive to GM crops; e) definition of diversity indexes to monitor biodiversity changes related to crops which could potentially be converted in transgenics As regards the crop species to be monitored, the following have been chosen: maize, sunflower, canola and poplar. Some marked varieties (GMO free have been used, due both to Italian low restriction and to the sensitive environments selected) have been dislocated in arable surfaces close to the selected test areas. Some native plants able to hybridize with the selected crops have been genotyped with nuclear molecular markers to evaluate possible hybridization. In particular, the analyses have been focused on canola (Brassica napus L. var. oleifera D.C.) and the family of Brassicaceae. The presence of Brassicaceae in the study areas (especially next to cultivated areas and crops) is recorded and their potential for hybridization is to be evaluated. In addition to presence, distribution and frequency, particularly attention is paid to recording phenological data (flowering and fruiting). Through the evaluation of these and other factors will be possible to assess the possible impact of the "target" species on the natural environment under observation Taxon Fam Feb Mar Apr May Jun Jul Sinapis arvensis L. Brassicaceae BF FF FF/EF EF/RP RP Cardamine hirsuta Brassicaceae FF EF/RP RP L. BF Capsella bursa-pastoris (L.)Medicus Brassicaceae BF FF EF/RP RP Raphanus raphanistrum L. Brassicaceae BF FF EF/RP RP Alliaria petiolata (Bieb.)Cavara et Grande Brassicaceae BF FF EF/RP Cardamine pratensis L. Brassicaceae FF EF/RP BF BF = beginning of flowering FF = full flowering EF = end of flowering RP = ripe fruits (maturity of fruits and seeds) List of Brassicaceae identified in two plots under investigation. Phenological state observed during each month of observation is reported for each species, according to the BBCH (Biologische Bundesanstalt, Bundessortenamt, Chemische Industrie) code (Schwartz, 2003) Plot of 1000 m² in poplar groves Plot of 10 m² in wet meadows The monitoring of plant biodiversity in the four test sites should proceed for progressive levels of investigation. In order to better define species density and composition, some sampling plots have been chosen within each of the four selected sites. For evaluating plant biodiversity we used the standardised multi-scale approach proposed by Dengler (2009). For each of the study areas we applied the scheme of Dengler, placing a variable number of permanent plots, based on the extension of the area. The floristic census has been carried out with periodical inspection and phenological data have been recorded, for each plant species in each plot. In order to define possible variations of distribution and/or density of plant species, their relative abundance within their environments are evaluated. To do this, an analysis of the plant communities within plot boundaries has been assessed, according to the Braun Blanquet (1964) approach, pointing out spatial distribution and frequency in relation with the human (mainly agricultural) activities Partnership: With the collaboration of:

12 Poster 5 Sintesi del Poster Valutazione dell impatto di possibili coltivazioni di pioppo transgenico in aree protette Per misurare il rischio potenziale generato da coltivazioni transgeniche di pioppo in ecosistemi o biotopi, sono state prese in considerazione aree di limitate dimensioni vicine a quelle che potrebbero essere utilizzate per la coltivazione di piante geneticamente modifi cate. In tal modo sarà possibile valutare l eventuale inquinamento genetico tra aree naturali e quelle coltivate. Per quanto riguarda la diversità arborea, alcune specie di pioppo (nome scientifi co Populus) sono state identifi cate nelle aree di studio. Sono state esaminate due popolazioni spontanee di pioppo, presenti in due ecosistemi diversi pioppete (foresta e zona umida) insieme a due coltivate. Le due aree scelte per questo particolare studio, che distano 8 km l una dall altra, sono un bosco misto nella Tenuta di San Rossore (area A) e una zona umida intorno al lago di Massaciuccoli, popolato da un gruppo frammentato di pioppi (area B). Nell area A le specie arboree più frequenti sono pioppi (Populus alba e Populus x canescens), frassini (Fraxinus angustifolia) e ontani (Alnus glutinosa). Nell area B si trovano alberi singoli e singoli gruppi di pioppo (Populus spp.) sparsi intorno al lago. Nell area A è stata disegnata un area sperimentale di mq al cui interno è stata delimitata un area più piccola di mq. Le posizioni delle aree e quella delle singole piante sono state acquisite con il sistema GPS. In totale sono stati analizzati 55 campioni di pioppo naturale insieme a 20 campioni provenienti da coltivazioni adiacenti. Per defi nire la composizione e la densità del sottobosco di pioppo sono stati eseguiti dei campionamenti in rettangoli disegnati all interno dell area sperimentale A, secondo l approccio statistico multi-scala standardizzato di Dengler seguendo la procedura precedentemente descritta. Le osservazioni effettuate fi no al 2011 mostrano una certa variabilità nella distribuzione delle specie tra un plot e l altro, probabilmente dovuto alle particolari caratteristiche micro-topologiche del sito. In quest area, inoltre, sono state identifi cate specie appartenenti a Carici remotae-fraxinetum oxycarpae. Le comunità di falasco e canne che crescono presso il lago di Massaciuccoli (area B) si riferiscono alla classe Phragmito-Magnocaricetea. Le specie più diffuse sono le comunità di canne appartenenti a Phragmitetum communis, e le comunità di falasco di Cladietum marisci. Tra le idrofite, o acquatiche, si riconoscono principalmente specie appartenenti alla classe delle Potametea. Nell area B ci sono inoltre molte specie rare o in pericolo di estinzione come la periploca (Periploca graeca L.), la campanella (Leucojum aestivum L.) e l ibisco (Hibiscus palustris L.). Durante il periodo di fi oritura sono state raccolte le infi orescenze degli alberi maschili e femminili. Questi campioni, insieme alla fauna associata, servono per stabilire una relazione tra la diversità della fauna e la biomassa delle infi orescenze. I risultati indicano un relativamente basso numero di specie ed una evidente differenza nella fauna presente sugli alberi maschili e femminili. Le specie più abbondanti sono larve di ditteri, coleotteri (come coccinellidi e curculionidi), araneidi e larve di lepidotteri. L analisi della struttura spaziale della diversità genetica nelle due popolazioni di pioppo, condotta attraverso il software Geneland, mostrano chiaramente che nell area A si possono identificare tre gruppi indicanti la presenza di barriere al flusso genico. Un raggruppamento comprende tutti i soggetti con lo stesso genotipo ed è molto probabile che siano polloni (piante che si sviluppano direttamente sul tronco o ai piedi dell albero, o anche direttamente dalla radice). Il secondo ed il terzo raggruppamento mostrano, invece, la presenza di flusso genico all interno e tra i due gruppi. Tutto ciò indica che tra questi due gruppi c è una barriera più limitata e meno efficace, e che le altre specie arboree presenti bloccano solo in parte il flusso pollinico. Nell area B sono stati identificati, invece, due gruppi in cui il flusso genico è maggiore rispetto a quello trovato nell area A: non a caso questa popolazione si trova in uno spazio aperto come un lago in cui il flusso pollinico è favorito. L indagine consente di affermare che, in presenza di un alto livello di biodiversità come quello rilevato all interno dell area selezionata abbinato al particolarmente alto fl usso genetico presente nell area B, la coltivazione di pioppo transgenico vicino a queste aree protette potrebbe influenzare in modo signifi cativo la loro biodiversità.

13 % % Coleoptera Diptera l Embioptera Imenoptera Lepidoptera l Mollusco Aranea Coleoptera Diptera l Imenoptera Lepidoptera l Aranea % % Coleoptera Diptera l Embioptera Mollusco Aranea Coleoptera Diptera l Imenoptera Lepidoptera l Mollusco Aranea Poster - Buonamici A. et al. Presentato al IUFRO Tree Biotechnology Conference 2011, From Genomes to Integration and Delivery, Arraial d Ajuda, Bahia, Brazil, June 26 July 2, 2011 ed al VIII Congresso Nazionale SISEF, Rende (CS), Italia, 4-7 Ottobre, 2011 DEvelopment of a quick Monitoring index as a tool to assess Environmental impacts of TRAnsgenic crops The LIFE+ programme is the EU s funding instrument to promote implementation, updating and development of EU environmental policy and legislation. The Nature & Biodiversity LIFE+ cofinances innovative or demonstrative projects that contribute to the attainment of the european objective of arresting biodiversity loss. EVALUATION OF ENVIRONMENTAL IMPACTS AS CONSEQUENCE OF HYPOTHETIC TRANSGENIC POPLAR PLANTATIONS IN PROTECTED AREAS Buonamici A. 1, Paffetti D. 2, Travaglini D. 2, Biricolti S. 3, Bottalico F. 2, Chelazzi L. 4, Cimò F. 5, Colombini I. 1, Fiorentini S. 2, Tomaselli V. 6, Fasano G. 7 ; Materassi A. 7, Vettori C. 1 1 )Plant Genetics Institute, CNR, UOS FI, Via Madonna del Piano 10, Sesto Fiorentino (FI), Italy 2)Department of Agricultural and Forest Economics, Engineering, Sciences and Technologies, University of Florence, Via San Bonaventura 13, Florence, Italy 3)Department of Agronomy and Land Management, University of Florence, piazzale delle Cascine 22, Florence, Italy 4 )Institute of Ecosystem Study CNR, UOS FI, Via Madonna del Piano 10, Sesto Fiorentino (FI), Italy 5 )Development of farms and agrifood enterprises Unit, DG Economic Development, Regional Government of Tuscany, Via di Novoli 26, Firenze, Italy 6)Plant Genetics Institute, CNR, Via Amendola 165/A, Bari, Italy 7 )Institute for Biometeorology CNR, UOS SS, Via Traversa la Crucca 3, Località Baldinca, Li Punti (SS), Italy BACKGROUND Plant biodiversity studies have been performed in the Migliarino-San Rossore-Massaciuccoli Regional Park in Tuscany (Italy) within the framework of the European project LIFE08 NAT/IT/342.This project aims at developing a quick monitoring index (QMI) to rapidly assess the potential risk generated by transgenic plants in characterized ecosystems or biotopes. For this reason test areas have been selected inside the protected area to evaluate plant (weeds and trees), animal, and soil microoganisms biodiversity. The proximity of the selected test area to cropped surfaces where Genetically Modified Plants (GMPs) might be cultivated has been taken into account. GMPs could spread pollen and contaminate natural populations. To avoid this risk, an efficient monitoring system is required taking into account genetic diversity and breeding study. As far as tree biodiversity concern, Populus species were identified in the test areas. Two populations of Populus present into two different ecosystems (forest and wetland areas) were examined together with two cultivated varieties. The two ecosystems were characterized for the vegetation. Nuclear microsatellites were used to evaluate genetic diversity of poplar populations and level of breeding between natural and cultivated Populus. In addition the insect populations present on male and female poplars during flowering period have been studied. Map of the project study area 1. Wetland area of Massaciuccoli lake; 2. Natural poplar forests and non cultivated areas; 3. Mixed and pine forests, wetlands, cropped area. RESULTS In relation to the herbaceous stratum, the observations made so far show some variability in the distribution of species to a plot to another, probably due to the micro topological characteristics of the site. Sedges and reeds communities growing in the Massaciuccoli lake (area B) have to be referred to the class Phragmito-Magnocaricetea Klika in Klika & Novák Most common types are the reeds communities belonging to Phragmitetum communis (Koch 1926) Schmale 1939, and the sedges communities of Cladietum marisci (Allorge 1922) Zobrust The hydrophytes vegetation have to be referred mainly to the class Potametea R. Tx. & Preisg This site is characterized by many rare or threatened species, such as: Periploca graeca L., Leucojum aestivum L., Hibiscus palustris L., etc. According to the vegetation analysis, the woods with poplar (area A) can be referred to Carici remotae-fraxinetum oxycarpae Pedrotti (1970) During poplar tree blooming period inflorescences of male and female trees were collected. Samples were taken to establish the relationship between the diversity of the associated fauna and the biomass of the inflorescence. Weekly sampling was carried out with the aid of an elevator truck that permitted to collect samples out of reach. Fauna was sorted and determined to species level whereas inflorescences were oven dried and weighed. The results indicate an evident difference in the faunal community between male and female trees and a relatively low number of species. Dipteran larvae were most abundant followed by coleopterans such as coccinellids and curculionids, araneids and lepidopteran larvae (Figure 1). The analysis of spatial and genetic structure of the two poplar populations was performed using Geneland. The results of Geneland clearly showed that three distinct clusters can be identified in the area A (Figure 2a) indicating the presence gene flow barriers (Figures 2b, 2c, 2d). The cluster represented in Figure 2b comprise individuals with the same genotype as indicated by microsatellites data (not shown). In fact, it is highly probable that these individuals are root suckers (Figure 3). The second and third clusters show the occurrence of gene flow within and among the two clusters (Figures 2c and 2d). This indicates that a minor barrier is present because the other tree species of the stand block only in part the pollen flow. The same analysis indicates two clusters in area B (Figure 4) with a gene flow among them higher respect to the area A. In fact, this population is in an open area (lake) and therefore the pollen flow is favored. Hibiscus palustris (area B) Total Week 2 a n=363 c n=148 Hypericum androsaemum (area A) n=194 n=21 Week 1 Week 3 Figure 1. Histogram of species detected on male poplar trees. b d Figure 2. Results of Geneland analyses of area A showing: (a) Spatial organization into three clusters; (b), (c), and (d) are maps of posterior probabilities of each cluster. Figure 3. Distribution of poplar individuals in area A. Green circles represent the poplar root suckers. Figure 4. Map of area B (a), and results of Geneland analyses of area B showing: (b) Spatial organization into two clusters; (c), and (d) are maps of posterior probabilities of each cluster. CONCLUSIONS In general the level of biodiversity within the selected test area is high, and in particular the level of gene flow inside area B. Therefore, the possible cultivation of transgenic poplar close to the protected areas could influence their biodiversity. Especially the level of gene flow can determine a contamination of the autochthon poplar populations. The development of a QMI using the experimental data is in course. The availability of the QMI to rapidly assess the potential risk generated by transgenic plants in characterized ecosystems, is a useful tool to assess the releasing or not of the permission of cultivation close to protected areas. Partnership: with the collaboration of:

14 Poster 6 Sintesi del Poster Valutazione della diversità microbica e fungina in suoli rizosferici di piante selvatiche Ad oggi, sono stati ottenuti risultati preliminari in merito alle componenti microbiche di suoli rizosferici di piante che, all interno del Parco Regionale di Migliarino San Rossore Massaciuccoli, possono essere oggetto di un possibile inquinamento non intenzionale di colture geneticamente modifi cate. Le analisi condotte hanno indagato la diversità batterica e fungina e le sue variazioni su base stagionale. Nel dettaglio, sono stati campionati i suoli rizosferici di undici pioppi, di cui sette naturali (novembre novembre 2011) e quattro coltivati (aprile 2011-novembre 2011) e undici aceri (gennaio luglio 2011). I suoli sono stati analizzati sia con metodi colturali sia molecolari. I metodi colturali hanno permesso di: determinare i numeri totali di cellule microbiche vitali e le loro variazioni stagionali. I titoli batterici sono sempre più alti di quelli fungini per pioppi e aceri in tutte le stagioni. Per quest ultima variabile è stato rilevato che tali titoli diminuiscono nella stagione calda in conseguenza della diminuzione dell umidità del suolo. costituire una collezione di ceppi batterici (circa 400) e fungini (circa 350) rappresentativa dei suoli campionati. A questa ceppoteca è stato collegato un catalogo elettronico che riporta le principali caratteristiche morfologiche dei ceppi. L approccio molecolare, applicato per ognuna delle comunità batteriche e fungine analizzate, ha prodotto specifi ci profi li di marcatori molecolari che, utilizzati in una serie di analisi successive, hanno evidenziato una maggiore eterogeneità delle popolazioni fungine rispetto alle batteriche. Inoltre, mentre le comunità batteriche si differenziano prevalentemente in ragione di fattori ambientali di tipo stagionale (autunno/inverno e primavera/estate), della tipologia di pianta e del sito (pioppi/aceri, pioppi naturali/pioppi coltivati), quelle fungine si differenziano principalmente per tipologia di pianta e del sito. In seguito, i profi li molecolari sono anche stati utilizzati per calcolare alcuni indici di biodiversità che tengono conto dell abbondanza e dell equidistribuzione delle specie. Da questi dati risulta che, le comunità fungine rispetto a quelle batteriche presentano una maggiore abbondanza di specie, e che, limitatamente alle popolazioni batteriche, i campioni rizosferici di pioppi rilevati nelle stagioni fredde presentano una maggiore abbondanza di specie rispetto a quelli rilevati nelle stagioni calde. Inoltre, le comunità fungine mostrano una più omogenea equidistribuzione di specie.

15 Poster - Casalone E. et al. Presentato al SIMGBM 29th National Meeting, Pisa, Italy - 21/23 September, 2011 The LIFE+ programme is the EU s funding instrument to promote implementation, updating and development of EU environmental policy and legislation. The Nature & Biodiversity LIFE+ cofinances innovative or demonstrative projects that contribute to the attainment of the european objective of arresting biodiversity loss. DEvelopment of a quick Monitoring index as a tool to assess Environmental impacts of TRAnsgenic crops EVALUTATION OF MICROBIAL DIVERSITY IN RIZOSPHERIC SOILS OF WILD PLANTS IN THE RISK ASSESSMENT OF UNINTENDED NEGATIVE ENVIRONMENTAL IMPACTS OF TRANSGENIC CROPS Casalone E. 1,2, Senatore G. 1, Vitali F. 1, Caroppo C. 1, Mastromei M. 1,2 1) Department of Evolutionary Biology University of Florence, Via Romana 17/19, Florence (Italy) 2) Institute of Plant Genetics CNR, UOS FI, Via Madonna del Piano 10, Sesto Fiorentino (FI, Italy) INTRODUCTION Genetically modified (GM) crops, like Bt crops, avoiding the use of traditional chemical pesticides, have potential environmental benefits. However, this benefits need to be balanced against their potential environmental harm. Therefore, unintended negative environmental impacts of GM crops need to be evaluated at ecologically relevant scales. This work fits in a project called DEMETRA-LIFE, which main objective is to address the general surveillance efforts of those public bodies, like Regione Toscana, who, in the next future, have to answer to farmers request for GM crops. In fact, no guidance is available as to how existing monitoring programs and data infrastructure schemes may support GM crop monitoring. The DEMETRA project analyses the potential interactions of GM crops with some relevant biological, physical and climatic parameters that will be collected and studied in defined sites of a study area in the Regional Parco Migliarino-San Rossore Massacciuccoli. A relevant collateral result is the possibility to generate a starting point for biodiversity in areas where transgenic crops have never been used. The resulting data-sets will be used when transgenic crops enter in common use, allowing a comparison among observed parameters linked to biodiversity. Here we report the preliminary results about microbial biodiversity in the rizospheric soil of poplar and maple trees. These trees species are possible unintended target of direct (e.g., hybrid formation by pollination - gene flow) or indirect (e.g., diminished pollination by insect that are targets of transgene products) effects of GM crops. RESULTS Cultural approach Viable counts: range of values for fungi and bacteria in the rizospheric soil of poplar and maple VIABLE COUNT (CFU/g soil) POPLAR MAPLE FUNGI 2,2 x ,4 x ,3 x ,7 x10 4 BACTERIA 1,3 x ,1 x ,0 x ,5 x10 7 Fungi viable counts vs. bacteria viable counts : lower, wider, more seasonal dependent RESULTS METHODOLOGICAL APPROACH Seasonal (autumn, winter, spring and summer) samples of rizospheric soils collected from 11 poplars (7 natural and 4 cultivated) and 11 maples from two different sites, have been analysed by both culture and culture-indipendent (T-RFLP analysis) methods to assess bacteria and fungi biodiversity. Rhizosphere Target plant Microbial rhizosphere community Isolates: number of isolates in the collection of strains (also reported in the electronic database) ISOLATES POPLAR MAPLE FUNGI BACTERIA Molecular approach Terminal restriction fragments (T-RFs) from all the T-RFLP profiles have been used to perform population analysis by: 1. Clustering analysis with NTSys software and Jaccard similarity coefficent (Figure 1). 2. IPCA (Interaction Principal Component Analysis) with T-REX software (Figures and related tables). 3. Biodiversity indexes (Tables 6 and 7). Each T-RF is considered an operational taxonomic unit (OTU) and its area a measure of the OTU abundance. soil ANALYSIS Cultural approach Bacteria and fungi counts on selective media Molecular approach T-RFLP analysis microbes DNA profile (T-RF markers) Selection of microrganism with different colony and cell morphology and establishment of: - an electronic (photographic) database - a collection of strains PCR Electro phoresis restriction Community DNA profiles for quantitative and qualitative biodiversity evaluation and comparison. 16s rrna and ITS marker analysis for bacteria and fungi, respectively. Figure 1. Clustering analysis results of the bacterial samples. Figures 2-3-4: IPCA bidimensional plot of bacterial (Fig 2) and fungal (Fig 3-4) communities. In Fig 4 samples from the same site (plant) and the same season are considered as replicates. Fig 2. 16S rrna Fig 3. ITS Fig 4. ITS Red, Blue, poplars maples SPRING MAPLE POPLAR (natural and cultivated) Spring Autumn POPLARS (natural) AUTUMN POPLAR WINTER POPLAR SPRING POPLAR WINTER MAPLE SPRING MAPLE SPRING POPLAR (natural and cultivated) WINTER POPLAR POPLARS (cultivated) AUTUMN POPLAR MAPLE MAPLE (Winter and spring) Winter WINTER MAPLE (a) Percent Cummulative Source Variation Percent IPCA % % IPCA % % Percent Cummulative Source Variation Percent IPCA % % IPCA % 16.69% Cummulative Source Percent Variation Percent IPCA % % IPCA % 96.9 % Percento Variation Percent Variation Percent Variation of Source Source Source of Total of Total Total Main Effects Main Effects Main Effects (b) T-RFs 46.43% T-RFs 7.64 % T-RFs 29.83% Environments 10.9% Environments 2.58% Environments 7.01% Interaction Effects 42.68% Interaction Effects % Interaction Effects 63.15% Tables related to figures 3-4-5: (a) how much of the total variation among T-RFLP profiles have been captured by the first two IPCA components; (b) how much of the variation among T-RFLP profiles is due to a T-RF effect or to an Environmental effect, and to the interaction of these two main effects. Clustering and IPCA analysis show that samples groups mainly on a plant-species and seasonal base. BACTERIA FUNGI H AUTUMN WINTER SPRING AUTUMN WINTER SPRING The ecological diversity of microbial communities is characterized by: Shannon's index (H ), which accounts for both abundance and evenness of the species present. Evenness index (e), which refers to how close in numbers the species in an environment are e = H /logs POPLAR 1,43 1,48 1,61 1,81 1,86 1,63 MAPLE \ 1,55 1,53 \ 1,92 1,82 e BACTERIA FUNGI AUTUMN WINTER SPRING AUTUMN WINTER SPRING POPLAR 0,77 0,78 0,78 0,80 0,82 0,80 MAPLE \ 0,73 0,74 \ 0,86 0,88 Table 6. Shannon diversity index values. Table 7. Evenness index values. CONCLUSION IPCA and Clustering analysis of the T-RFLP data highlight similar ordination of community profiles that are mainly driven on differences linked to environmental factors, i.e. seasonal and plant species. In the development of the project we will combine our data with bibliography and online T-RF databases to identify microbial species that can be used as biological indicators of the risk connected to GM crops. Partnership: with the collaboration of:

16 Regione Toscana