HOLOTYPE HLA 24/7 CONFIGURAZIONE A1 & CE/A2 & CE/A3 & CE/A4 & CE ISTRUZIONI D USO VERSIONE 9 02/05/2018

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1 HOLOTYPE HLA 24/7 CONFIGURAZIONE A1 & CE/A2 & CE/A3 & CE/A4 & CE ISTRUZIONI D USO VERSIONE 9 02/05/2018 Per uso diagnostico in vitro 0086 Preparazione del DNA per analisi di sequenziamento su Illumina MiSeq

2 Indice INFORMAZIONI SUL PRODUTTORE... 7 SIGNIFICATO DEI SIMBOLI... 7 CONTENUTO DEL KIT HOLOTYPE HLA-24/7 CONFIGURAZIONE A1 & CE/A2 & CE/A3 & CE/A4 & CE... 8 SCATOLA COMPONENTI PRIMER... 8 SCATOLA COMPONENTI REAGENTI PER PREPARAZIONE LIBRERIE... 9 PIASTRA A 96 POZZETTI CON ADATTATORI... 9 WORKBOOK EXCEL... 9 SOFTWARE OMIXON HLA TWIN TRASPORTO E CONSERVAZIONE AVVERTENZE E PRECAUZIONI LIMITAZIONI NOTE DEL PRODOTTO INFORMAZIONI PER LA SICUREZZA PARAMETRI DI PRESTAZIONE ASSISTENZA TECNICA APPARECCHIATURE, REAGENTI E FORNITURE RACCOMANDAZIONI TECNICHE E SULLE APPARECCHIATURE RACCOMANDAZIONI SUI REAGENTI ASSOCIATI Capacità Kit Reagenti MiSeq ATTREZZATURE CONSIGLIATE AVVISO LEGALE DESTINAZIONE D USO NOTA IMPORTANTE PRIMA DI INIZIARE RACCOMANDAZIONE CIRCA L ESTRAZIONE DI DNA GENOMICO PRINCIPIO DEL METODO SOMMARIO DELLE FASI GLOSSARIO/DEFINIZIONI FASE 1 PREPARAZIONE MASTER MIX PER AMPLIFICAZIONE HLA ELENCO REAGENTI PROTOCOLLO Master mix: HLA-A, B, C, DRB1, DPB1 e DQA Master mix: HLA-DQB1 serie FASE 2 AMPLIFICAZIONE HLA CLASSE I E II ELENCO REAGENTI PROTOCOLLO Master mix più Taq polimerasi: HLA-A, B, C, DRB1, DPB1 e DQA Master mix più Taq polimerasi: HLA-DQB1 serie Amplificazione classe I (HLA-A, B e C) Amplificazione classe II (HLA-DRB1, DPB1, DQA1 e DQB1) Dimensioni previste ampliconi Pagina 2 49

3 FASE 3 QUANTIFICAZIONE E NORMALIZZAZIONE AMPLICONI (UTILIZZANDO UN FLUORIMETRO PER PIASTRE) 24 ELENCO REAGENTI PROTOCOLLO Combinazione ampliconi Purificazione PCR ExoSAP-IT Express FASE 4 PREPARAZIONE LIBRERIA ELENCO REAGENTI PROTOCOLLO Master mix frammentazione Programma frammentazione Master mix riparazione estremità Programma riparazione estremità Master mix ligazione Programma ligazione Combinazione e purificazione libreria FASE 5 SCELTA DELLE DIMENSIONI DELLA LIBRERIA ELENCO REAGENTI PROTOCOLLO FASE 6 QUANTIFICAZIONE DELLA LIBRERIA CON UNO STRUMENTO QPCR ELENCO REAGENTI PROTOCOLLO Primer mix qpcr Master mix qpcr FASE 7 SEQUENZIAMENTO SU ILLUMINA MISEQ ELENCO REAGENTI Capacità Kit Reagenti MiSeq PROTOCOLLO FASE 8 ANALISI DATI DI SEQUENZIAMENTO HLA PROTOCOLLO AUTOMATIZZATO Installazione IT e configurazione Protocollo per analisi PROTOCOLLO SERVER MANUALE Installazione IT e configurazione Protocollo per analisi PROTOCOLLO DESKTOP MANUALE Installazione IT e configurazione Protocollo per analisi FIGURE SUPPLEMENTARI ESEMPIO DI SCHEMA PER PIASTRA AMPLICONI, PIASTRA AMPLIFICAZIONE, PIASTRA DILUIZIONE, PIASTRA QUANTIFICAZIONE AMPLICONI (PER UN LOCUS INDIVIDUALE) E PIASTRA REAZIONE ESEMPIO DI PIASTRA QUANTIFICAZIONE STANDARD ESEMPIO DI PIASTRA PER QUANTIFICAZIONE LIBRERIA CON QPCR KAPA APPENDICE 1: PIPPIN PREP PROGRAMMAZIONE PIPPIN PREP ESECUZIONE DI UNA CORSA SU PIPPIN PREP Pagina 3 49

4 APPENDICE 2: QUANTIFICAZIONE AMPLICONI UTILIZZANDO UNO STRUMENTO PER QPCR ELENCO REAGENTI PROTOCOLLO APPENDICE 3: QUANTIFICAZIONE LIBRERIE CON UN COLORANTE FLUORESCENTE INTERCALANTE NEL DSDNA ELENCO REAGENTI PROTOCOLLO Pagina 4 49

5 Cronologia revisioni Note e aggiornamenti importanti Versione Data Autore Sommario delle modifiche Autorizzata da Data di emissione V1 V2 V3 V4 V5 V6 V7 V8 V9 05/12/2015 Robert Pollock 18/01/2016 Robert Pollock 10/02/2016 Robert Pollock 26/02/2016 Robert Pollock 05/04/2016 Robert Pollock 09/04/2016 Efi Melista 23/04/2016 Efi Melista 30/05/2016 Gergely Tölgyesi 29/11/2017 Tünde Vágó Prima versione, bozza Seconda bozza, correzioni di piccola entità Terza bozza, aggiornamento spiegazione simboli, raccomandazione ciclo congelamento/scongelamento, aggiornamento destinazione d uso Quarta bozza, aggiornamenti sezione informazioni per la sicurezza Quinta stesura, raccomandazione alternativa per quantificazione ampliconi Modifica minore della formulazione da enzima LR-PCR a Taq polimerasi in seguito alla modifica della documentazione di Qiagen Aggiornamento di DQB1 serie 1 e serie 2 Aggiornamento delle metriche di prestazione, Aggiornamento dei volumi di reagenti per la preparazione delle librerie, Aggiornamento delle configurazioni del prodotto per piastre con adattatori indicizzati A2/A3/A4 Rimozione DQB dai DQB Enhancer, verifica gel dopo che la LR-PCR è diventata opzionale, semplificazione della quantificazione ampliconi, cambiamento volume combinazione in pool per campione nei kit da 11 loci, ExoSAP-IT sostituito con ExoSAP-IT Express, utilizzo di Qubit per quantificazione libreria, primer mix DQB1 serie 1 e serie 2 sostituiti da DQB1 serie 3, diminuzione del tempo di reazione riparazione estremità, diminuzione del tempo di reazione ligazione, aggiornamento metodo quantificazione libreria, rimozione foglio campioni dall Appendice Gergely Tölgyesi Gergely Tölgyesi Gergely Tölgyesi 05/12/ /01/ /02/2016 Gergely 26/02/2016 Tölgyesi Efi Melista 05/04/2016 Gergely Tölgyesi Gergely Tölgyesi 09/04/ /04/2016 Efi Melista 30/05/2016 Efi Melista 02/05/2018 Pagina 5 49

6 Liberatoria Omixon ha compiuto il massimo sforzo per garantire l accuratezza delle presenti Istruzioni d'uso (IFU). Tuttavia Omixon esclude qualsiasi responsabilità per eventuali imprecisioni od omissioni. Le informazioni nelle presenti IFU sono soggette a modifiche senza preavviso. Omixon non si assume alcuna responsabilità per eventuali imprecisioni che potrebbero essere contenute nelle presenti IFU. Omixon si riserva il diritto di apportare miglioramenti alle presenti IFU e/o ai prodotti qui descritti in qualsiasi momento senza preavviso. Qualora nel presente manuale si rilevassero informazioni non corrette, ingannevoli o incomplete, vi saremo grati per qualsiasi commento e suggerimento. Vogliate inviarceli all indirizzo support@omixon.com. Pagina 6 49

7 Informazioni sul produttore Ragione sociale: Omixon Biocomputing Ltd Indirizzo: Fehérvári út 50-52/6 Città: Budapest Codice postale: H-1117 Paese: Ungheria Significato dei simboli LOTTO/Numero lotto Numero di riferimento/catalogo Consultare le Istruzioni d uso Contiene reagente per numero N di test Fabbricante. La data indicata insieme al simbolo si riferisce alla data di produzione Temperatura di conservazione raccomandata Data di scadenza Dispositivo medico-diagnostico in vitro Ricambio Contiene un ricambio Pagina 7 49

8 Contenuto del Kit Holotype HLA-24/7 Configurazione A1 & CE/A2 & CE/A3 & CE/A4 & CE Questa sezione descrive il contenuto delle varie configurazioni disponibili del prodotto Holotype HLA 24/7: Tipo di prodotto N. RIF. Reaz. Holotype HLA 24/7 Configurazione A1 & CE Holotype HLA 24/7 Configurazione A2 & CE Holotype HLA 24/7 Configurazione A3 & CE Holotype HLA 24/7 Configurazione A4 & CE H52 24 H56 24 H59 24 H53 24 Notare che la scatola componenti primer e la scatola componenti reagenti per preparazione librerie sono uguali per tutte le configurazioni del prodotto. Il componente piastra adattatori indicizzati a 96 pozzetti è diverso nelle varie configurazioni per quanto concerne la sequenza degli indici. Controllare la sezione Piastra adattatori con indice a 96 pozzetti per ulteriori informazioni. Scatola componenti primer La scatola dei componenti primer contiene soluzioni specifiche pronte all uso di primer per l amplificazione mirata tramite long-range PCR dei geni HLA A, B, C, DPB1, DQA1, DQB1 e DRB1. In aggiunta, essa contiene due tipi di additivi per PCR (Enhancer 1 e Enhancer 2). Primer mix N. RIF. Reaz. Vol./prov. N. prov. Codif. colore HLA-A P μl 1 Giallo HLA-B P μl 1 Rosso HLA-C P μl 1 Arancio HLA-DRB1 P μl 1 Verde HLA-DQB1 (serie 3) P μl 1 Blu HLA-DQA1 P μl 1 Marrone HLA-DPB1 P μl 1 Viola Enhancer 1 E μl 1 Trasparente Enhancer 2 E μl 1 Trasparente Pagina 8 49

9 Scatola componenti reagenti per preparazione librerie La scatola componenti preparazione librerie fornisce reagenti per la preparazione di librerie (frammentazione, riparazione blunt-end e adenilazione delle estremità degli ampliconi, ligazione di sequenze di adattatori indicizzati) a partire dagli ampliconi HLA. Reagente N. RIF. Reaz. Vol./prov. N. prov. Codif. colore Enz. framment. (A) R μl 1 Giallo Tampone Ffamment. (B) R μl 1 Rosso Enz. Riparaz. Estrem. (C) R μl 1 Verde Tamp. Riparaz. Estr. (D) R μl 1 Arancio Enz. ligazione (E) R μl 1 Blu Tamp. ligazione (F) R μl 2 Nero Piastra a 96 pozzetti con adattatori Il componente piastra a 96 pozzetti con adattatori indicizzati contiene adattatori indicizzati per NGS pronti all uso (oligonucleotidi DNA a doppio filamento) in 5 μl di soluzione per generare singole librerie per NGS. Questa piastra a 96 pozzetti con adattatori indicizzati contiene un numero di adattatori indicizzati sufficiente a generare 24 librerie NGS indipendenti e la successiva identificazione dei campioni. Tipo di prodotto Reagente associato N. RIF. Reaz. Holotype HLA 24/7 Configurazione A1 & CE (REF: H52) Holotype HLA 24/7 Configurazione A2 & CE (REF: H56) Holotype HLA 24/7 Configurazione A3 & CE (REF: H59) Holotype HLA 24/7 Configurazione A4 & CE (REF: H53) Workbook Excel Vol/ pozzetto N. di Piastre Piastra Adattatori A1 (i1-24) N μl 1 Piastra Adattatori A2 (i25-48) N μl 1 Piastra Adattatori A3 (i49-72) N μl 1 Piastra adattatori A4 (i73-96) N μl 1 Per facilitare il protocollo Holotype HLA 24/7 viene fornito un Workbook Excel completo di calcoli, layout piastre, registrazione dati, generazione del foglio campioni per MiSeq e molto altro. Se non ne avete una copia, contattate support@omixon.com. Pagina 9 49

10 Software Omixon HLA Twin Contattate per i crediti Omixon HLA Twin associati con il vostro acquisto del kit Holotype HLA 24/7. Nota importante: Si raccomanda l impiego combinato dei tre componenti del kit Omixon Holotype HLA 24/7 con il software Omixon HLA Twin per un processo diagnostico in vitro integrale. Consultate la Sezione Avvertenze e precauzioni circa le limitazioni d uso del prodotto. Sono disponibili componenti di ricambio previa apposita richiesta da parte dell utilizzatore. Omixon fornisce le confezioni complete di tutti i componenti, non flaconi singoli. Per maggiori informazioni contattate sales@omixon.com. Trasporto e conservazione Il prodotto viene spedito in scatole d imballo di polistirolo con ghiaccio secco e all arrivo dovrà essere conservato a -20 C. Siete pregati di convalidare il vostro processo di controllo e monitoraggio della temperatura dei congelatori e di effettuare interventi di manutenzione regolari. Se conservati a -20 C, i kit non aperti sono stabili fino alla data di scadenza (indicata sull etichetta del kit). Dopo l apertura, si raccomandano max. quattro (4) cicli di congelamento/ scongelamento per garantire la stabilità del prodotto. Se conservati a -20 C, i kit aperti sono stabili fino a 3 mesi. Avvertenze e precauzioni Limitazioni d uso del prodotto Per garantire prestazioni ottimali, usate il kit Holotype HLA 24/7 e il software Omixon HLA Twin per la tipizzazione dell HLA mediante NGS con i componenti, i reagenti e le attrezzature raccomandati nella sezione Apparecchiature e reagenti. L impiego di componenti e reagenti diversi da quelli specificati in questa sezione va verificato e validato dall utilizzatore. Non ricostituire né diluire i reagenti in volumi diversi da quelli descritti nelle presenti IFU. Non utilizzare volumi dei reagenti minori di quelli specificati. In caso contrario, potranno verificarsi degli errori di prestazione. Omixon non può fornire alcun supporto per eventuali problemi risultanti dal mancato rispetto delle fasi previste nel protocollo descritto nelle presenti IFU. In caso di danni visibili ai suoi componenti, non utilizzare il prodotto (flaconi o piastra danneggiati, tappi allentati, ecc.). Pagina 10 49

11 Limitazioni note del prodotto Consultare il documento Product Known Limitations Guide (Limitazioni note del prodotto) circa le ambiguità e le limitazioni del software note del prodotto Holotype HLA. Il documento è distribuita insieme alle IFU ed è anche disponibile sul sito web Omixon nella sezione MyHolotype/Support and Services/HLA Twin Instructions for Use, oppure può essere richiesta all indirizzo support@omixon.com. Informazioni per la sicurezza Prima di iniziare, leggere le sezioni Informazioni per la sicurezza e Note importanti circa reagenti o kit specificati in Apparecchiature, reagenti e forniture. Quando si lavora con sostanze chimiche, indossare sempre camici, guanti monouso e occhiali protettivi adatti. Per maggiori informazioni, consultare le schede di sicurezza (SDS) reperibili presso i rispettivi fornitori. Una panoramica dei componenti chimici dei reagenti del prodotto può essere desunta dagli SDS del kit Holotype HLA 24/7, disponibili su richiesta. I componenti del prodotto vanno smaltiti come rifiuti medici generici. Parametri di prestazione Principali parametri di prestazione stabiliti in base alla validazione del prodotto. HLA-A HLA-B HLA-DRB1 HLA-C HLA-DPB1 HLA-DQA1 HLA-DQB1 Sensibilità 99,054% 99,171% 98,335% 96,310% 98,818% 98,927% 95,724% Specificità 99,966% 99,982% 99,956% 99,863% 99,946% 99,881% 99,775% Precisione 99,054% 99,171% 98,335% 96,310% 98,818% 98,927% 95,724% Accuratezza 99,935% 99,965% 99,915% 99,736% 99,897% 99,785% 99,572% Riproducibilità 100,00% 100,00% 99,28% 100,00% 99,28% 100,00% 99,28% Ripetibilità 100,00% 100,00% 100,00% 100,00% 100,00% 100,00% 100,00% Assistenza tecnica Per assistenza generale su questo protocollo contattate support@omixon.com Supporto Telefonico: Stati Uniti +1 (617) Europa Resto del Mondo +1 (617) Pagina 11 49

12 Apparecchiature, reagenti e forniture Raccomandazioni tecniche e sulle apparecchiature Termociclatore con blocco a 96 pozzetti Fluorimetro per piastre (o qualsiasi strumento in grado di rilevare fluorescenza da piastra a 96 pozzetti, da utilizzare in combinazione con il sistema Promega QuantiFluor dsdna) Pippin Prep (Cat# PIP0001) o Blue Pippin (Cat# BLU0001) della SAGE Science Strumento per qpcr con formato per piastre a 96 o 384 pozzetti Fluorimetro Qubit (n. cat. Q33216, Thermo Fisher Scientific) (opzionale) Illumina MiSeq (n. cat. SY ) PC 64-bit con min. 4 core e 16 GB di RAM Spazio di archiviazione dati a lungo termine (circa 2 TB di dati per MiSeq all anno) Raccomandazioni sui reagenti associati Kit per long-range PCR della Qiagen (n. cat , o ) Ciascun campione richiede 3,2 μl di Taq polimerasi Il kit per long-range PCR (n. cat ) (20) contiene 8 μl di Taq polimerasi Il kit per long-range PCR (n. cat ) (100) contiene 40 μl di Taq polimerasi Il kit per long-range PCR (n. cat ) (250) contiene 100 μl di Taq polimerasi ExoSAP-IT della Affymetrix (n. cat , ML, X-1ML o ML) Ciascun campione combinato in pool richiede 4 μl di enzima ExoSAP-IT Il n. cat contiene 200 μl di enzima ExoSAP-IT Express Il n. cat ML contiene 1 ml di enzima ExoSAP-IT Express Il n. cat X-1ML contiene 4 ml di enzima ExoSAP-IT Express Il n. cat ML contiene 10 ml di enzima ExoSAP-IT Express Kit per Quantificazione Libreria Illumina/Universal della KAPA Biosystems (n. cat. KK4824) Kit per Saggi Qubit dsdna BR (n. cat. Q32850 o Q32853) (opzionale) Il n. cat. Q32850 contiene 100 saggi Il n. cat. Q32853 contiene 500 saggi QuantiFluor dsdna System della Promega (n. cat. E2670) Biglie Agencourt AMPure XP della Beckman Coulter (n. cat. A63880, A63881 o A63882) Ogni sequenziamento Holotype HLA richiede un massimo di 900 μl di biglie AMpure XP Il n. cat. A63880 contiene 5 ml di biglie AMPure XP Il n. cat. A63881 contiene 60 ml di biglie AMPure XP Il n. cat. A63882 contiene 450 ml di biglie AMPure XP Cassetta gel, 1,5% di agarosio, senza colorante con standard interno (Marker K/R2), per Pippin Prep/Blue Pippin (n. cat. CDF1510 per Pippin Prep e BDF1510 per Blue Pippin) Etanolo per uso in biologia molecolare (alcol anidro) Acqua per uso in biologia molecolare (priva di DNasi e RNasi) Idrossido di sodio Tampone TE 1 (ph 8,0) Kit Reagenti MiSeq della Illumina Pagina 12 49

13 Capacità Kit Reagenti MiSeq Kit reagenti Illumina MiSeq Std 500 Cycle (MS ) Std 300 Cycle (MS ) Micro 300 Cycle (MS ) Nano 500 Cycle (MS ) Nano 300 Cycle (MS ) Tempo Ore Campioni 24/7 ~39 24 ~24 24 ~19 24 ~28 12 ~17 6 Attrezzature consigliate Provette per microcentrifuga da 1,5 ml Provette low-bind per microcentrifuga da 1,5 ml Provette low-bind per microcentrifuga da 2,0 ml (raccomandata Eppendorf DNA LoBind Cat# ) Provette a parete sottile da 0,5 ml per lo strumento Qubit (raccomandate Qubit Assay tubes Cat# Q32856) Pipette a volume regolabile (capacità 1, μl) Pipette 8 canali a volume regolabile (capacità 1,0 100 μl) Piastre a 96 pozzetti compatibili con il termociclatore Piastre ottiche a 96 pozzetti compatibili con il fluorimetro per piastre Piastre a 96 pozzetti compatibili con lo strumento qpcr Pellicole sigillanti per piastre per uso generale Pellicole sigillanti per piastre compatibili con i termociclatori (testate per long-range PCR) Pellicole sigillanti per piastre ottiche compatibili con lo strumento qpcr (opzionali) Supporto magnetico per provette da microcentrifuga da 2 ml Rack refrigeranti a 96 pozzetti (2 pezzi) Provette coniche da 50 ml Reservoir da 50 ml Pagina 13 49

14 Avviso legale Le IFU relative a Holotype HLA 24/7 e il rispettivo contenuto sono di proprietà di Omixon Biocomputing Limited ( Omixon ), e sono destinate unicamente all'uso da parte del cliente del prodotto o prodotti ivi descritti come previsto dal contratto e a nessun altro scopo. Il presente documento e il suo contenuto non dovranno essere utilizzati né distribuiti per nessun altro scopo né divulgati, descritti o riprodotti in altro modo senza il consenso scritto di Omixon. Con il presente documento, Omixon non trasferisce alcuna licenza di sfruttamento del suo brevetto, marchio, copyright, né alcun diritto tutelato dalla legge o diritti simili di terze parti. Omixon HLA Twin ( Software ) è concesso in licenza al cliente nei termini e condizioni della Omixon HLA Twin EULA ( In caso di mancata accettazione dei termini e delle condizioni qui riportati, Omixon non vi rilascia la licenza e non vi autorizza a utilizzare né a installare il Software. Le istruzioni fornite nel presente documento devono essere osservate scrupolosamente ed esplicitamente da personale qualificato e opportunamente addestrato per garantire l'uso corretto e sicuro dei prodotti qui descritti. Prima di utilizzare tali prodotti, il presente documento deve essere letto e compreso in tutte le sue parti. QUALORA IL DOCUMENTO NON VENGA LETTO INTEGRALMENTE E OSSERVATO ESPLICITAMENTE, TUTTE LE ISTRUZIONI IN ESSO CONTENUTE POSSONO COMPORTARE DANNEGGIAMENTO DEI PRODOTTI, LESIONI ALLE PERSONE, INCLUSI UTILIZZATORI O TERZE PERSONE, E DANNI AD ALTRE PROPRIETÀ. OMIXON NON SI ASSUME ALCUNA RESPONSABILITÀ DERIVANTE DA UN USO IMPROPRIO DEI PRODOTTI DESCRITTI QUI (INCLUSE LORO PARTI O SOFTWARE) O DA QUALSIASI USO DI ESSI NON PREVISTO DALLE AUTORIZZAZIONI E PERMESSI SCRITTI ED ESPLICITI CONCESSI DA OMIXON IN RELAZIONE ALL'ACQUISIZIONE DI TALI PRODOTTI DA PARTE DEL CLIENTE. PER USO DIAGNOSTICO IN VITRO 2017 Omixon Biocomputing Ltd. Tutti i diritti riservati. Destinazione d uso Il prodotto Holotype HLA 24/7 Configurazione A1 & CE / A2 & CE / A3 & CE / A4 & CE (designato Holotype HLA ) è una combinazione di reagenti per test diagnostici in vitro e un software per l'analisi di dati (Omixon HLA Twin ) ed è destinato all'identificazione e alla definizione di Antigeni Leucocitari Umani (HLA) di classe I e II e alla tipizzazione HLA con l impiego della piattaforma di sequenziamento di nuova generazione (Next Generation Sequencing, NGS) Illumina MiSeq. Holotype HLA fornisce informazioni sull istocompatibilità umana dei loci HLA di classe I (A, B e C) e II (DPB1, DQA1, DQB1 e DRB1) impiegando DNA genomico umano. Pagina 14 49

15 Il software Omixon HLA Twin incluso nel prodotto Holotype HLA serve a interpretare e conciliare i dati di sequenziamento generati sul sistema Illumina MiSeq, consentendo una precisa tipizzazione HLA a livello allelico in un solo passaggio, con percentuale di ambiguità molto bassa al 2 campo. Il prodotto Holotype HLA è previsto per uso diagnostico in vitro da parte di operatori sanitari, come tecnici di laboratorio e medici, preparati nel campo della tipizzazione HLA in laboratori diagnostici accreditati EFI o ASHI o in grado di lavorare in accordo con le specifiche EFI o ASHI. Nota importante prima di iniziare Raccomandazione circa l estrazione di DNA genomico Il DNA genomico umano dovrà essere preparato utilizzando kit per la preparazione del DNA ben collaudati, disponibili in commercio, che ne garantiscano la coerenza. Indipendentemente dall'approccio, per avere risultati solidi è necessario che la concentrazione e la purezza siano determinate in modo accurato. Il DNA dev'essere privo di contaminanti che possano successivamente influenzarne l amplificazione, la preparazione delle librerie e le fasi di sequenziamento (es. alcol, sali, tensioattivi, formaldeide ed eparina). Il sangue non va raccolto in provette eparinizzate e non si dovranno utilizzare campioni di sangue provenienti da pazienti in terapia con eparina né campioni lipemici o emolizzati. Il DNA genomico estratto può essere usato immediatamente se disciolto in acqua priva di nucleasi, o conservato per lunghi periodi a -20 C o a temperature inferiori. Si consiglia l uso di acqua per la preparazione del gdna, poiché l EDTA nel buffer TE può inibire le reazioni della long-range PCR. Per ridurre la degradazione vanno evitati cicli ripetuti di gelo-disgelo. Al fine di ottenere ng di DNA genomico di partenza per ogni amplificazione mediante PCR, è altamente raccomandata una concentrazione pari a ng/μl di DNA. È altamente raccomandato l impiego di un metodo di quantificazione mediante fluorescenza al fine di determinare la concentrazione di gdna. Sono altamente raccomandati valori del rapporto di assorbanza di 260 nm/280 nm e 260 nm/ 230 nm pari a 1,7 2. Per l amplificazione di HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DRB1, HLA-DPB1, HLA-DQA1 e HLA-DQB1, sono richiesti 0,8-1,2 µg di gdna. Principio del metodo Per molti anni, la comunità HLA ha lavorato allo sviluppo di un metodo per caratterizzare con precisione l'elevato polimorfismo dei geni HLA e dei loro prodotti. L'avvento della PCR, combinata con altre tecnologie (sequenziamento di Sanger, SSOP, SSP, Luminex), ha consentito di migliorare significativamente il rilevamento di polimorfismi HLA, sebbene con diverse limitazioni che impediscono di caratterizzare esaurientemente i geni HLA. Le tecnologie sviluppate nel corso degli ultimi anni, designate collettivamente sequenziamento di nuova generazione (NGS), hanno Pagina 15 49

16 offerto nuove opportunità che consentono la caratterizzazione completa dei geni HLA in modalità aploide. L'NGS ha due caratteristiche importanti: 1) il sequenziamento clonale di frammenti di DNA, e 2) la produttività elevatissima. L'NGS consente di stabilire la fase dei polimorfismi, eliminando così tutte le ambiguità, e consente la tipizzazione HLA al 3 o 4 campo senza test reflex, in tal modo introducendo un approccio potenzialmente risolutivo al problema della tipizzazione HLA. Il protocollo descritto qui sfrutta questa tecnologia e combina l amplificazione mediante long-range PCR di geni HLA con il sequenziamento sulla piattaforma Illumina MiSeq. Più in particolare, i geni HLA A, B, C, DQA1 e DQB1 vengono amplificati per l'intera lunghezza codificante, incluse le UTR delle estremità 5 e 3, mentre il gene DRB1 viene amplificato dall'introne 1 all'introne 4 e il gene DPB1 viene amplificato dall'introne 1 alla UTR 3. Gli ampliconi vengono quindi processati attraverso una serie di fasi: 1. frammentazione degli ampliconi a una dimensione appropriata per il sequenziamento sulla piattaforma Illumina, 2. riparazione blunt-end e adenilazione delle estremità degli ampliconi frammentati 3. ligazione di sequenze adattatrici che vengono usate nell'intero processo sul MiSeq per catturare, amplificare e sequenziare il DNA. Gli adattatori includono anche un indice costituito da una breve sequenza, univoca per ciascun adattatore, che identifica il materiale di partenza della libreria (campione/locus). Dopo la combinazione delle librerie indicizzate in un unico pool, la selezione dimensionale e la quantificazione, il campione viene caricato sul MiSeq per il sequenziamento. L'intero processo richiede 3-5 giorni, a seconda della scelta del tipo di cella a flusso della piattaforma Illumina. Il sommario delle fasi del protocollo è riportato nella figura sotto: Pagina 16 49

17 Sommario delle Fasi TEMPO NECESSARIO: 0H 45, TEMPO TOTALE: 0H 45 TEMPO NECESSARIO: 0H 45, TEMPO TOTALE: 6H 45 TEMPO NECESSARIO: 0H 35, TEMPO TOTALE: 0H 35 TEMPO NECESSARIO: 0H 55, TEMPO TOTALE: 3H TEMPO NECESSARIO: 0H 15, TEMPO TOTALE: 1H TEMPO NECESSARIO: 0H 15, TEMPO TOTALE: 1H 15 TEMPO NECESSARIO: 0H 20, TEMPO TOTALE: 23H TEMPO NECESSARIO: 0H 0, TEMPO TOTALE: 6H Pagina 17 49

18 Glossario/Definizioni Piastra ampliconi Nome alternativo della piastra di amplificazione. Piastra quantificazione ampliconi piastra a 96 pozzetti compatibile con il fluorimetro per piastre in cui gli ampliconi diluiti vengono quantificati. Piastra amplificazione Piastra a 96 pozzetti per PCR usata per amplificare i loci HLA. Libreria finale Libreria che include tutte le librerie campioni pronte per essere sequenziate in una singola corsa su MiSeq Piastra di reazione Piastra in cui vengono condotte le successive reazioni di frammentazione, riparazione blunt-end/adenilazione e ligazione degli adattatori indicizzati alle librerie campioni Piastra reagenti Serve per aliquotare i vari reagenti usati per preparare le librerie Libreria campioni Una libreria preparata combinando in pool tutti i loci HLA per un dato campione Piastra librerie campioni: Piastra contenente una libreria campioni (tutti i loci combinati) per pozzetto Piastra quantificazione standard Piastra a 96 pozzetti compatibile con il fluorimetro per piastre in cui vengono posti gli standard di DNA per consentire la quantificazione degli ampliconi. Pagina 18 49

19 Fase 1 Preparazione master mix per amplificazione HLA Durata: ~45 minuti Lo scopo di questa fase è preparare master mix locus-specifiche per amplificare individualmente ognuno dei locus HLA desiderati. I loci amplificati per mezzo di questo protocollo sono HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DRB1, HLA-DPB1, HLA-DQA1 e HLA-DQB1. Nota: Le master mix preparate in questa fase includono tutti i reagenti necessari per l'amplificazione a eccezione della miscela di Taq polimerasi Elenco reagenti Componente Conservazione Provenienza Primer mix HLA-A -20 C Omixon Primer mix HLA-B -20 C Omixon Primer mix HLA-C -20 C Omixon Primer mix HLA-DRB1-20 C Omixon Primer mix HLA-DPB1-20 C Omixon Primer mix HLA-DQA1-20 C Omixon Primer mix HLA-DQB1 serie 3-20 C Omixon Enhancer 1-20 C Omixon Enhancer 2-20 C Omixon Tampone long-range PCR (10 ) -20 C Qiagen dntp (10 mm ciascuno) -20 C Qiagen H 2 O per uso in biologia molecolare -20 C Qiagen Protocollo 1.1. Prelevare tutte le miscele di primer, gli Enhancer 1 e 2, i dntp e il tampone per long-range PCR (10 ) dal luogo di conservazione e lasciare scongelare a temperatura ambiente Preparare l Enhancer combinato: aggiungere 132 μl di Enhancer 2 nella provetta contenente Enhancer 1. Rietichettare la provetta Enhancer 1 con Enhancer combinato Preparare una master mix per ciascuna primer mix secondo le tabelle riportate di seguito: Master mix: HLA-A, B, C, DRB1, DPB1 e DQA1 Reagente Volume/campione/locus Volume/24 campioni/locus Primer mix 2 μl 51 μl Tampone long-range PCR (10 ) 2,5 μl 63,8 μl dntp mix (10 mm ciascuno) 1,25 μl 31,9 μl H 2 O per uso in biologia molecolare 13,85 μl 353,2 μl Volume totale 19,6 μl 499,9 μl Pagina 19 49

20 Master mix: HLA-DQB1 serie 3 Reagente Volume/campione/locus Volume/24 campioni/locus Primer mix 2 μl 51 μl Tampone long-range PCR (10 ) 2,5 μl 63,8 μl dntp mix (10 mm ciascuno) 1,25 μl 31,9 μl Enhancer combinato 5,6 μl 142,8 μl H 2 O per uso in biologia molecolare 7,85 μl 200,2 μl Volume totale 19,2 μl 489,7 μl 1.4. Agitare mediante vortex ciascuna master mix e centrifugare per 1 secondo. Mettere le master mix su ghiaccio Diluire tutti i gdna fino a una concentrazione di ng/μl (il volume minimo è 45 μl). Nota: Holotype HLA include reagenti sufficienti per 24 reazioni più un volume addizionale per compensare perdite di pipettamento e amplificazioni fallite. Pagina 20 49

21 Fase 2 Amplificazione HLA classe I e II Durata: ~6 ore e 45 minuti Lo scopo della Fase 2 è amplificare i loci HLA. Le amplificazioni di HLA classe I e classe II sono state ottimizzate utilizzando due set distinti di condizioni PCR. Una volta completate le reazioni di PCR, l amplificazione viene verificata mediante elettroforesi su gel di agarosio (opzionale). Suggerimento Benché l elettroforesi su gel di agarosio sia raccomandata, essa non è necessaria per completare con successo il protocollo Holotype HLA. Nella fase di quantificazione degli ampliconi (Fase 3), qualsiasi concentrazione superiore a 50 ng/μl è considerata un amplificazione riuscita. L elettroforesi su gel di agarosio rappresenta una fase importante di controllo della qualità e non deve essere omessa se non si ha sufficiente esperienza con il protocollo completo Holotype HLA. Elenco reagenti Componente Conservazione Provenienza Master mix HLA-A -20 C Fase 1 Master mix HLA-B -20 C Fase 1 Master mix HLA-C -20 C Fase 1 Master mix HLA-DRB1-20 C Fase 1 Master mix HLA-DPB1-20 C Fase 1 Master mix HLA-DQA1-20 C Fase 1 Master mix HLA-DQB1 serie 3-20 C Fase 1 Taq polimerasi -20 C Qiagen gdna 4 C Utilizzatore H 2 O per uso in biologia molecolare 20 C Utilizzatore Protocollo 2.1 Prelevare l'enzima Taq polimerasi dal luogo di conservazione, centrifugarlo e aggiungerlo a ciascuna master mix secondo le tabelle riportate sotto, sciacquando a fondo i puntali pipettando su e giù: Master mix più Taq polimerasi: HLA-A, B, C, DRB1, DPB1 e DQA1 Reagente Volume/campione/locus Volume/24 campioni/locus Master mix da fase 1 19,6 μl 499,9 μl Taq polimerasi 0,4 μl 10,2 μl Totale 20 μl 510,1 μl Pagina 21 49

22 Master mix più Taq polimerasi: HLA-DQB1 serie 3 Reagente Volume/campione/locus Volume/24 campioni/locus Master mix da fase 1 19,2 μl 489,7 μl Taq polimerasi 0,8 μl 20,4 μl Totale 20 μl 510,1 μl 2.2 Agitare mediante vortex per breve tempo e centrifugare tutte le master mix con le Taq polimerasi. Pipettare 20 μl di ciascuna master mix con le Taq polimerasi nelle singole posizioni delle piastre PCR a 96 pozzetti. Nota: Le amplificazioni di classe I e classe II sono state ottimizzate utilizzando due programmi di PCR differenti, quindi le master mix di classe I e classe II non dovranno essere poste nella stessa piastra. 2.3 Aggiungere 5 μl di ciascun gdna diluito nel pozzetto appropriato delle piastre preparate nella fase precedente. Miscelare mediante pipettamento. Sigillare con una pellicola termica e ispezionare visivamente ciascun pozzetto. Centrifugare tutte le piastre per amplificazione in una centrifuga. 2.4 Posizionare le piastre per amplificazione nel termociclatore ed avviare i programmi per amplificazione di classe I e classe II come indicato nelle tabelle riportate sotto: Amplificazione classe I (HLA-A, B e C) Numero di cicli Temperatura Tempo 1 95 C 3 minuti 95 C 15 secondi C 30 secondi 68 C 5 minuti 1 68 C 10 minuti 1 4 C Amplificazione classe II (HLA-DRB1, DPB1, DQA1 e DQB1) Numero di cicli Temperatura Tempo 1 95 C 3 minuti 93 C 15 secondi C 30 secondi 68 C 9 minuti 1 68 C 10 minuti 1 4 C Pagina 22 49

23 Nota: Verificare il buon esito dell'amplificazione facendo correre 2 μl di ciascun amplicone in un gel di agarosio standard al 2% a 250 V per 30 minuti. (Opzionale) Dimensioni previste ampliconi Locus HLA Dimensioni previste ampliconi (kb) HLA-A, B e C ~3 HLA-DRB1 ~4,3 HLA-DPB1 ~6,6 HLA-DQA1 ~5,5 HLA-DQB1 (serie 3) ~6,5 È possibile interrompere la metodica in modo sicuro un questa fase. Gli ampliconi possono essere conservati a 4 C per una notte o a -20 C per più tempo. Pagina 23 49

24 Fase 3 Quantificazione e normalizzazione ampliconi (utilizzando un fluorimetro per piastre) Durata: ~35 minuti Si raccomanda di eseguire la quantificazione e normalizzazione ampliconi per garantire la precisione della quantità di materiale di partenza nelle fase di preparazione della libreria (opzionale). La concentrazione degli ampliconi viene misurata utilizzando il sistema QuantiFluor dsdna, che contiene un colorante fluorescente in grado di legarsi al DNA ed uno standard di DNA per la quantificazione precisa di piccole quantità di DNA a doppio filamento (dsdna). Per istruzioni su come effettuare la quantificazione di ampliconi utilizzando uno strumento per qpcr consultare l'appendice 2. Suggerimento Benché la quantificazione ampliconi sia raccomandata, essa non è necessaria per completare con successo il protocollo Holotype HLA. La normalizzazione ampliconi non richiede una misura precisa della concentrazione degli ampliconi. In alternativa, potete utilizzare una stima delle concentrazioni degli ampliconi basata sull esperienza o sull elettroforesi su gel di agarosio. La quantificazione ampliconi rappresenta una fase importante di controllo della qualità e non deve essere omessa se non si ha sufficiente esperienza con il protocollo completo Holotype HLA. Elenco reagenti Componente Conservazione Provenienza Piastra amplificazione classe I 4 C Fase 2 Piastra amplificazione classe II 4 C Fase 2 Standard di Lambda DNA (100 ng/μl) 4 C Promega Colorante QuantiFluor dsdna (200 ) 4 C Promega Tampone TE 20 (ph 7,5) 4 C Promega H 2 O per uso in biologia molecolare 20 C - 25 C Utilizzatore ExoSAP-iT Express -20 C Affymetrix Pagina 24 49

25 Protocollo 3.1 Preparare gli standard di DNA mediante diluizione seriale dello standard di Lambda DNA (100 ng/μl) fornito nel kit QuantiFluor secondo la tabella di diluizione riportata sotto: Etichetta sulla provetta DNA di partenza Vol. di DNA (μl) Vol. di TE 1x (μl) Conc. finale (ng/μl) Standard 1 Lambda DNA 7,5 μl 492,5 μl 1,5 ng/μl Standard 2 Standard μl 250 μl 0,75 ng/μl Standard 3 Standard μl 250 μl 0,38 ng/μl Standard 4 Standard μl 250 μl 0,19 ng/μl Standard 5 Standard μl 250 μl 0,09 ng/μl Standard 6 Standard μl 250 μl 0,05 ng/μl Bianco Bianco 0 μl 250 μl 0 ng/μl 3.2 Preparare le piastre per quantificazione ampliconi (vedere figure supplementari). Aggiungere aliquote di 99 μl di tampone TE 1 a ciascun pozzetto della piastra ottica a 96 pozzetti per il numero totale di ampliconi da quantificare. 3.3 Aggiungere 1 μl di amplicone di ciascun pozzetto delle piastre ampliconi ai pozzetti corrispondenti delle piastre per quantificazione ampliconi. Miscelare mediante pipettamento. 3.4 Preparare una soluzione di lavoro di QuantiFluor Dye 1 utilizzando la formula seguente: 0,5 μl di QuantiFluor Dye (200X) + 99,5 μl di tampone TE 1. Preparare sufficiente QuantiFluor Dye 1 affinché ciascun campione (di tutti quelli nelle piastre ampliconi) e standard (in totale 14) riceva un'aliquota pari a 100 μl. 3.5 Preparare una piastra per quantificazione standard e piastre per quantificazione ampliconi. Aggiungere aliquote di 100 μl di soluzione di lavoro di QuantiFluor Dye 1 nelle varie posizioni delle piastre ottiche a 96 pozzetti che si useranno come piastra quantificazione standard e alle piastre quantificazione ampliconi preparate nella fase Utilizzando gli standard preparati sopra, aggiungere 100 μl di ciascuno standard, in duplicato, a pozzetti individuali nella piastra quantificazione standard (totale 14 pozzetti). Miscelare mediante pipettamento. 3.7 Miscelare agitando accuratamente mediante vortex e centrifugare. 3.8 Effettuare la lettura della piastra quantificazione standard e delle piastre quantificazione ampliconi sul fluorimetro. 3.9 Calcolare la concentrazione di DNA nelle piastre quantificazione ampliconi utilizzando i valori di RFU letti. Fare riferimento alla tabella diluizione nel workbook fornito per assistenza nei calcoli. Pagina 25 49

26 3.10 Diluire il DNA nelle piastre ampliconi con H 2 O per uso in biologia molecolare in modo che la concentrazione finale di DNA sia approssimativamente pari a 67 ng/μl. Se la concentrazione di DNA è 150 ng/μl o maggiore: aggiungere 25 μl di H 2 O Se la concentrazione di DNA è ng/μl: aggiungere 10 μl di H 2 O Se la concentrazione di DNA è minore di 100 ng/μl: non aggiungere H 2 O. Combinazione ampliconi 3.11 Combinare tutti i loci per ciascun campione in un'unica piastra ampliconi. Combinare i volumi indicati da ciascun locus per ottenere un volume finale di 35 μl secondo la tabella riportata sotto: Locus HLA A B C DRB1 DPB1 DQA1 DQB1 serie 3 Volume combinato 5 μl 5 μl 5 μl 5 μl 5 μl 5 μl 5 μl 3.12 Aggiungere 4 μl di ExoSAP-iT Express in ciascuna libreria campioni. Sciacquare bene i puntali pipettando su e giù. Sigillare la piastra con una pellicola termica e centrifugare Posizionare le piastre ampliconi in un termociclatore ed eseguire il seguente programma: Purificazione PCR ExoSAP-IT Express Numero di cicli Temperatura Tempo 1 37 C 4 minuti 1 80 C 1 minuto 1 4 C È possibile interrompere la metodica in modo sicuro un questa fase. Gli ampliconi possono essere conservati a 4 C per una notte o a -20 C per più tempo. Pagina 26 49

27 Fase 4 Preparazione libreria Durata: ~3 ore Durante questa fase, gli ampliconi combinati vengono preparati per il sequenziamento su Illumina MiSeq. Gli ampliconi vengono frammentati per via enzimatica, le estremità vengono riparate e adenilate, e gli adattatori indicizzati vengono ligati alle estremità. Successivamente, le librerie vengono combinate e sottoposte ad un'unica fase di purificazione e concentrazione utilizzando biglie AMPure XP. Nota: Omixon raccomanda volumi maggiori di quelli necessari per 24 campioni in quanto molti degli enzimi e tamponi sono viscosi e si rischia un eccessiva perdita di materiale nel corso dei pipettamenti. Elenco reagenti Componente Conservazione Provenienza Piastra ampliconi combinati 4 C Fase 3 Enz. framment. (A) -20 C Omixon Tampone Ffamment. (B) -20 C Omixon Enz. Riparaz. Estrem. (C) -20 C Omixon Tamp. Riparaz. Estr. (D) -20 C Omixon Enz. ligazione (E) -20 C Omixon Tamp. ligazione (F) -20 C Omixon Piastra adattatori -20 C Omixon Biglie AMPure XP 4 C Beckman Coulter Etanolo all 80% (fresco) 20 C - 25 C Utilizzatore H 2 O per uso in biologia molecolare 20 C - 25 C Utilizzatore Protocollo 4.1 Accendere il termociclatore. Verificare che il coperchio riscaldato si stia riscaldando. Nota: Accertarsi di agitare accuratamente mediante vortex l enzima di frammentazione (A) prima dell uso. 4.2 Preparare il master mix per frammentazione secondo la tabella sotto: Pagina 27 49

28 Master mix frammentazione Reagente Volume per libreria (μl) Volumi raccomandati per 24 librerie (μl) Codif. colore Enz. framment. (A) 2 μl 55,2 μl Giallo Tampone Ffamment. (B) 2 μl 55,2 μl Rosso Volume totale 4 μl 110,4 μl 4.3 Preparare una piastra reagenti: porre una nuova piastra PCR a 96 pozzetti su un rack refrigerante per PCR e aggiungere la stessa quantità delle master mix per frammentazione a ciascun pozzetto di un unica colonna. Nota: La reazione di frammentazione è stata studiata per garantire DNA di lunghezza ideale per il sequenziamento su Illumina MiSeq. È importante mantenere i reagenti freddi fino a che la reazione viene avviata nel termociclatore per prevenire una frammentazione eccessiva. Si raccomanda l uso di pipette multicanale per ridurre al minimo le probabilità che si verifichi una frammentazione eccessiva. 4.4 Centrifugare la piastra ampliconi combinati per 10 secondi e porla su ghiaccio o su un blocco refrigerato. 4.5 Preparare una piastra di reazione: porre una piastra PCR a 96 pozzetti nuova su un blocco refrigerato. 4.6 Aggiungere 4 μl di master mix per frammentazione dalla piastra reagenti ai pozzetti della piastra di reazione corrispondenti ai campioni nella piastra ampliconi combinati. Si raccomanda l uso di una pipetta multicanale. 4.7 Trasferire 16 μl di ciascun amplicone dalla piastra ampliconi combinati al pozzetto corrispondente sulla piastra di reazione utilizzando una pipetta multicanale. Miscelare mediante pipettamento. 4.8 Coprire la piastra di reazione con una pellicola termica e centrifugare per 10 secondi. 4.9 Incubare la piastra di reazione in un termociclatore con il seguente programma: Programma frammentazione Numero di cicli Temperatura Tempo 1 37 C 10 minuti 1 70 C 15 minuti 1 4 C È possibile interrompere la metodica in modo sicuro un questa fase. Le librerie possono essere conservate a 4 C per una notte o a -20 C per più tempo Preparare la master mix per la riparazione estremità secondo la tabella riportata sotto: Pagina 28 49

29 Master mix riparazione estremità Reagente Volume per libreria (μl) Volumi raccomandati per 24 librerie (μl) H 2 O per uso in biologia molecolare 1,25 μl 34,8 μl Codif. colore Enz. Riparaz. Estrem. (C) 1,25 μl 34,8 μl Verde Tamp. Riparaz. Estr. (D) 2,5 μl 69,6 μl Arancio Volume totale 5 μl 139,2 μl 4.11 Aggiungere aliquote di master mix per riparazione estremità in una unica colonna inutilizzata della piastra reagenti Centrifugare la piastra di reazione (contenente i campioni frammentati) per 10 secondi. Aggiungere 5 μl di master mix per riparazione estremità dalla piastra reagenti in ciascun pozzetto della piastra di reazione. Si raccomanda l uso di una pipetta multicanale. Miscelare mediante pipettamento Coprire la piastra di reazione con una pellicola termica e centrifugare per 10 secondi Incubare la piastra di reazione in un termociclatore con il seguente programma: Programma riparazione estremità Numero di cicli Temperatura Tempo 1 20 C 30 minuti 1 70 C 5 minuti 1 4 C È possibile interrompere la metodica in modo sicuro un questa fase. Le librerie possono essere conservate a 4 C per una notte o a -20 C per più tempo Prelevare la piastra adattatori indicizzati dal luogo di conservazione e far scongelare a temperatura ambiente subito dopo l'avvio del programma riparazione estremità nel termociclatore. Quando la piastra adattatori è a temperatura ambiente, centrifugarla per 3 minuti a 3000 giri/minuto Staccare con cautela la pellicola sigillante dalla piastra adattatori. Dopo aver rimosso la pellicola sigillante, non agitare la piastra adattatori per evitare contaminazioni incrociate Trasferire l'intero volume di ciascun pozzetto dalla piastra di reazione (25 μl) nel pozzetto corrispondente nella piastra adattatori. Pagina 29 49

30 Nota: Se NON si prevede di utilizzare l'intera piastra adattatori, è possibile utilizzare soltanto il numero necessario di adattatori. Tagliare la pellicola sigillante della piastra tra i pozzetti da utilizzare e i pozzetti da conservare. Staccare con cautela la pellicola sigillante dalla piastra adattatori, lasciando la pellicola in posizione sui pozzetti da conservare. a. Trasferire 25 μl da ciascun campione sottoposto a riparazione delle estremità della piastra di reazione a un pozzetto nella piastra adattatori, miscelando accuratamente con una pipetta. b. Trasferire la totalità di ciascun campione dalla piastra adattatori nel pozzetto originale della piastra di reazione. c. Sigillare nuovamente la piastra adattatori e riportarla a -20 C. Per eseguire le fasi residue descritte nel manuale, utilizzare la piastra di reazione al posto della piastra adattatori Preparare la master mix per ligazione. Preparare master mix per ligazione sufficiente per ciascun campione. Master mix ligazione Reagente Volume (μl) Volumi raccomandati per 24 librerie (μl) Codif. colore Enz. ligazione (E) 2,5 μl 63,2 μl Blu Tamp. ligazione (F) 30 μl 757,5 μl Nero Volume totale 32,5 820,7 μl 4.19 Pipettare aliquote della master mix ligazione in una colonna inutilizzata della piastra reagenti. Si raccomanda l uso di una pipetta multicanale Aggiungere 32,5 μl di master mix ligazione in ciascun pozzetto della piastra di reazione. Si raccomanda l uso di una pipetta multicanale. Miscelare mediante pipettamento Coprire la piastra di reazione con una pellicola termica e centrifugare per 10 secondi Incubare la piastra di reazione nel termociclatore con il seguente programma: Programma ligazione Numero di cicli Temperatura Tempo 1 25 C 10 minuti 1 70 C 10 minuti 1 4 C È possibile interrompere la metodica in modo sicuro un questa fase. Le librerie possono essere conservate a 4 C per una notte o a -20 C per più tempo. Pagina 30 49

31 Combinazione e purificazione libreria 4.23 Attendere che le biglie AMPure XP raggiungano la temperatura ambiente. Accertarsi che esse siano omogenee (assenza di grumi o agglomerati). Preparare 5 ml freschi di etanolo all'80% (4 ml di EtOH + 1 ml di H 2 O) Creare la libreria combinando un'aliquota da ciascun amplicone combinato, cioè una libreria campione-specifica, in un unica provetta per microcentrifuga low-bind da 2,0 ml. a. Per 16 o più campioni Calcolare la quantità di ciascuna libreria campione da combinare insieme in una libreria singola di volume totale pari a 900 μl. Dividere i 900 μl per il numero di librerie campione. Questo è il volume dell'aliquota da prelevare da ciascuna libreria campione e da pipettare nella libreria. b. Per meno di 16 campioni Trasferire 60 μl di ciascuna libreria campione in una libreria Aggiungere 900 μl di biglie AMPure XP nella provetta della libreria, evitando di toccare la libreria con il puntale. Miscelare a fondo agitando tramite vortex e centrifugare brevemente. Non far separare le biglie. Incubare la libreria per 10 minuti a temperatura ambiente. Nota: Se nel pool finale vi sono meno di 900 μl di libreria, aggiungere una quantità equivalente di biglie AMPure XP. Il rapporto tra pool finale e biglie AMPure XP dovrà essere pari a 1: Inserire la provetta della libreria su un supporto magnetico e incubare per 10 minuti Lasciando bloccata la provetta sul supporto magnetico, rimuovere con cautela ed eliminare il surnatante, facendo attenzione a non toccare le biglie Lasciando bloccata la provetta sul supporto magnetico, aggiungere ~1,5 2 ml freschi di etanolo all'80% alla provetta della libreria. Il volume di etanolo aggiunto dovrà essere sufficiente a coprire le biglie. Nota: Aggiungere l'etanolo facendolo cadere sul lato della provetta opposto a quello dove si sono depositate le biglie Incubare la provetta della libreria a temperatura ambiente per 30 secondi; quindi rimuovere con cautela ed eliminare il surnatante Ripetere le fasi 4.28 e Centrifugare brevemente la provetta della libreria e rimetterla sul supporto magnetico con il coperchio aperto. Eliminare l'etanolo residuo con una pipetta. Non toccare le biglie. Pagina 31 49

32 Nota: Accertarsi che il pellet di biglie non contenga etanolo residuo. A tale scopo, può essere d aiuto ruotare la provetta su un supporto magnetico per eliminare l'etanolo senza agitare il pellet di biglie Far asciugare all'aria le biglie per 5-8 minuti sul supporto magnetico, fino a che il pellet di biglie è asciutto Rimuovere la provetta della libreria dal supporto magnetico ed eluire con 31 μl di acqua per uso in biologia molecolare. Non toccare le biglie con il puntale della pipetta, altrimenti vi rimangono attaccate Agitare mediante vortex la libreria per risospendere completamente le biglie. Se sulle pareti laterali rimangono delle goccioline, centrifugare per qualche secondo. Accertarsi che le biglie rimangano in sospensione Incubare la libreria a temperatura ambiente per 2 minuti Inserire la provetta della libreria sul supporto magnetico per 2 minuti Raccogliere la libreria: mantenendo la provetta della libreria finale nel supporto magnetico, trasferire 31 μl del surnatante in una nuova microprovetta low-bind da 1,5 ml. È possibile interrompere la metodica in modo sicuro un questa fase. Le librerie possono essere conservate a -20 C per periodi di tempo prolungati. Pagina 32 49

33 Fase 5 Scelta delle dimensioni della libreria Durata: ~1 ora La fase 5 procede alla scelta delle dimensioni della libreria proveniente dalla Fase 4 utilizzando il sistema Pippin Prep. Il Pippin Prep può selezionare automaticamente una gamma di dimensioni di frammenti di DNA ed eluirli in una camera di raccolta. Nota: Al posto del Pippin Prep è possibile utilizzare il Blue Pippin. Consultare l'appendice 1 per le istruzioni d'uso del Pippin Prep. Elenco reagenti Componente Conservazione Provenienza Cassetta gel d agarosio all 1,5%, senza colorante 20 C - 25 C Sage Science Miscela soluz. caricam. /marcatore (K) Pippin 4 C Sage Science Libreria combinata 4 C Fase 4 Nota: Il marcatore K va usato con il Pippin Prep. Il Blue Pippin usa il marcatore R2. Protocollo 5.1 Portare la soluzione di caricamento con marcatore K a temperatura ambiente. 5.2 Combinare 31 μl del pool con 10 μl di soluzione di caricamento con marcatore K. 5.3 Agitare mediante vortex e centrifugare. 5.4 Impostare il sistema Pippin Prep per raccogliere frammenti di DNA tra 650 e 1300 bps. Caricare il campione da 40 μl nella porta campione e avviare la corsa. La durata della corsa è di minuti. 5.5 Raccogliere l'intero contenuto (circa 40 μl) dalla porta di eluizione del Pippin Prep e trasferirlo in una nuova microprovetta low-bind da 1,5 ml. Questa è la libreria con frammenti selezionati per dimensione. È possibile interrompere la metodica in modo sicuro un questa fase. Le librerie possono essere conservate a -20 C per periodi di tempo prolungati. Pagina 33 49

34 Fase 6 Quantificazione della libreria con uno strumento qpcr Durata: ~1 ora e 15 minuti È necessario quantificare la libreria sottoposta a selezione dimensionale per garantire risultati ottimali con il sequenziatore Illumina MiSeq. La concentrazione della libreria coi frammenti selezionati può essere accuratamente misurata mediante qpcr. Opzionalmente, è possibile usare il kit Qubit dsdna BR e una macchina Qubit per misurare la concentrazione della libreria. Per tale protocollo, vedere l Appendice 3. Elenco reagenti Componente Conservazione Provenienza Primer Premix Illumina C KAPA Biosystems Master mix KAPA SYBR FAST qpcr 2-20 C KAPA Biosystems Std 1 (20,00 pm) -20 C KAPA Biosystems Std 2 (2,00 pm) -20 C KAPA Biosystems Std 3 (0,20 pm) -20 C KAPA Biosystems Std 4 (0,02 pm) -20 C KAPA Biosystems Standard DNA Illumina -20 C KAPA Biosystems H 2 O per uso in biologia molecolare 20 C - 25 C Utilizzatore Tampone TE 1 (ph 8,0) 20 C - 25 C Utilizzatore Libreria con frammenti selezionati 4 C Fase 5 Protocollo 1 Preparare la Primer Mix qpcr utilizzando il Primer Premix Illumina 10 e la Master Mix KAPA SYBR FAST qpcr 2 : Nota: I reagenti del kit KAPA SYBR FAST qpcr (Master Mix qpcr, Primer Premix e soluzioni ROX) vengono combinati quando si utilizza il kit per la prima volta. Questa soluzione combinata è stabile per almeno 30 cicli di congelamento/scongelamento. Consultare la documentazione KAPA per determinare se è raccomandata la ROX per lo strumento qpcr in dotazione. Primer mix qpcr Reagente Primer Premix Illumina 10 Master mix KAPA SYBR FAST qpcr 2 Volume totale Volume (ml) 1 ml 5 ml 6 ml Pagina 34 49

35 2 Preparare la master mix qpcr. Master mix qpcr Reagente Primer mix qpcr H 2 O per uso in biologia molecolare Volume totale Volume (μl) 228 μl 76 μl 304 μl 3 Preparare una diluizione seriale della libreria con frammenti selezionati. a. Preparare una diluizione 1:1000 aggiungendo 1 μl di Libreria con frammenti selezionati a 999 μl di tampone TE 1 (ph 8,0), sciacquando accuratamente il puntale della pipetta. Agitare mediante vortex e centrifugare. b. Preparare una diluizione 1:2000 aggiungendo 100 μl della diluizione 1:1000 a 100 μl di tampone 1 TE (ph 8,0). Agitare mediante vortex e centrifugare. 4 Preparare una piastra per quantificazione qpcr utilizzando una nuova piastra compatibile con il sistema qpcr in dotazione. 5 Pipettare 16 μl di Master Mix qpcr in triplicato per gli standard 1-4, la diluizione 1:1000 e la diluizione 1:2000 (vedere figure supplementari). 6 Aggiungere aliquote di 4 μl di standard 1-4, diluizione 1:1000 e diluizione 1:2000 ai pozzetti corrispondenti. 7 Sigillare la piastra quantificazione qpcr e centrifugarla per 10 secondi. Nota: Evitare di formare bolle nei pozzetti della piastra quantificazione qpcr. Se necessario, centrifugare per eliminare le bolle. 8 Impostare i triplicati di 1:1000 e 1:2000 come campioni bersaglio e definire gli standard (punti: 4, concentrazioni iniziali: 20 pm, diluizione: 1:10). Per determinare la concentrazione di DNA della libreria con frammenti selezionati, avviare il seguente programma sulla macchina qpcr: Numero di cicli Temperatura Tempo 1 95 C 5 minuti 25 (no curva di melting) 95 C 30 secondi 60 C 90 secondi (acquisizione dei dati) 9 Per convertire il risultato ottenuto dalla qpcr da una concentrazione in pm a nm, inserire i risultati in Media quantità dei due replicati della libreria nella scheda del Workbook Omixon denominata Quantificazione libreria. 10 Usando i volumi indicati nel workbook, diluire 10 μl della libreria con frammenti selezionati fino a una concentrazione di 2 nm con H 2 O sterile in una nuova microprovetta low-bind da 1,5 ml. Conservare a -20 C la restante libreria con frammenti selezionati. Pagina 35 49

36 È possibile interrompere la metodica in modo sicuro un questa fase. Le librerie possono essere conservate a -20 C per periodi di tempo prolungati. In caso di conservazione per periodi prolungati, si raccomanda vivamente di effettuare una riquantificazione della libreria prima di caricarla su MiSeq. Pagina 36 49

37 Fase 7 Sequenziamento su Illumina MiSeq Durata: ~24 ore Illumina MiSeq è uno strumento per NGS automatizzato in grado di sequenziare la libreria con frammenti selezionati preparata nelle fasi precedenti. Al termine della corsa di sequenziamento viene effettuato automaticamente il demultiplexing dei campioni indicizzati. Suggerimento Per monitorare la reazione di sequenziamento potete aggiungere PhiX all'1% come controllo addizionale. Consultare la documentazione Illumina sul controllo PhiX per ulteriori informazioni. Elenco reagenti Componente Conservazione Provenienza Cartuccia reagenti -20 C Illumina HT1-20 C Illumina PR2 4 C Illumina Cella a flusso MiSeq 4 C Illumina Libreria a 2nM 4 C Fase 6 NaOH 1 N o 2 N 20 C - 25 C Utilizzatore H 2 O per uso in biologia molecolare 20 C - 25 C Utilizzatore Capacità Kit Reagenti MiSeq Kit reagenti Illumina MiSeq Std 500 Cycle (MS ) Std 300 Cycle (MS ) Micro 300 Cycle (MS ) Nano 500 Cycle (MS ) Nano 300 Cycle (MS ) Tempo Ore Campioni 24/7 ~39 24 ~24 24 ~19 24 ~28 12 ~17 6 Protocollo 7.1 Preparare il MiSeq secondo i protocolli standard Illumina. 7.2 Preparare una libreria denaturata 1 nm: Combinare 10 μl freschi di NaOH 0,2 N e 10 μl della libreria con frammenti selezionati diluita a 2 nm in una nuova microprovetta low-bind Pagina 37 49

38 da 1,5 ml. Agitare mediante vortex e centrifugare. Incubare questa libreria denaturata 1 nm a temperatura ambiente per 5 minuti. 7.3 Preparare una libreria denaturata 20 pm: Aggiungere 980 μl di HT1 refrigerato ai 20 μl della libreria denaturata 1 nm. Agitare mediante vortex e centrifugare. 7.4 Preparare una libreria denaturata 9 pm: Aggiungere 550 μl di HT1 refrigerato e 450 μl della libreria denaturata 20 pm a una microprovetta low-bind da 1,5 ml. Agitare mediante vortex e centrifugare. 7.5 Trasferire 600 μl della libreria denaturata 9 pm nella posizione di caricamento della cartuccia reagenti MiSeq. Suggerimento Si consiglia di utilizzare il workbook fornito per creare il foglio campioni richiesto per il Miseq. Pagina 38 49

39 Fase 8 Analisi dati di sequenziamento HLA Illumina MiSeq processa la libreria combinata 9 pm e genera dati di sequenziamento nella forma di file fastq. Consultare il Manuale HLA Twin per l'installazione corretta di HLA Twin e per informazioni sull'interpretazione dell'analisi di genotipizzazione dei dati di sequenziamento. Per aiuto nella configurazione del protocollo automatizzato e domande circa l'installazione o l'analisi dei dati, potete contattare support@omixon.com. Protocollo automatizzato Installazione IT e configurazione 1. Installare HLA Twin Server sul server. Installare HLA Twin Client su un PC client. Al server si possono collegare più client HLA Twin. Contattare l assistenza Omixon (support@omixon.com) per istruzioni circa l installazione del protocollo automatizzato. Protocollo per analisi 1. Lanciare HLA Twin Client ed effettuare il login. 2. I dati sono stati già elaborati o sono in fase di elaborazione. Riesaminare i risultati utilizzando il sistema a semaforo in HLA Twin. 3. Esportare i risultati di genotipizzazione e/o le sequenze di consenso, come richiesto. Protocollo server manuale Installazione IT e configurazione Installare HLA Twin Server sul server. Installare HLA Twin Client su un PC client. Protocollo per analisi Lanciare HLA Twin Client ed effettuare il login. Selezionare i dati MiSeq in formato fastq o fastq.gz e avviare l interpretazione dei dati con Holotype HLA. Al termine della tipizzazione Holotype HLA, riesaminare i risultati utilizzando il sistema a semaforo in HLA Twin. Esportare i risultati di genotipizzazione e/o le sequenze di consenso, come richiesto. Protocollo desktop manuale Installazione IT e configurazione Installare Desktop HLA Twin. Pagina 39 49

40 Protocollo per analisi 6 Lanciare HLA Twin e effettuare il login. 7 Selezionare i dati MiSeq in formato fastq o fastq.gz e avviare l interpretazione dei dati con Holotype HLA. 8 Al termine della tipizzazione Holotype HLA, riesaminare i risultati utilizzando il sistema a semaforo in HLA Twin. 9 Esportare i risultati di genotipizzazione e/o le sequenze di consenso, come richiesto. Pagina 40 49

41 Figure supplementari Esempio di schema per piastra ampliconi, piastra amplificazione, piastra diluizione, piastra quantificazione ampliconi (per un locus individuale) e piastra reazione Esempio di piastra quantificazione standard Pagina 41 49

42 Esempio di piastra per quantificazione libreria con qpcr KAPA Pagina 42 49