Anticorpi monoclonali: terapia e diagnostica

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Domenica Pastore
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1 Anticorpi monoclonali: terapia e diagnostica

2 Anticorpi monoclonali Sono proteine prodotte dal sistema immunitario che rispondono ad un unico determinante antigenico e, come tali, sono altamente specifiche Con l avvento della tecnologia degli ibridomi, la loro produzione ha rivoluzionato l immunologia e ha avuto un impatto straordinario sia nella ricerca che nella clinica

Nel 1975 Kohler e Milstein per la prima volta produssero una linea cellulare fondendo un linfocita B normale, capace di rispondere ad un singolo epitopo antigenico con

4 Nel 1975 Kohler e Milstein per la prima volta produssero una linea cellulare fondendo un linfocita B normale, capace di rispondere ad un singolo epitopo antigenico con cellule mielomatose immortali capace di crescere indefinitamente in vitro Nel 1984 lo sviluppo di questa linea ibrida (IBRIDOMA) valse ai due scienziati il premio Nobel

5 Anticorpo Sito di legame con l antigene: sito che lega l antigene nella regione variabile Dominio variabile : catena variabile pesante (VH) e variabile leggera (VL). Entrambi sono responsabili del legame all antigene Sito di legame con l effettore: effettrici nel dominio costante sito che interagisce con molecole Dominio costante : regione F c dell anticorpo Regione che determina la complementarità (CDR) : combinazione di regioni variabili VL e VH che interagiscono con l epitopo sull antigene

6 Struttura dell anticorpo Dominio variabile Dominio costante

8 Funzioni effettrici dell anticorpo Dipendente dalla classe di anticorpo (IgG, IgM, etc,) Attiva il sistema complemento (complement dependent cytotoxicity) Attiva le cellule citotossiche del sistema immunitario (antibody dependent cellular cytotoxicity)

9 Produzione di anticorpi monoclonali

10 Come amplificare indefinitamente i linfociti B specifici per un dato antigene e selezionare un singolo clone secernente?

12 POTENZIALITA TERAPEUTICHE DEGLI ANTICORPI MONOCLONALI Terapia del cancro (neoplasia mammaria, colon- rettale, polmonare, renale, leucemia, linfomi) Trattamento di malattie autoimmuni (morbo di Crohn, artrite reumatoide, psoriasi, sclerosi multipla) Cura dell osteoporosi Profilassi nel rigetto di trapianti d organo Diagnosi di malattie genetiche Diagnosi di gravidanza e di malattie a trasmissione sessuale Diagnostica per immagini

13 Utilizzo nella diagnostica Misurazione dei livelli di una proteina o di un determinato farmaco nel siero Tipizzazione ematica o tissutale Identificazione di agenti infettivi Identificazione di marcatori tumorali specifici Identificazione di cellule specifiche coinvolte nella risposta immunitaria Identificazione e determinazione della concentrazione di determinati ormoni Utilizzo come traccianti nella diagnostica per immagini

15 Evoluzione degli anticorpi monoclonali

16 Problemi relativi ad anticorpi murini nell uomo Risposta immune umana all anticorpo di topo (HAMA- Human Anti-Mouse Antibodies) successivo trattamento può causare allergia o shock anafilattico L anticorpo di topo non attiva il sistema umano del complemento o la citotossicità mediata dall anticorpo. Breve emivita

17 Soluzioni Anticorpi ingegnerizzati mediante tecnologia del DNA ricombinante Estrazione di mrna da ibridoma Sintesi di cdna Clonaggio e sequenziamento regioni variabili della catena leggera e della catena pesante dell anticorpo

18 Anticorpi monoclonali chimerici Regioni variabili della catena pesante fusi con la regione costante umana e leggera di topo Approssimativamente il 75% della sequenza umana Stessa specificità del bersaglio di quelli murini Meno immunogenici di quelli murini Numerosi anticorpi chimerici approvati da FDA

19 Anticorpi monoclonali umanizzati Sequenze murine delle regioni CDR (complementaritydetermining region) (3 da regione variabile della catena pesante e 3 da regione variabile della catena leggera) trapiantate nella regione variabile umana ed espresse all interno delle regioni costanti umane. Approssimativamente il 90% della sequenza umana Meno immunogenici di quelli murini o chimerici Diversi anticorpi umanizzati approvati da FDA

20 Anticorpi monoclonali umani Anticorpi completamente umani, generati in topi transgenici (topi che portano geni delle immunoglobuline umane) 100% sequenza umana Ingegnerizzati ricombinante mediante la tecnologia del DNA

21 1. Inattivare i geni della catena pesante e leggera di topo 2. Introdurre i geni umani della catena pesante e leggera nel genoma murino 3. Il topo transgenico può essere immunizzato con antigeni bersaglio per generare anticorpi umani

22 ANTICORPI MONOCLONALI

23 Evoluzione degli anticorpi monoclonali

24 Evoluzione degli anticorpi monoclonali

25 REAZIONE ACDCC : Antibody Dependent Cellular Cytotoxicity Citotossicità

26 Meccanismi di azione degli anticorpi monoclonali in clinica ADCC: citotossicità cellulare anticorpo-dipendente

27 Meccanismi di azione degli anticorpi monoclonali in clinica CDC: citotossicità complemento-dipendente Inibizione della trasduzione del segnale anticorpo-mediata

28 Strategie per potenziare la risposta anticorpale (anticorpi coniugati)

29 Sistema di indirizzamento del farmaco basato su anticorpi monoclonali Farmaco Pro- Farmaco Farmaco Anticorpo monoclonale Proteina della superficie cellulare Enzima Anticorpo monoclonale Proteina della superficie cellulare Cellula bersaglio Cellula bersaglio

30 Anticorpi monoclonali nella terapia antitumorale Difficoltà tecniche nella pratica clinica: -Proprietà dell antigene tumorale -Proprietà dell anticorpo -Integrità dei meccanismi immunologici responsabili della risposta

32 Proprietà dell anticorpo monoclonale Capacità di indurre apoptosi Capacità di indurre una risposta citotossica complemento-mediata (CDC) o anticorpo mediata (ADCC) Accesso alle cellule tumorali Ridotta immunogenicità

34 Meccanismi di distruzione delle cellule tumorali Citotossicità mediata anticorpo-dipendente (ADCC), citotossicità complemento mediata (CDC), apoptosi (meccanismi diretti); inibizione della proliferazione cellulare (meccanismi indiretti)

35 Anticorpi approvati per l utilizzo in terapia

36 Anticorpi monoclonali umanizzati approvati per uso clinico TRASTUZUMAB HER-2 ALEMTUZUMAB CD 52 Cancro della mammella B-CLL PALIVIZUMAB RSV RS VIRUS nei bambini DACLIZUMAB IL-2R Trapianto d organo

38 Cetuximab (Erbitux ) Anticorpo monoclonale chimerico: - diretto contro il recettore per il fattore di crescita epidermico (EGFR) iperespresso nel 60-80% dei pazienti con carcinoma del colon-retto - approvato dal FDA 2004

39 Meccanismo d azione di Cetuximab

40 Anticorpi anti-vegf

41 Angiogenesi

46 Bevacizumab (Avastin ) - anticorpo hrab-anti-vegf, monoclonale murino umanizzato che si lega a tutte le isoforme di VEGF-A - approvato dal FDA nel 2004, per il trattamento di prima scelta per il tumore metastatico del colon-retto indicato in combinazione con chemioterapia (5-FU/acido folinico, o 5- FU/acido folinico/irinotecan) - off-label, alla dose di 1 mg o mg intravitreo 1 volta al mese ha dimostrato miglioramento dell acuità visiva e una riduzione dell angiogenesi

47 PROCESSO ANGIOGENICO

48 Ranibizumab (Lucentis ) - anticorpo rhufab V2, è un frammento di un anticorpo murino umanizzato anti-vegf che si lega a tutte le isoforme di VEGF - si somministra alla dose di 0.5 mg intravitreo 1 volta al mese ha dimostrato miglioramento dell acuità visiva e una riduzione dell angiogenesi - spesso è associato alla terapia fotodinamica

49 Farmaci a bersaglio molecolare o Target therapy

51 Target therapy e terapia personalizzata

52 Immunità e tumori Burnet anni 1950: Immunosorveglianza e cancro Dume1990: Immunoediting (l immunità protegge dal cancro ma nel contempo può favorirne lo sviluppo) Schreiber2010 : tre livelli di Immunoediting -eliminazione del tumore (prevale l immunità) -fase di equilibrio (honeymoon) -progressione e sopravvento del tumore (sbilanciamento) Negli ultimi decenni sono aumentate le segnalazioni sul complesso rapporto tra immunità e cancro Alcune malattie autoimmuni si correlano ad una elevata manifestazione di tumori

53 Immunità e tumori

54 CTLA4 e PD1 Sono sistemi di regolazione immunitaria che riducono le possibilità di innesco di processi autoimmuni Esiste un processo di TOLLERANZA CENTRALE e di TOLLERANZA PERIFERICA I processi immunitari delle cellule T sono attivati dalla esposizione ad antigeni MHC e dalla presentazione di un antigene da parte di cellule APC Per prevenire eventi di innesco di autoimmunità sono previsti numerosi checkpoint regolatori. CTLA4 interviene precocemente, PD1 più tardivamente

55 CTLA4/B7

56 PD1/PD-L1

57 CTLA4 e PD1: similitudini Sono recettori della famiglia recettoriale B7 Sono espressi da cellule T attivate L espressione è regolata da TCReceptor Modulano l espressione di proteine e effettori intracellulari Riducono la proliferazione delle cellule T Riducono la fosforilazione ossidativa delle cellule T Riducono la produzione di citochine (IL2 e INF) Aumentano l apoptosi delle cellule T

58 CTLA4 e PD1: differenze CTLA4 Espresso solo da cellule T Presente nei linfociti dei linfonodi Il ligandoè solo B7 di APC Determina tolleranza immunitaria in una fase più precoce Azione su T regolatori certa PD 1 Espresso da T cell, B cell, cellule mieloidi Presente nelle cellule dei tessuti periferici Ligandi: B7,PD-L1,PD-L2 Azione su effettori più tardivi del pathway Azione su T regolatori sporadica

60 Atezolizumab (anti PD-L1)

61 Tossicità da antagonismo PD-1/PD-L1 Febbre,dolori,sonnolenza Maculopapule Diarrea e coliti ulcerose,epatopatia Ipofisiti, tiroiditi Neuropatie, s. di Guillaume-Barré, miastenia Trombocitopenia Nefriti

62 Indicazioni terapeutiche Ipilimumab Melanoma, carcinoma renale Nivolumab Melanoma, carcinoma polmonare NSCLC, carcinoma renale, linfoma di Hodgkin Atezolizumab Carcinoma uroteliale, carcinoma polmonare NSCLC

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