DALLA RICERCA DI BASE ALLO SVILUPPO DI TERAPIE INNOVATIVE PER LE MALATTIE GENETICHE. Prof. Mirko Pinotti Dip. Scienze della Vita e Biotecnologie

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1 DALLA RICERCA DI BASE ALLO SVILUPPO DI TERAPIE INNOVATIVE PER LE MALATTIE GENETICHE. Prof. Mirko Pinotti Dip. Scienze della Vita e Biotecnologie Università di Ferrara Stati Generali della Ricerca, Piacenza, 1 giugno 2019

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3 In ogni cellula c è una libreria chiamata DNA

4 Il DNA (genoma) è una grande biblioteca

5 distrofina SMN1 Fattore VIII coagulazione

6 Le nostre cellule spendono molta energia per impedire danni al DNA MA TALVOLTA.

7 MUTAZIONI GENICHE ALLA BASE DI PATOLOGIE Normale Mutazione Malattie possono essere dovute a: - difetti in un solo gene (monogeniche) - difetti di più geni

8 Malattie Ereditarie Presenti alla nascita e dovute a mutazioni sul DNA (genoma) trasmesse dai genitori Anemia mediterranea o talassemia Distrofia muscolare di Duchenne Fibrosi Cistica Le malattie ereditarie sono più di 8.000, numerose delle quali sono rare e poco studiate (malattie orfane)

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10 Ma come fa la cellula ad utilizzare una mole così grande di informazioni? 3 miliardi di lettere (basi)

11 LA CELLULA COME UNA FABBRICA UFFICIO PROGETTI PRODUZIONE Progetto riassunto per la produzione DNA (archivio, grande enciclopedia) 1 grande libro (GENE) per ogni prodotto RNA messaggero (C è l informazione essenziale) 1 grande libro (GENE) per ogni prodotto Sintesi Proteica (Viene letto il messaggio e sintetizzato il prodotto-proteina Mirko Pinotti Personale

12 ESONE ESONE ESONE Gene (libro grande) Corretto processamento Messaggero (riassunto) Proteina funzionale Produzione Normale funzione fisiologica Mirko Pinotti Personale

13 Gene (libro grande) Corretto processamento Messaggero (riassunto) Proteina funzionale Produzione Normale funzione fisiologica Mirko Pinotti Personale

14 Mutazioni che interferiscono con il riconoscimento dell esone - + * Gene (libro grande) Messaggero (riassunto) Proteina alterata Non funzionale Produzione Mirko Pinotti Personale

15 La ricerca è fantasia. che vi verrebbe in mente di fare? ESONE SALTATO ESONE INCLUSO

16 La ricerca è fantasia. che vi verrebbe in mente di fare? Potenzio elementi positivi U1snRNA (+) (-) Silenziatori Interferisco con elementi negativi (tolgo il freno)

17 Mutazioni che interferiscono con il riconoscimento dell esone + U1snRNA migliorato che forza inclusione esone mutato * * Corretto processamento Proteina alterata Non funzionale Proteina funzionale Mirko Pinotti Personale

18 Ma per veicolarlo in vivo???

19 I Virus come cavallo di troia Gene «sano» Vettore virale come veicolo Del gene terapeutico Mirko Pinotti Personale

20 Dallo studio dei microbiologi gli strumenti per la terapia genica: i vettori virali Lhretibeau et al, Blood Reviews 2015 AAV

21 APPROCCI DI TERAPIA GENICA: EX-VIVO vs IN VIVO

22 TF FVII Difetto ereditario di FVII causato da mutazione di splicing FIX FVIII FVII TF FX FV TROMBINA Coagulo Emorragia

23 Una U1 «intelligente» è capace di ripristinare processamento e produzione della proteina mancante nel modello animale hfvii mrna (RT-PCR) hfvii protein (HI) bp M paav-fviiwt paav-fvii+5a + paav-u1+5a 2 h7f h8r a n paav-fviiwt % total hfvii n= 4 mice/group Molar ratio U1+5a/FVII+5A=1,5 a1 n2 1 paav-u1+5a paav-fvii+5a + Balestra et al, JTH 2014

24 ATROFIA MUSCOLARE SPINALE (SMA) Causata da mutationi/delezioni nel gene SMN1 (Survival motor neuron 1) gene. pre-mrna SMN1 exon 6 exon 7 exon 8 mrna Protein Modified from Burghes et al. Nat.Rev. Neuroscience 2009

25 Terapia genica sostitutiva per la SMA (2.1 milioni ad iniezione) SMN1 Tuttavia sto inserendo un gene nuovo Vettore virale come veicolo Del gene terapeutico Mirko Pinotti Personale

26 Possiamo «inventare» altre strategie? Magari agendo sullo «splicing» come mostrato prima?

27 SMA: l evoluzione ci ha fornito una via terapeutica alternativa Causata da mutationi/delezioni nel gene SMN1 (Survival motor neuron 1) gene. Nel genoma umano sono presenti una o più copie di uno pseudogene (SMN2) che è quasi identico a SMN1 con l eccezione di una mutazione che causa salto dell esone 7 pre-mrna SMN1 SMN2 exon 6 exon 7 exon 8 mrna Exon 7 skipping Protein Modified from Burghes et al. Nat.Rev. Neuroscience 2009

28 ATROFIA MUSCOLARE SPINALE (SMA) Causata da mutationi/delezioni nel gene SMN1 (Survival motor neuron 1) Nel genoma umano sono presenti una o più copie di uno pseudogene (SMN2) che è quasi identico a SMN1 con l eccezione di una mutazione che causa salto dell esone 7 E se correggessi processamento di SMN2)? SMN1 SMN2 SMN2 pre-mrna exon 6 exon 7 exon 8 T mrna Exon 7 skipping Protein Modified from Burghes et al. Nat.Rev. Neuroscience 2009

29 (-) Silenziatori Interferisco con elementi negativi (tolgo il freno)

30 Oppure togliendo «un freno» ovvero mascherando un elemento inibitore

31 Sebbene corregga la funzione del gene endogeno, la molecola deve essere somministrata più volte per iniezione intratecale

32 Possiamo invece combinare i vantaggi di questi due approcci ovvero -una iniezione sola -correggendo il meccanismo endogeno?

33 Potenzio elementi positivi U1snRNA (+)

34 ATROFIA MUSCOLARE SPINALE (SMA) Causata da mutationi/delezioni nel gene SMN1 (Survival motor neuron 1) Nel genoma umano sono presenti una o più copie di uno pseudogene (SMN2) che è quasi identico a SMN1 con l eccezione di una mutazione che causa salto dell esone 7 Engineered U1snRNA (ExSpeU1)? SMN1 SMN2 SMN2 pre-mrna exon 6 exon 7 exon 8 T mrna Exon 7 skipping Protein Modified from Burghes et al. Nat.Rev. Neuroscience 2009

35 L iniezione di AAV9- ExSpeU1 ripristina l inclusione di SMN2 nei vari tessuti del topo SMA Dal Mas et al. Am J Hum Genet 2015

36 Una sola iniezione di AAV-ExSpeU1 aumenta marcatamente la sopravvivenza (da una media di 10 gg a 219 gg!!) normali Donadon et al. Nucleic Acids research 2019

37 Una sola iniezione di AAV-ExSpeU1 aumenta marcatamente la funzionalità neuromuscolare Hanging test Rotarod test Normali Topi SMA trattati Donadon et al. Nucleic Acids research 2019

38 Brevetto (EU, USA, China, etc) «Molecule of human U1snRNA, gene encoding a molecule of modified human U1snRNA, expression vector including the gene, and use in gene therapy Big-pharma (negotiation)

39 Collaborative Network F. Pagani ICGEB, Trieste University of Pennsylvania CHOP Philadelphia, PA, USA International Centre for Genetic Engineering and Biotechnology Trieste -Italy Genethon Paris - France

40 Ma possiamo addirittura ovviare alla esigenza dell uso di virus?

41 H2020 European Project «ENDOSCAPE, a clinically applicable non-viral gene delivery technology»

42 Perché dopo essere venuti alla luce NON si ritorni nel buio