Dott.ssa Daria Catalano. U.O.S.D CQRC (Controllo Qualità e Rischio Chimico) Resp. Prof.ssa Francesca Di Gaudio

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1 Dott.ssa Daria Catalano U.O.S.D CQRC (Controllo Qualità e Rischio Chimico) Resp. Prof.ssa Francesca Di Gaudio

2 Il CQRC D.A del Istituzione del Centro di Riferimento regionale per la Cromatografia e la Spettrometria di Massa presso il CQRC del Policlinico di Palermo. Con cogenza di accreditamento come laboratorio di prova ai sensi della NORMA VOLONTARIA UNI/CEI/EN/ISO IEC o ISO Laboratorio «on demand» Raccoglie in un concentrato una Sezione Metrologica e le migliori tecnologie di Spettrometria di Massa.

3 La Tossicologia Clinica Scopi clinico-diagnostici e medico-legali Diagnosi e trattamento tossicodipendenti Casi di avvelenamento o intossicazione acuta/cronica Controlli Antidoping Sequestri (Artt DPR 309/90 e s.m.i.) Valutazione della idoneità alla guida Determinazione requisiti psicofisici per il rilascio del porto d armi Accertamenti sui lavoratori le cui mansioni comportano rischi per la sicurezza, l incolumità e la salute di terzi Accertamento stato ebbrezza o assunzione sostanze stupefacenti nella guida (DPR 285/1992 Artt e s.m.i.).

4 Droghe e Addiction Per dipendenza si intende una alterazione del comportamento che da semplice o comune abitudine diventa una ricerca esagerata e patologica del piacere (sensazione di rewarding) attraverso mezzi o sostanze o comportamenti che sfociano nella condizione patologica. La TOSSICODIPENDENZA viene intesa oggi come una malattia che si instaura in seguito all'uso cronico e compulsivo di sostanze. SOSTANZE DI ABUSO (illegali, DPR 309/90 s.m.i.) ALCOOL (legale) BEVANDE STIMOLANTI (legale) FARMACI (legali, dietro prescrizione medica)

5 Il CQRC e le Forze dell Ordine: Art. 75 DPR 309/90 Chi illecitamente importa, esporta, acquista, riceve a qualsiasi titolo o comunque detiene sostanze stupefacenti o psicotrope fuori dalle ipotesi di cui all'articolo 73, comma 1-bis, o medicinali contenenti sostanze stupefacenti o psicotrope elencate nella tabella II, sezioni B e C Polvere beige: EROINA Sostanza resinosa: HASHISH Sostanza erbacea Spinello Polvere bianca: COCAINA

6 Art. 75 DPR 309/90 4-MEC: 4-Metiletilcatinone Stimolante ed entactogeno sintetico venduto come sostituto del Mefedrone, COMUNICAZIONE al D.P.A. e ATTIVAZIONE SISTEMA DI ALLERTA!

7 Addiction da FARMACI Benzodiazepine Antidepressivi Psicostimolanti Diuretici (Furosemide) Fenobarbital Ormoni Neurolettici

8 Addiction da FARMACI: DOPING Integratori nutrizionali a base di anabolizzanti naturali MUSCOLI, FORZA, RESISTENZA! LEGALI SICURI

9 Trenbolone Steroide anabolizzante RT: SM:7G RT: 3.03 MA: Relative Abundance Relative Abundance Relative Abundance Relative Abundance RT: 0.67 AA: RT: 3.01 AA: RT: 3.02 MA: RT: 4.97 RT: 6.25 AA: AA: 8674 RT: 9.89 AA: RT: 8.04 RT: 9.88 AA: AA: RT: 8.06 AA: RT: AA: RT: AA: RT: AA: RT: AA: RT: 9.87 AA: RT: AA: RT: AA: RT: AA: RT: AA: RT: AA: RT: AA: RT: AA: Time (min) β-trenbolone Massa esatta: Da Frammento MS/MS: Da CH 3 COOH: Da β-trenbolone Acetato Massa esatta: Da

10 Indagini analitiche su matrici biologiche a scopo forense 3 ALIQUOTE SANGUE ALIQUOTA A: Analisi di I livello o screening ALIQUOTA B: Analisi di II livello o di conferma ALIQUOTA C: Controcampione URINE CAPELLI 2 ALIQUOTE SALIVA ALIQUOTA A: Analisi di II livello o di conferma ALIQUOTA B: Controcampione

11 Scelta della matrice: URINA Consumo recente PERSISTENZA CAMPIONAMENTO CORRELAZIONE PSICO-FISICA ROBUSTEZZA RAPPORTO DROGA/METABOLITA ADULTERAZIONE QUANTITÀ COMPLESSITÀ ed INTERFERENZE CUT-OFF PREPARAZIONE del CAMPIONE STABILITÀ

12 Scelta della matrice: SANGUE Attualità d uso PERSISTENZA CAMPIONAMENTO CORRELAZIONE PSICO-FISICA ROBUSTEZZA RAPPORTO DROGA/METABOLITA ADULTERAZIONE QUANTITÀ COMPLESSITÀ ed INTERFERENZE CUT-OFF PREPARAZIONE del CAMPIONE STABILITÀ

13 Analisi sangue a scopo forense Il prelievo di sangue deve essere eseguito dalla vena preferibilmente di un arto superiore dopo aver pulito la superficie cutanea. Il prelievo deve essere eseguito nel rispetto della normativa vigente in materia e deve essere atto a ridurre al minimo il rischio per la salute del soggetto che vi si sottopone. A B C A B C Dosaggio droghe Provette con gel anticoagulante per facilitare la separazione del plasma anche dopo congelamento Dosaggio alcolemia disinfettare l area di prelievo con un disinfettante non alcolico; riempire la provetta sfruttando tutto il volume utile del contenitore per evitare lo spazio di testa. Provette connaf o KF per inibire la glicolisi e, di conseguenza, la formazione di alcol etilico per fermentazione alcolica Per avere un dato attendibile!

14 Scelta della matrice: CAPELLI Storia di assunzione PERSISTENZA CAMPIONAMENTO CORRELAZIONE PSICO-FISICA ROBUSTEZZA RAPPORTO DROGA/METABOLITA ADULTERAZIONE QUANTITÀ COMPLESSITÀ ed INTERFERENZE CUT-OFF PREPARAZIONE del CAMPIONE STABILITÀ

15 Analisi matrice cheratinica Memoria metabolica nei decessi La valutazione di idoneità alla guida (EtG) Custodia, affidamento dei minori Esposizione prenatale a farmaci e/o sostanze d abuso PERCHÉ??? Reati facilitati dalla droga Valutazione della storia di assunzione del soggetto Accertamento e/o valutazione della condizione di tossicodipendenza nelle mansioni a rischio

16 Prelievo capelli per datazione a scopo forense Regione retro-nucale Minima variabilità interindividuale nella velocità di crescita del capello (0,8-1,2 cm/mese) e meno soggetta ai fattori atmosferici. Vengono prelevate n 2 aliquote (A e B): Isolare una ciocca di capelli del diametro di circa 1 cm nella zona retro-nucale del capo; Attorcigliare con le dita la ciocca; Tagliare con forbici pulite e ben asciutte il più possibile vicino alla cute; Dividere longitudinalmente la ciocca in due parti approssimativamente uguali; Fissare i capelli con uno spago annodato o con una fascetta il più vicino possibile alla parte dei capelli prossimale al cuoio capelluto (0,5 cm circa) in modo da evidenziare il segmento iniziale; Accertarsi che il prelievo di capelli sia perfettamente asciutto prima del confezionamento; Fissare le ciocche su un foglio di carta o su loro stesse.

17 Prelievo matrice cheratinica Quando il prelievo di capelli non risulta possibile, ad esempio in caso di soggetto canuto o rasatura a zero, il campionamento può essere effettuato dai peli pubici o da altre zone ricche in matrice cheratinica (ascelle, torace, viso). Da ricordare: Matrice pilifera con crescita più lenta; Stesso meccanismo di incorporazione dei principi attivi; Cinetica di assorbimento diversa; Datazione dell assunzione non determinabile.

18 Fattori di variabilità della matrice cheratinica Meccanismo di incorporazione della droga; Natura del legame della droga con la matrice cheratinica; Struttura e disomogeneità del capello; Velocità di crescita; Trattamenti cosmetici; Contaminazioni esterne; Pigmentazione del capello. Conc. in WHITE Conc. in PIGMENTED = 0,70

19 Analisi dei Cannabinoidi SANGUE URINA CAPELLI

20 L analisi della saliva consente di determinare la presenza di una droga d abuso o un farmacoinunperiododitempocompresotramenodiun orae24oredall assunzione. PERSISTENZA CAMPIONAMENTO CORRELAZIONE PSICO-FISICA ROBUSTEZZA Scelta della matrice: SALIVA RAPPORTO DROGA/METABOLITA ADULTERAZIONE QUANTITÀ COMPLESSITÀ ed INTERFERENZE CUT-OFF PREPARAZIONE del CAMPIONE STABILITÀ Attualità d uso

21 Prelievo saliva a scopo forense N 2 aliquote (A e B ) da 1 mlciascuna Tale suddivisione del prelievo può essere omessa solo nel caso in cui sia stato prelevato contestualmente alla saliva anche un campione di sangue. Contenitori per la raccolta: La saliva può essere raccolta, senza stimolazione della salivazione, espellendo almeno 2 ml di fluido orale in un contenitore graduato o provetta, in un periodo di tempo di circa 30 minuti o finché non è stato raggiunto il volume definito. Utilizzare dei classici contenitori in polipropilene e polietilene, materiale atossico, opaco e particolarmente resistente agli urti. Conservazione: Il campione viene conservato alla temperatura di +4/8 C per un massimo di 24h; per periodi di tempo superiori lo stoccaggio viene effettuato a -20 C. Attendere almeno 10 minuti dall ingestione di cibo, bevande o farmaci prima della raccolta del campione!! Quantisal TM : Saliva Collection Device e tubo filtro

22 CQRC: Modulo di richiesta analisi I livello ANAGRAFICA e DATI DEL PRELIEVO RICHIESTA

23 Indagini di I livello su urineeseguite dal CQRC Metaboliti cocaina (BZE) Amfetamine (Amfetamina, Metamfetamina, MDMA, MDA) Ecstasy (MDA, MDEA, MBDB) Cannabinoidi ( 9 -THC, 11-nor- 9 -THC-COOH, ecc.) Oppiacei (Morfina, Codeina, 6-MAM, Eroina, ecc.) Buprenorfina Metadone Metabolita Primario Metadone (EDDP) Benzodiazepine (Alprazolam, Diazepam, Flunitrazepam, ecc.) Barbiturici (Amobarbital, Fenobarbital, Tiopentale, ecc.) Etilglucuronide Creatinina

24 Indagini di I livello su sangue eseguite dal CQRC Importante per valutare l intossicazione in fase acuta e per dimostrare l attualità d uso! Cocaina e Metaboliti Amfetamine/Ecstasy (Amfetamina, Metamfetamina, MDMA, MDA, MDEA, MBDB) Cannabinoidi ( 9 -THC, 11-nor- 9 -THC-COOH, ecc.) Oppiacei (Morfina, Codeina, 6-MAM, ecc.) Metadone Etanolo Acetaminofene Implementare analisi I livello su saliva!! Così avere prelievi contestuali all incidente e da non intasare i P.S.

25 Indagine di I livello o screening Indagine semiquantitativa di tipo immunoenzimatico che fornisce un risultato presuntivo riguardo la negatività o positività di un campione rispetto ad una sostanza/classe di sostanze e in riferimento a un valore di cut-off prestabilito. Tale analisi viene eseguita sull aliquota A di campione. Ilab 650 (Instrumentation Laboratory) Contro: Ridotta specificità (dato qualitativo: BASSISSIMA CERTEZZA DI PRO: IDENTIFICAZIONE e molti FALSI POSITIVI); Elevata inaccuratezza Veloce (dato quantitativo); Alta possibilità di cross-reattività Capillarmente con diffuse altre sostanze; Effettuabile su larga scala Economiche solo su urina e raramente su sangue; Inefficace con le droghe di ultima generazione.

26 Indagini di I vs II livello Classe di sostanze: AMFETAMINE/ECSTASY OPPIACEI/BUPRENORFINA

27 CQRC: Modulo di richiesta analisi II livello ANAGRAFICA e DATI DEL PRELIEVO RICHIESTA

28 CQRC: Modulo di richiesta analisi II livello X X X X

29 Art. 186 Guida sotto l'influenza dell'alcool Comma 2: Chiunque guida in stato di ebbrezza è punito 0,5 x < 0,8 g/l 0,8 x < 1,5 g/l ARRESTO!!! 1,5 g/l Art. 186-bis Guida sotto l'influenza dell'alcool per conducenti di età inferiore a ventuno anni, per i neopatentati e per chi esercita professionalmente l'attività di trasporto di persone o di cose 0 < x < 0,5 g/l

30 Art. 186 Guida sotto l'influenza dell'alcool Comma 3: Al fine di acquisire elementi utili per motivare l'obbligo di sottoposizione agli accertamenti di cui al comma 4, gli organi di Polizia stradale di cui all'articolo 12, commi l e 2, secondo le direttive fornite dal Ministero dell'interno, nel rispetto della riservatezza personale e senza pregiudizio per l'integrità fisica, possono sottoporre i conducenti ad accertamenti qualitativi non invasivi o a prove, anche attraverso apparecchi portatili. Comma 4: Quando gli accertamenti qualitativi di cui al comma 3 hanno dato esito positivo, in ogni caso d'incidente ovvero quando si abbia altrimenti motivo di ritenere che il conducente del veicolo si trovi in stato di alterazione psico-fisica derivante dall'influenza dell'alcool, gli organi di Polizia stradale di cui all'articolo 12, commi 1 e 2, anche accompagnandolo presso il più vicino ufficio o comando, hanno la facoltà di effettuare l'accertamento con strumenti e procedure determinati dal regolamento. Comma 5: Per i conducenti coinvolti in incidenti stradali e sottoposti alle cure mediche, l'accertamento del tasso alcoolemico viene effettuato, su richiesta degli organi di Polizia stradale di cui all'articolo 12, commi 1 e 2, da parte delle strutture sanitarie di base o di quelle accreditate o comunque a tali fini equiparate. Le strutture sanitarie rilasciano agli organi di Polizia stradale la relativa certificazione, estesa alla prognosi delle lesioni accertate, assicurando il rispetto della riservatezza dei dati in base alle vigenti disposizioni di legge

31 Art. 187 Guida in stato di alterazione psico-fisica per uso di sostanze stupefacenti Comma 1: Chiunque guida in stato di alterazione psicofisica dopo aver assunto sostanze stupefacenti o psicotrope è punito con l'ammenda da euro a euro e l'arresto da sei mesi ad un anno Comma 2-bis: Quando gli accertamenti di cui al comma 2 forniscono esito positivo ovvero quando si ha altrimenti ragionevole motivo di ritenere che il conducente del veicolo si trovi sotto l'effetto conseguente all'uso di sostanze stupefacenti o psicotrope, i conducenti, nel rispetto della riservatezza personale e senza pregiudizio per l'integrità fisica, possono essere sottoposti ad accertamenti clinico-tossicologici e strumentali ovvero analitici su campioni di mucosa del cavo orale prelevati a cura di personale sanitario ausiliario delle forze di polizia. Con decreto del Ministro delle infrastrutture e dei trasporti, di concerto con i Ministri dell'interno, della giustizia e della salute, sentiti la Presidenza del Consiglio dei Ministri - Dipartimento per le politiche antidroga e il Consiglio superiore di sanità, da adottare entro sessanta giorni dalla data di entrata in vigore della presente disposizione, sono stabilite le modalità, senza nuovi o maggiori oneri a carico del bilancio dello Stato, di effettuazione degli accertamenti di cui al periodo precedente e le caratteristiche degli strumenti da impiegare negli accertamenti medesimi

32 Art. 187 Guida in stato di alterazione psico-fisica per uso di sostanze stupefacenti Comma 3: Nei casi previsti dal comma 2-bis, qualora non sia possibile effettuare il prelievo a cura del personale sanitario ausiliario delle forze di polizia ovvero qualora il conducente rifiuti di sottoporsi a tale prelievo, gli agenti di polizia stradale di cui all'articolo 12, commi 1 e 2, fatti salvi gli ulteriori obblighi previsti dalla legge, accompagnano il conducente presso strutture sanitarie fisse o mobili afferenti ai suddetti organi di polizia stradale ovvero presso le strutture sanitarie pubbliche o presso quelle accreditate o comunque a tali fini equiparate, per il prelievo di campioni di liquidi biologici ai fini dell'effettuazione degli esami necessari ad accertare la presenza di sostanze stupefacenti o psicotrope. Le medesime disposizioni si applicano in caso di incidenti, compatibilmente con le attività di rilevamento e di soccorso

33 Indagine di II livello o di conferma Analisi quantitativa da eseguirsi con un metodo dotato di massima specificità rispetto a quello impiegata per l'analisi di primo livello, al fine di identificare e quantificare specificamente una sostanza e/o suoi metaboliti individuati in maniera presuntiva attraverso l'analisi di primo livello. Dosaggio alcolemia e metanolemia Dosaggio CDT Trace GC Ultra, Thermo Scientific HPLC Infinity, Agilent Tech. Pro: Economicamente sostenibili Effettuabili su tutti i tipi di matrici No Cross-reazioni Contro: Identificazione affidabile, ma non al 100% (tr) In Sicilia, presenti pochi centri Metodi implementati su matrici comuni (sangue, urina e polveri)

34 GC-MS 5977A Series GC/MSD System Campione Estrazione SPE Derivatizzazione Analisi

35 LC-MS/MSad ALTA RISOLUZIONE Dosaggio droghe e farmaci e Droghe di ultima generazione! Molecole senza più segreti!! TSQ Quantum Access Max, Thermo Scientific Q Exactive LC-MS/MS, Thermo Scientific Scelta ideologica: Lavorare direttamente sulla matrice biologica acquosa, tal quale, senza la trasformazione e manipolazione del campione che si ha in GC/MS. Pro: Tempi di analisi più veloci Certezza di identificazione Riduzione drastica errori analitici Contro: Costi di ammortamento

36 Linee Guida GTFI Valori cut-off urina Cut-off conferma (ng/ml) C.S.R Linee Guida Regione Lazio Istituto Superiore di Sanità Substance Abuse and Mental Health Service Administration statunitense Gruppo dei Tossicologi Forensi Italiani(GTFI).

37 Linee Guida GTFI Valori cut-off matrice pilifera 0,2 0,2 (0,05 BZE) 0,2 0,2 0,1 (THC-COOH)

38 Valori cut-off saliva Linee Guida GTFI 40 (4,0 6-MAM)

39 Valori cut-off sangue Linee Guida GTFI PROBLEMATICA ETICO-LEGALE: La legge non indica valori soglia di punibilità! LA DROGA DEVE ESSERE ASSENTE!!! Il cut-off è basato sullo stato dell arte, sulla capacità analitica media dei maggiori operatori

40 Incertezza del dato analitico NESSUNA MISURA SPERIMENTALE È PRIVA DI ERRORE!!! Sono privi di errore solo i numeri che provengono da conteggi o da definizioni Come stimiamo l INCERTEZZA del nostro risultato e quindi la nostra CERTEZZA? Ogni misura è in realtà un RANGE DI VALORI POSSIBILI che deve sempre essere NOTO e DICHIARATO.. mg/dl ±? Colesterolo: 220 mg/dl ±? Alcool: 0,49 mg/dl ±?

41 CROMATOGRAFIA SPETTROMETRIA DIMASSA METROLOGIA Riferibilità delle misure Possibilità di esprimere l incertezza

42 GC-MS LC IONICA ICP-MS HPLC LC-HRMS/MS