Cereali e Salute: Triticum dicoccum ad elevata tollerabilità

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1 Cereali e Salute: Triticum dicoccum ad elevata tollerabilità Relazione conclusiva progetto triennale

2 Cereali e salute: Triticum dicoccum ad elevata tollerabilità I cereali, rappresentati da numerose specie vegetali appartenenti alla famiglia delle graminacee, hanno accompagnato l uomo nella sua storia da prima della nascita dell agricoltura fino ai nostri giorni. Le grandi civiltà del passato si sono sviluppate basando la propria alimentazione su cereali diversi che si sono diffusi e modificati di pari passo all'espansione dei popoli. In questo modo possiamo affiancare alle popolazioni del bacino del Mediterraneo la lunga evoluzione del frumento, a quelle del Sud-America il mais e a tutte quelle civiltà che si sono sviluppate in prossimità dei grandi fiumi asiatici il riso. Nello scenario della produzione mondiale riso, mais e frumento rappresentano ancora i cereali maggiormente coltivati in quanto alla base dell alimentazione di gran parte della popolazione mondiale; nonostante questo i cereali che oggi noi conosciamo sono il frutto di una profonda evoluzione e di un lunghissimo lavoro di selezione effettuato nell arco di migliaia di anni. Frumento tenero e frumento duro sono i due cereali maggiormente legati alle popolazioni che si sono sviluppate nel bacino del Mediterraneo e oggi rappresentano la base per la produzione di numerosi prodotti tradizionali, legati alle culture locali e caratteristici delle varie aree di produzione. I grani che oggi utilizziamo per la produzione di pane, dolci e pasta, sono molto diversi da quelli che venivano coltivati nei medesimi areali migliaia di anni fa. L evoluzione del grano è avvenuta nel corso degli ultimi sei milioni di anni, approssimativamente nella attuale regione del Medio Oriente, in una vasta area comprendente Siria, Libano, Giordania, Palestina, Iran, Turchia, Iraq, Afganistan e Kazakistan. Il frumento tenero, specie più recente ed evoluta, è comparso insieme allo spelta circa anni fa in un area relativamente piccola nel nord-ovest iraniano, lungo le coste del Mar Caspio. Esistono però prove archeologiche in grado di dimostrare che alcune comunità sedentarie, già anni fa, si cibavano di forme primitive di grano monococco e di farro. Prima della rivoluzione agricola avvenuta nel neolitico, l uomo viveva grazie alla raccolta di piante spontanee e alla caccia di animali selvatici. Gli antichi cereali, non avendo subito alcun tipo di selezione da parte dell uomo, erano caratterizzati da due importanti aspetti, fondamentali per garantire la sopravvivenza in un ambiente naturale, ovvero le cariossidi vestite e la spiga fragile. La nascita dell agricoltura può essere fatta risalire all incirca al a.c., nella zona della così detta Mezza luna fertile, dove l uomo iniziò a riprodurre i primi frumenti (frumento monococco e dicocco) a spiga fragile. La spiga fragile ha rappresentato una caratteristica fondamentale per la sopravvivenza delle varie specie di cereali in ambiente naturale non condizionato dall uomo in quanto, una volta raggiunta la maturazione fisiologica, le cariossidi potevano essere disseminate garantendo in questo modo l avvio di una nuova generazione. Il legame fra uomo e cereali diventa però ancora più profondo poche centinaia di anni a seguire, intorno al a.c. quando le popolazioni presenti nella 1

3 fascia di territorio compresa fra Egitto e Turchia iniziano a coltivare del frumento monococco e dicocco a spiga rigida, caratteristica ancora presente nei grani moderni. Questi tipi di frumenti sono caratterizzati dal fatto che una volta raggiunta la maturità, la spiga rimane integra non liberando le cariossidi e impedendo loro di cadere sul terreno. Sebbene questa caratteristica dal punto di vista biologico sia un svantaggio in quanto limita fortemente le capacità riproduttive delle varie piante, dal punto di vista agronomico è un vantaggio enorme in quanto permette di ridurre fortemente la quantità di seme perso in prossimità della raccolta. Questo apparente piccolo cambiamento, frutto della selezione operata dall uomo, rappresenta in realtà un momento molto importante nell evoluzione della specie umana e del frumento in quanto la rigidità della spiga è la prima importante evidenza della domesticazione del frumento e dell uomo che da semplice nomade raccoglitore diventa agricoltore. Da questo momento la riproduzione del frumento dipenderà dall azione dell uomo-agricoltore, la cui sopravvivenza sarà funzione principale delle sue capacità tecniche. L altro importante aspetto dei cereali antichi è rappresentato dalla presenza di cariossidi vestite, ovvero cariossidi che al momento della trebbiatura non vengono liberate completamente ma rimangono racchiuse all interno degli involucri glumeali. Sebbene alcuni tipi di cereali a cariosside nuda fossero già disponibili prima del a.c., fino a circa anni fa essi hanno occupato un ruolo assolutamente marginale essendo più difficilmente conservabili a causa della minore resistenza a malattie, parassiti ed agenti atmosferici. Il fatto di avere una cariosside nuda costituisce una caratteristica molto importante ai nostri giorni in quanto riduce le lavorazioni successive alla raccolta e consente di ottenere, a seguito della trebbiatura meccanica, delle cariossidi che possono essere direttamente trasformate in farina o semola. In passato, in un epoca priva di sussidi chimici e tecnologici per la conservazione delle derrate, i frumenti vestiti erano decisamente avvantaggiati per una maggiore resistenza nei confronti degli insetti e dell umidità durante l immagazzinamento e il trasporto. Sia i farri che il grano monococco sono caratterizzati dalla spiga rigida e dalla cariosside vestita. L importante legame che al momento della nascita dell agricoltura si è instaurato fra cereali e uomo si è rafforzato nei secoli ed è giunto fino ai nostri giorni. Il frumento non ha rappresentato solamente un alimento, ma una vera e propria merce di scambio. L economia delle grandi civiltà del Mediterraneo si è basata sulla coltivazione e sul commercio di questi cereali antichi. Il frumento monococco, dopo circa anni di coltivazione, era scomparso dai campi e dalle tavole già nel a.c., mentre il farro dicocco e lo spelta rimasero i frumenti più coltivati ancora per diversi secoli. La loro sostituzione avviene in modo graduale nelle varie zone del bacino del Mediterraneo a partire dal XVI secolo. Attualmente i frumenti vestiti sono ancora presenti in alcuni areali, ma sempre confinati nelle zone più marginali e meno produttive. La selezione operata dall uomo ha portato, oltre alle modifiche evidenti riguardanti la rigidità della spiga e la nudità della cariosside, anche a numerosi altri cambiamenti molto meno evidenti ma comunque importanti avvenuti a carico della frazione proteica dei cereali ed in particolar modo del glutine, ovvero di quella parte di proteine che ha un ruolo fondamentale nella determinazione delle caratteristiche tecnologiche dei cereali. Il XX secolo rappresenta un periodo straordinario per il settore agrario in quanto, attraverso la riscoperta degli esperimenti condotti da Mendel, vengono avviati in maniera importante la genetica ed il miglioramento genetico delle piante e degli animali di interesse agrario. In Italia le esperienze di Mendel arrivano in ritardo rispetto al resto dell Europa, ma il marchigiano N. Strampelli intuisce le leggi che governano la trasmissione dei caratteri ed inizia, nei 2

4 primi anni del secolo, prima nelle campagne intorno a Camerino e poi a Rieti, i suoi esperimenti riguardanti l incrocio dei grani. Strampelli dà avvio alla così detta Rivoluzione Verde e fornisce agli agricoltori di tutto il mondo decine di varietà di grano che ancora oggi sono ampiamente coltivate in regioni come il sud America e l Asia e che sono poi entrate in maniera importante nei programmi genetici e nella costituzione delle nuove varietà. La meccanizzazione e la produzione industriale di fertilizzanti e di pesticidi hanno poi consentito lo sfruttamento delle enormi potenzialità contenute nelle varietà di grano migliorate geneticamente aumentando enormemente la produttività e consentendo l ottenimento di produzioni caratterizzate da un alto valore tecnologico le quali sono poi diventate la base delle nostre produzioni agroalimentari locali. L enorme lavoro svolto dai breeders oggi è finalizzato ad ottenere varietà di grano che si possano ben adattare ai diversi ambienti, fornendo produzioni elevate e di alto valore qualitativo e tecnologico. Questo lavoro riguarda principalmente il miglioramento di caratteri non visibile ad occhio nudo e precisamente delle proteine di riserva dei cereali e in modo particolare del glutine. L obiettivo di migliorare tecnologicamente un cereale è estremamente complesso da raggiungere, basti pensare alla complessità genetica dei cereali e alla variabilità nella composizione del glutine per capire la mole di lavoro necessaria e le stagioni che debbono essere impiegate per svolgerla. Il glutine rappresenta circa l 80% della porzione proteica di un cereale ed è composto per la sua parte principale da un gruppo di proteine denominate prolamine e che a loro volta possono essere suddivise in gliadine e glutenine. Le gliadine sono proteine monomeriche e sono rappresentate in ogni varietà di grano da circa 50 molecole diverse mentre le glutenine sono delle proteine polimeriche composte da subunità ad alto peso molecolare (HMW High Molecular Weight, da 3 a 5 molecole diverse per ogni varietà) e da quelle a basso peso molecolare (LMW Low Molecular Weight, da 16 a 25 molecole diverse). Il glutine è responsabile delle esclusive proprietà viscoelastiche degli impasti di farina di grano, dai quali si ottengono poi le diverse produzioni agroalimentari. La composizione di glutenine e gliadine all interno del glutine, la sequenza amminoacidica delle diverse proteine, la quantità e le proprietà chimiche di ciascuna molecola prolaminica sono specifiche e caratteristiche delle diverse varietà, ma il rapporto fra le stesse è influenzato anche dalla capacità delle singole varietà di svolgere in maniera ottimale tutte le fasi del loro ciclo, in modo particolare quelle legate all accrescimento ed alla maturazione della granella e, di conseguenza, dall andamento climatico e dall adattamento dei grani ai diversi ambienti. L enorme ed estremamente complesso lavoro di miglioramento genetico è quindi finalizzato da un lato a migliorare la composizione proteica dei cereali, e dall altro ad aumentare la resistenza alle malattie e l adattamento ai diversi ambienti di produzione. Presi singolarmente, i vari alimenti, per quanto ricchi di fattori nutritivi, non possono mai essere considerati completi dal punto di vista nutrizionale. I cereali non fanno ovviamente eccezione a questa regola ed infatti, nonostante la abbondante presenza di alcuni amminoacidi come la cisteina e la metionina, le proteine del frumento non possono essere considerate di alto valore nutrizionale in quanto carenti di due amminoacidi essenziali che sono la lisina e la treonina. Questa carenza può però essere facilmente sopperita accompagnando le proteine dei cereali con quelle dei legumi che, a differenza dei primi, risultano abbondanti di lisina e treonina ma carenti di cisteina e metionina. La scienza, indagando poi sulla composizione dei vari alimenti e sul ruolo che i diversi componenti hanno, ne ha definiti alcuni come funzionali in quanto particolarmente ricchi di sostanze benefiche per il nostro organismo. È proprio nell ambito di queste indagini che alcuni grani antichi 3

5 come il farro ed il grano monococco sono risultati particolarmente interessanti dal punto di vista dietetico per il loro contenuto in fibra solubile, in tocoli e carotenoidi, tutte sostanze utili a prevenire importanti disturbi metabolici. Nell ambito di altre ricerche sono invece emerse altre caratteristiche importanti del glutine dei cereali, soprattutto in riferimento ad alcune fasce della popolazione affette da particolari disturbi alimentari. Gliadine e glutenine risultano infatti particolarmente ricche di prolina, un amminoacido che, a causa della assenza nel tratto digerente dell uomo di uno specifico enzima (propil-endopeptidasi), le rende estremamente poco digeribili. Questa caratteristica del glutine risulta praticamente innocua per la quasi totalità delle persone tranne che per uno 0,5 1% della popolazione che, a causa di una particolare predisposizione, manifesta una serie di gravi disturbi che caratterizzano una patologia alimentare nota come malattia celiaca. La celiachia è una enteropatia cronica caratterizzata da intolleranza permanente al glutine, che si manifesta a seguito dell ingestione di alcune proteine in soggetti geneticamente predisposti. Anche l assunzione di piccole quantità di glutine provoca gravi danni alla mucosa del soggetto celiaco, in particolare al piccolo intestino, nel quale si verifica un appiattimento dei villi, con conseguente perdita della capacità di assorbire sostanze nutritive. Ovviamente i sintomi si presenteranno esclusivamente dopo lo svezzamento, all introduzione degli alimenti contenenti farine glutinate. Il trattamento della malattia celiaca si basa su una dieta rigorosamente priva di glutine. Questo permette il ripristino della funzione assorbente della mucosa intestinale e la completa scomparsa dei sintomi, i quali sono destinati a ricomparire al momento dell ingestione di alimenti contenenti glutine. È impossibile stimare il periodo di latenza della malattia, ovvero il periodo che intercorrerà fra la prima introduzione di alimenti glutinati e la manifestazione dei sintomi in quanto questo periodo varia da individuo ad individuo e, ancora oggi, non sono ben noti i meccanismi che lo regolano. Le ipotesi effettuate circa le cause che portano al manifestarsi della malattia sono diverse e alcune attendono ancora una conferma scientifica; con molta probabilità, all interno di questi fattori sono compresi anche il tipo di glutine assunto, le modalità ed i tempi di assunzione al momento dello svezzamento. La malattia celiaca si può manifestare, a differenza di quasi tutte le altre malattie, in vari modi: oltre alla forma tipica, quasi esclusiva dell età pediatrica, caratterizzata da diarrea cronica, dolori addominali, scarsa crescita o arresto ponderale, addome espanso, anemia, ipotonotrofia muscolare, aspetto vecchieggiante, rifiuto del cibo, addome globoso, steatorrea (perdita di grassi con le feci) etc, si hanno altre forme caratterizzate da sintomatologie più o meno complesse e gravi a seconda della predisposizione e della gravità dei casi. È importante notare che oggi, a differenza di quanto avveniva in passato, il riscontro delle forme tipiche è del tutto occasionale, mentre sono molto più frequenti le forme atipiche con notevoli difficoltà e ritardo nella diagnosi della malattia. In Italia la celiachia è una delle patologie più frequenti in assoluto poiché colpisce all incirca un soggetto ogni abitanti. I geni coinvolti nella malattia sono un gruppo ben definito ed in base alla loro posizione cromosomica vengono definiti HLA DQ2 e HLA DQ8. Il loro ruolo nella manifestazione e nello sviluppo della malattia non è ancora ben chiaro, ma la loro correlazione con la celiachia li rende dei marcatori molto importanti, a tal punto che la loro presenza nel corredo genico rappresenta una ulteriore conferma della malattia o comunque di un certo rischio di ammalarsi. Risulta fondamentale precisare che l intolleranza al glutine non è una malattia ereditaria, ma che l importanza di questi geni viene anche evidenziata dalla notevole predisposizione familiare alla malattia; la 4

6 probabilità di manifestare i sintomi della celiachia aumenta notevolmente se si hanno parenti affetti da questo morbo, fino al caso limite dei fratelli omozigoti, nei quali se uno dei due è celiaco, l altro ha una probabilità prossima al 90% di ammalarsi. Le modalità attraverso le quali il glutine risulti tossico per l intestino delle persone celiache non sono ancora del tutto chiare. Lo studio della malattia celiaca, già molto articolato se riferito alle numerose varianti sintomatiche, alle differenti possibilità di reazione alla somministrazione di glutine offerte dai vari soggetti celiaci e ai complessi meccanismi di azione della malattia, si complica quindi ulteriormente se prendiamo in considerazione anche l elemento scatenante, ovvero il glutine. In definitiva la celiachia deriva dall interazione fra due grandi polimorfismi, ovvero il complesso spettro immunologico dei pazienti celiaci esposti al glutine (sostanzialmente ogni celiaco è diverso dall altro nella sua risposta linfocitaria al glutine) ed il polimorfismo del glutine, estremamente variabile nella sua composizione. L enorme polimorfismo del glutine riguarda sia le diverse specie di cereali sia le varietà appartenenti alla stessa specie. Tutto ciò si manifesta con una grande variabilità nel livello di tossicità dei cereali nei confronti dei pazienti celiaci i quali, come è stato già osservato in diverse esperienze, mostrano una forte riduzione delle lesioni a carico della mucosa intestinale a seguito dell esposizione alle prolamine di grano monocococco e a quelle di alcune particolari cultivar di farro e frumento duro. In base a ciò, anche il miglioramento genetico dei cereali, effettuato in risposta alle richieste tecnologiche della attuale industria alimentare, potrebbe aver influito sulla diffusione della celiachia e sul livello di tossicità e immunogenicità degli alimenti a base di grano ed altri cereali. All interno del glutine dei cereali sono state individuate alcune particolari sequenze amminoacidiche responsabili delle alterazioni a livello dell epitelio intestinale dei soggetti celiaci. Il segmento P31-43 sembra essere responsabile di un forte e rapido effetto citotossico che porta ad una alterazione del citoscheletro, ad una forte proliferazione cellulare e alla conseguente apoptosi delle cellule dell epitelio intestinale. Il segmento 33-mer risulta invece responsabile di un effetto immunogenico che si estrinseca attraverso una forte attivazione dei Linfociti-T. Come precedentemente detto, negli ultimi anni sono state acquisite numerose evidenze circa il fatto che non tutti i cereali contenenti glutine sono tossici allo stesso livello e questo fatto può essere spiegato sia attraverso una minore presenza dei due sopracitati segmenti amminoacidici all interno del glutine dei cereali meno tossici, sia attraverso la contemporanea presenza di un terzo segmento amminoacidico, di dimensioni ancora minori, denominato segmento 10-mer al quale viene attribuito un effetto protettivo della mucosa intestinale dei soggetti celiaci. Il peptide protettivo 10-mer, di 1157 Da, è stato trovato nel materiale ottenuto dalla digestione con pepsina e tripsina (PT) delle proteine di grano duro Adamello. I linfociti del sangue periferico di bambini celiaci a dieta libera proliferano e producono citochine IFN- γ e TNF-α se esposti alle prolamine di frumento. Questi effetti non si osservano se si aggiunge anche il peptide 10-mer, il quale stimola la sintesi di interleuchina 10, un immuno-modulatore antinfiammatorio. La presenza del peptide 10-mer è stata osservata oltre che nel grano duro Adamello anche in alcuni genotipi di farro. Il peptide 10-mer, in base a quanto osservato in diverse esperienze, sembra avere una importante azione positiva in relazione all effetto citotossico del glutine. Le prolamine di grano tenero e di grano spelta (Triticum aestivum ssp. spelta) stimolano la produzione di caspasi, enzimi chiave nel processo di apoptosi cellulare. Portando a contatto le prolamine di grano monococco (Triticum monococcum) e di alcune cultivar di farro (Triticum turgidum ssp. dicoccum) con una coltura di cellule Caco-2, queste non stimolano la sintesi di caspasi. Nella medesima esperienza si è inoltre visto che somministrando alla stessa coltura cellulare il peptide 10- mer in associazione alle prolamine di grano spelta, questo riduce il suo effetto di stimolo della sintesi di enzimi. 5

7 Nella medesima esperienza si è potuto osservare che le prolamine di grano spelta somministrate alle cellule Caco-2 stimolano la produzione di NO, sostanza che induce alterazioni del citoscheletro ed appiattimento della mucosa intestinale. Anche in questo caso il peptide 10-mer riduce l effetto delle prolamine di grano spelta e la somministrazione di prolamine di grano monococco e di alcuni genotipi di farro che non aumentano la sintesi di NO. Le prolamine di grano spelta somministrate alle cellule Caco-2 stimolano la sintesi della transglutaminasi tessutale (ttg), enzima che aumenta l affinità degli epitopi prolaminici per i linfociti T dei celiaci. Il peptide 10-mer annulla l effetto delle prolamine di grano spelta e la somministrazione singola di prolamine di grano monococco e di alcuni genotipi di farro alla medesima coltura cellulare, non stimolano un incremento della sintesi di trasglutaminasi tessutale. Table 1. Agglutination of K562(S) cells, caspase production and transepithelial electric resistance R2/R1 ratio in Caco-2/TC7 cells, stimulation index (SI) and INFγ production in four intestinal T cell lines after exposition to PT-digested prolamins Wheat species Cell agglutination Caspase (RFU) R2 /R1 ratio SI INF-γ (ng/l) Common wheat Cv. San Pastore 0.07 a 24 ± 6** 0.4 ± 0.2** b * Dicoccum wheat L5540 neg 8 ± ± L5558 neg 8 ±3 1.0 ± L5563 neg 8 ± ± Five other landraces ± 7** 0.6 ± 0.1** b * Monococcum wheat Monlis 0.15 nd nd nd nd nd nd 11 other accessions neg 8 ± ± 0.1 Staurosporine 1µM 35 ± 5** Control cells neg 7 ± a Minimal concentration (g/l) of PT digest that agglutinates all cells; neg = no agglutination; b SI 3 is assumed as significant; nd = not determined; *,** significant Nel corso di questi studi sono state prese in considerazione alcune selezioni di farro coltivate nelle aree tradizionali dell Italia centrale. Nelle indagini svolte per individuare la MAC, ovvero la minima concentrazione di digesto di prolamine di frumento necessaria perché avvenga l agglutinazione totale delle cellule K562(S), si è potuto osservare che somministrando alla coltura cellulare il digesto di prolamine della cv. San Pastore e il digesto degli estratti prolaminici di cinque farri, Filosini, Leonessa 4, Leonessa 5, Ersa 6 ed Ersa 8, l agglutinazione totale delle cellule avveniva già a basse concentrazioni (0,07 g/l). Sempre nella medesima prova si è potuto osservare che esistono alcuni genotipi di farro (L5540, L5558 e L5563) che non causano alcun problema alle cellule K562(S) fino a concentrazioni piuttosto elevate (5 g/l) e che queste stesse linee non causano alcuna alterazione nemmeno se portate a contatto con cellule Caco-2/TC7, dove in particolare la secrezione delle caspasi e la conducibilità elettrica trans epiteliale rimangono paragonabili al controllo non trattato. 6

8 Per quanto riguarda il grano monococco, in base a studi passati (Vincentini et al. 2007), nella maggioranza dei casi, portando a contatto i digesti PT delle prolamine di grano monococco con le cellule K562 (S) o con le cellule Caco-2/TC7 non si ha l attivazione di alcuna reazione autoimmunitaria e la conseguente morte cellulare. In particolare, su 14 genotipi analizzati, 11 accessioni non provocano agglutinazione e apoptosi cellulare fino a concentrazioni di 14 g/l. Le prolamine estratte dal monococco, dopo digestione PT, contengono peptidi separabili mediante cromatografia. In questa fase possono essere identificati tre gruppi prolaminici corrispondenti nella figura 1 ai picchi A, B e C. La frazione C delle prolamine di monococco è in grado di causare in vitro un effetto tossico nelle cellule K562(S) a concentrazioni variabili (fra lo 0,02 e lo 0,1 g/l) ma comunque molto basse. Se questa frazione viene somministrata in associazione con la frazione B l effetto tossico scompare. È molto importante notare che questo peptide risulta essere differente dal peptide 10-mer estratto dalla cv. Adamello, il quale tuttavia, se somministrato in associazione alla frazione prolaminica C svolge la medesima azione di inibizione dell effetto tossico. Una ulteriore conferma della differenza esistente fra il peptide presente nel grano monococco ed il 10-mer è data dal fatto che gli anticorpi policlonali specifici per la sequenza del peptide 10-mer non reagiscono con nessuna banda della SDS-PAGE delle proteine di riserva del grano monococco quindi la natura della azione protettiva del peptide B rimane ancora da definire. Figure 1. Fractionation of PT-digested prolamins from Triticum monococcum (accession 362) by affinity chromatography. Fractions A and B were eluted with 0.2 M ammonium acetate at ph 7.2, fraction C with 0.1M acetic acid at ph 2.8. Non tutte le tipologie di grano monococco danno però gli stessi risultati a seguito di analisi della tossicità. Il digesto PT delle prolamine della cv. Monlis poste a contatto con cellule K562 (S) causano la completa agglutinazione a concentrazioni piuttosto basse (0,15 g/l), fatto questo simile a quanto osservato con la cv. San Pastore (MAC 0,07 g/l). Quanto osservato con la cv. Monlis è stato riscontrato anche analizzando la MAC dei genotipi 358 e A seguito di uno screening dei genotipi di monococco effettuato tramite A-PAGE ed SDS-PAGE si è potuto osservare che la cultivar Monlis e le linee 358 e 1636 sono comparabili fra di loro e si differenziano dai restanti monococchi per la mancanza delle ω- gliadine. Questa osservazione risulta essere molto importante in quanto ci suggerisce che l azione protettiva nei confronti delle cellule K562 (S) e delle cellule Caco-2/TC7 è 7

9 imputabile ad una frazione proteica contenuta all interno di questo più ristretto gruppo prolaminico. Α β γ ω Figure 2. A-PAGE gliadin patterns of (from the left) monococcum accessions 1327, 1352 and 358. In this latter genotype, ω-gliadins encoded by the Gli-A m 1 locus are absent. In base a queste esperienze risulta evidente l effetto protettivo del peptide 10-mer e dei peptidi simili contenuti nel grano monococco nei confronti dei processi tossici esercitati dal glutine dei cereali nei confronti dei pazienti celiaci e il notevole interesse di alcuni tipi di grani antichi nella prevenzione di questa malattia. Proseguendo lo studio sul peptide 10-mer si è potuto inoltre osservare che questo, pur essendo un peptide presente nelle prolamine, proteine esclusive dei frumenti contenenti glutine, non è presente solamente nei cereali bensì può essere ritrovato in quantità elevate ma variabili in alcuni legumi come pisello, cece, fava, fagiolo, fagiolo dell occhio e cicerchia. A seguito di questa ricerca si è potuto inoltre osservare che le proteine di fagiolo svolgono un azione simile a quella del peptide 10-mer infatti, somministrando un digesto PT di prolamine di grano tenero ad una coltura di cellule K562(S) in presenza di un estratto di proteine di fagiolo, la MAC aumenta esponenzialmente rispetto alla stessa prova effettuata in assenza dell estratto di proteine di fagiolo. Questo ultimo punto apre il problema della celiachia ad una serie di considerazioni molto più generali riguardanti anche il valore della dieta mediterranea, le abitudini alimentari delle società moderne ed il completo abbandono di alcuni alimenti che per numerosissimi secoli hanno occupato le tavole dei nostri antenati. Il primo medico che ha segnalato la malattia celiaca nell adulto è stato Areteo di Cappadocia nel primo secolo dopo Cristo denominandola diatesi celiaca, che significa alterazione intestinale. Nel 1888 Samuel Jones Gee è stato il primo medico a segnalare la malattia celiaca nel bambino, descrivendo magistralmente il quadro della forma tipica. Il merito principale di Samuel Gee è stato quello di aver intuito che la causa della malattia celiaca andava ricercata in un alimento, anche se non 8

10 era riuscito ad identificare quello responsabile. In seguito molti altri medici hanno descritto la malattia celiaca con varie denominazioni. Il forte interesse per la malattia celiaca è iniziato però dopo il 1945 quando il pediatra Willem-Karel Dicke che lavorava nell Ospedale dei bambini di Utrecht identificò nella farina di grano la causa della malattia. Tuttavia, negli anni si pensava ancora che la malattia celiaca fosse una malattia rara, quasi esclusivamente pediatrica pressoché sconosciuta nell adulto e diffusa soprattutto in Europa. In realtà la situazione reale non è questa, si sta infatti scoprendo, grazie a diversi screening fatti negli ultimi anni che la malattia celiaca ha una prevalenza molto elevata sia in Europa che in altri continenti, come ad esempio quello nord americano. Questo aumento di prevalenza a livello mondiale della malattia celiaca può a questo punto essere motivato attraverso un aspetto molto importante che è rappresentato dalle maggiori conoscenze riguardanti la celiachia ed il modo in cui agisce, fatto questo che ha sicuramente permesso una più semplice diagnosi della intolleranza. Rimane comunque il fatto che la celiachia sia una intolleranza alimentare che causa gravi disturbi metabolici che, se trascurati, possono condurre anche alla morte. Questi disturbi metabolici sono causati dall ingestione di alcuni componenti presenti all interno di determinati gruppi di alimenti (alcuni cereali), sempre all interno di questi alimenti sono però presenti sostanze in grado di annullare o quantomeno di mitigarne l effetto tossico. I cereali, per motivazioni diverse, hanno subito una forte azione di miglioramento genetico nell arco dell ultimo secolo e negli ultimi 50 anni si è potuto assistere ad un forte cambiamento del regime alimentare con il conseguente abbandono di alimenti, legumi prima di tutto, in passato largamente utilizzati. Queste considerazioni fanno emergere il dubbio che l aumento della prevalenza della malattia celiaca all interno della popolazione sia dovuto non solo ad un aumento delle capacità diagnostiche della medicina moderna, ma anche ad un reale aumento, in valore assoluto, della celiachia nella popolazione mondiale. In considerazione della grande eterogenicità a livello genetico e quindi anche a livello di composizione prolaminica dei cereali, che è causa di una grande diversità di effetti nei confronti dell epitelio intestinale dei celiaci, del fatto che le prolamine di alcuni genotipi di farro dicocco causano un effetto estremamente ridotto nei confronti dei pazienti celiaci e che il grano monococco, ad eccezione di tre cultivar, nello svolgimento di numerose prove non ha dato alcun effetto tossico e di quanto emerso circa l effetto del peptide 10-mer, si aprono interessanti prospettive per alcuni genotipi di farro e di grano monococco per una loro valorizzazione attraverso la produzione di alimenti per soggetti celiaci. Gli studi e la sperimentazione clinica su questi frumenti sono ancora in corso di svolgimento, pertanto i pazienti celiaci debbono escludere questi cereali dalla loro dieta. Tuttavia risulta molto importante proseguire questo tipo di studio al fine di chiarire ulteriormente i meccanismi di azione di questo tipo di intolleranza e di valutare gli effetti, sulla popolazione generale, di una dieta meno ricca di fattori tossici relativi alla celiachia, con particolare attenzione al periodo dello svezzamento che sembra avere un ruolo importante nella manifestazione dei sintomi. 9

11 Il Progetto Regionale La Regione Marche, attraverso la pubblicazione del bando regionale per il finanziamento di progetti di ricerca e sperimentazione (L.R. 37/99), ha affidato al CERMIS la realizzazione del progetto triennale. Gli obiettivi del progetto sono stati essenzialmente due, il primo, più di carattere medicosalutistico e legato alle indagini relative alla intolleranza al glutine, si prefiggeva di effettuare uno studio dal punto di vista tossicologico, tecnologico e agronomico di diverse popolazioni di farro allo scopo di individuare genotipi caratterizzati da una ridotta o nulla tossicità per i soggetti che manifestano l intolleranza al glutine. Il secondo obiettivo del progetto cercava di rispondere ad esigenze di carattere produttivo attraverso una analisi della produzione regionale di farro, con l intento di delineare i passaggi principali e i punti critici della filiera per la produzione di pasta di farro e formalizzare così le fasi fondamentali per una produzione di qualità. I farri inseriti nel progetto, sono ciò che è derivato da uno screening eseguito tramite elettroforesi bidimensionale delle popolazioni indagate negli anni passati e sui quali in passato non si è avuto ancora modo di indagare. Focalizzando l indagine non sulle popolazioni di farro bensì sulle linee che le compongono, si è cercato di comprendere meglio le ragioni della tossicità dei diversi farri, ed di rintracciare genotipi di farro caratterizzati da ridotta tossicità nei confronti di soggetti celiaci. Genotipi che potrebbero essere favorevolmente sfruttati per la produzione di pasta e pane, e che garantirebbero una ridotta esposizione alle proteine tossiche del glutine, fatto questo indispensabile per ridurre l incidenza della malattia nella popolazione. fasi: Il progetto, articolato nell arco di tre anni, è stato strutturato attraverso lo svolgimento di cinque Fase 1: Agronomica Fase 2: Tossicologica Fase 3: Tecnologica Fase 4: Filiera Fase 5: Divulgazione La fase agronomica è stata organizzata in modo tale da identificare le caratteristiche morfofisiologiche dei farri analizzati, attraverso una sperimentazione svolta in diversi ambienti del territorio marchigiano ed in condizioni diverse di coltivazione (Biologico e convenzionale). Nelle prove sperimentali sono stati inseriti i farri presenti nella collezione del soggetto proponente e quelli recuperati all interno del territorio regionale attraverso la collaborazione con i vari partner. 10

12 Per quanto concerne la fase agronomica, nel corso delle tre annualità sono state caratterizzate dal punto di vista morfologico, fisiologico ed agronomico 177 accessioni di farro presente nelle celle frigorifere del cermis più altri farri provenienti dalla rete di monitoraggio alla quale hanno partecipato attivamente sia le associazioni di categoria che le aziende partner. La caratterizzazione è stata fatta seguendo il protocollo utilizzato dall ENSE per l iscrizione al registro dei cereali autunno-vernini. Lo screening per valutare l omogeneità delle popolazioni ed individuare le linee maggiormente interesanti dal punto di vista prolamminico, è stato fatto tramite SDS-PAGE seguendo la metodica identificata e descritta nel seguente articolo: Pogna N.E., Mellini F., Beretta A., Bianchi A. (1988). Composizione in subunità gluteniniche ad alto peso molecolare (APM) delle varietà di grano tenero coltivate in Italia. Sementi Elette (4): Sempre nell arco dei tre anni, ed in considerazione oltre che dell importanza delle varie linee anche del materiale geneticamente omogeneo a disposizione, è stato effettuato un confronto in ambiente biologico fra alcuni farri caratterizzati da tossicità ridotta ed altri farri comunemente coltivati nella nostra Regione. Altro punto importante della fase agronomica ha riguardato la moltiplicazione del materiale ed il mantenimento in purezza della semente. Considerata l importanza di questa fase in relazione alle restanti attività inerenti il progetto (di valutazione tossicologica e tecnologica), al fine di evitare il più possibile inquinamenti anche accidentali del materiale moltiplicato, si è preferito mantenere il massimo controllo effettuando queste attività nei campi sperimentali del soggetto proponente. La caratterizzazione biochimica, genetica e immunologica dei farri oggetto di studio è stata effettuata attraverso all esecuzione di diversi test: - Analisi immunoelettroforetiche per la presenza e distribuzione di peptidi tossici e/o immunogenici e del peptide protettivo con sequenza QQPQDAVQPF mediante separazione elettroforetica SDS-PAGE delle prolamine e immunoreazione con anticorpi policlonali specifici previo loro trasferimento su membrane di nitrocellulosa (Western Blotting). La ricerca è stata svolta dopo aver valutato la variabilità nella composizione prolaminica delle singole accessioni di farro (genotipi o razze locali). Per confronto sono state utilizzate le prolamine di frumento tenero e frumento monococco e le albumine/globiline di legumi. Inoltre le prolamine delle suddette accessioni di farro sono state utilizzate in esperimenti di tossicità e immunogenicità in vitro utilizzando colture ci cellule Caco-2, cellule K562(S) e linfociti periferici di soggetti celiaci a dieta libera. In considerazione di nuovi studi intercorsi fra la programmazione delle attività e lo svolgimento delle stesse, si è deciso di concentrare l attenzione su un numero minore di farri e di svolgere analisi più approfondite, mettendo come confronto non solo le proteine di frumento tenero ma anche quelle di monococco e quelle di alcuni legumi. I risultati di questa parte dello studio, come indicato nella sezione introduttiva al presente documento, hanno evidenziato che esistono alcune linee di Triticum dicoccum che, grazie alla presenza di alcuni segmenti proteici, durante l effettuazione dei sopra menzionati test, non sono fonte di tossicità o sono fonte di una ridotta tossicità. Oltre a questo, e quindi a quanto era stato previsto in fase di programmazione progettuale, durante le indagini svolte su diverse accessioni di grano monococco è emerso che solo alcune accessioni sono fonte di manifestazioni tossiche e che la frazione proteica protettiva presente nel grano monococco è differente da quella presente nel Triticum dicoccum e che si trova in una ben precisa parte del genoma di questo cereale. 11

13 - Test in vitro i quali possono a loro volta essere condotte su espianti di epitelio intestinale di soggetti celiaci prelevate al momento della diagnosi e mantenute in coltura per un adeguato intervallo di tempo. La tossicità del glutine di farro è stata messa a confronto con quella del frumento tradizionale, attraverso la valutazione di parametri istologici e morfometrici. Al fine di effettuare questo studio, in seguito ad una revisione della letteratura internazionale riguardante le colture d'organo, effettuata tramite una ricerca in MEDLINE, si è proceduto preliminarmente alla messa a punto ed alla standardizzazione di una metodologia di coltura d'organo, e successivamente ad un impiego della stessa per valutare la tossicità del Triticum Dicoccum su biopsie di soggetti celiaci. Lo studio è stato condotto su biopsie intestinali eseguite a scopo diagnostico in soggetti con positività dei markers sierologici per la celiachia. Alla luce di quanto presente in letteratura (6-12) e successivamente modificando ed adattando la metodica sulla base della nostra esperienza diretta e dei risultati preliminari ottenuti all interno del presente progetto, siamo arrivati a definire la metodologia per la preparazione del terreno di coltura e del digesto di glutine. Il terreno di coltura prevede la presenza dei seguenti reagenti nelle giuste proporzioni (quantità per 38 ml circa di terreno): Trowell T8 medium (26 ml), NCTC 135 w/l-glut (8 ml), HEPES Buffer 1M (2 ml), Foetal Bovine Seurum (1,5 ml), Penicillin-Streptomycin solution liquid (10000 u/ml) (0,2 ml), L-glutamine 200 mm (0,2 ml). A questi va poi aggiunto, o meno, il digesto del diverso tipo di glutine da testare: gliadine PT-digest 1mg/ml (235 µl), Triticum Dicoccum PT-digest 1mg/ml (235 µl). La preparazione del digesto è stata effettuata seguendo il protocollo descritto in letteratura (5,13,14). In una prima fase, si mantiene il substrato (es:gliadina) per 4 ore in agitazione continua a 37 C e ph 1,8, dopo aggiunta di pepsina e HCl. In una seconda fase, dopo aver portato il ph a 7,8 addizionando NaOH, si aggiunge tripsina e si mantinene a 37 C per 4 ore in agitazione continua. Nella terza fase si filtra il prodotto e si porta il ph a 7 addizionando NHCl. Nella quarta fase si neutralizza l attività enzimatica immergendo il composto in acqua bollente per 15 minuti. Nella quinta ed ultima fase si filtra la soluzione così ottenuta con membrane millipore ESPIANTI Per ogni paziente incluso nello studio, in sala operatoria mediante Esofago-gastro-duodenoscopia (EGDS) con pinza bioptica venivano estratti: 2 campioni di mucosa intestinale per accertamento diagnostico (basale), immediatamente fissati in formalina; 3 campioni da sottoporre a coltura (nel terreno controllo, con aggiunte di glutine di frumento o di farro). Per ogni espianto si è proceduto ad effettuare un corretto orientamento su filtro millipore attraverso un microscopio ottico (ingrandimento 10X - 40X), in modo da ottenere, dopo il processo di inclusione effettuato dall'anatomo-patologo, un posizionamento del frammento bioptico sul vetrino simile a quello presente in vivo ( versante endo-luminale in alto e versante mucoso in basso). In tal modo il successivo studio dei parametri istologici e morofometrici risulta più preciso ed attendibile. INCUBAZIONE Ogni singolo espianto è stato posizionato in appositi dischetti tipo Falcon, coperto con mezzo di coltura e posto in un incubatrice a gas ( atmosfera a 95% 02 e 5% CO2 ) a 37 C per 3 12

14 ore. Durante le fasi di standardizzazione si è valutato il tempo di incubazione: dopo diversi esperimenti con tempi più lunghi (massimo 48h) e successiva valutazione microscopica dei frammenti bioptici, si è concluso che 3 ore appariva come il tempo di incubazione più idoneo. Infatti tale intervallo di tempo permetteva di indurre un danno mucosale glutine-indotto, ma allo stesso tempo di minimizzare gli altri fenomeni di necrosi dovuti a fattori di altra natura. VALUTAZIONE MICROSCOPICA Ogni singolo frammento biotico al termine della coltura è stato fissato in formalina, incluso in paraffina e sezionato. Si è poi proceduto alla valutazioni di determinati parametri morfometrici (end-points): misurazioni lineari dell altezza dei villi e della profondità delle cripte (15), deteminazione del rapporto villo/cripta, conta del numero dei linfociti intraepiteliali (16), misurazione dell altezza degli enterociti (17). ANALISI DEI RISULTATI DELLO STUDIO MORFOLOGICO SU BIOPSIE INTESTINALI In questa fase preliminare sono stati reclutati 23 pazienti in dieta libera con positività dei markers sierologici per MC che necessitavano di EGDS per porre diagnosi. La valutazione dei parametri morfometrici sopra menzionati ha portato ai seguenti risultati. La media delle altezze dei villi basali era 129,07 micron (µm), con una deviazione standard (STD) di 115,04 µm. La media delle altezze dei villi diminuiva dopo coltura a 98,07 µm (STD 69,68 µm) e 96,53 µm (STD 71,11 µm) rispettivamente se in coltura con o senza glutine (Grafico 1). La media delle profondità delle cripte basali era 263,31µm, con una STD di 98,91 µm, mentre dopo coltura era di 246,47 µm (STD 84,22 µm) e di 268,95 µm (STD 133,78 µm) rispettivamente in presenza od in assenza di glutine nel terreno di coltura (Grafico 2). La media dei rapporti villo/cripta era 0,5µm, con una STD di 0,5 µm, mentre dopo coltura era di 0,43 µm (STD 84,22 µm) e di 0,46 µm (STD 133,78 µm) rispettivamente in presenza od in assenza di glutine nel terreno di coltura (Grafico 3). La media dei numeri dei linfociti intraepiteliali basali era 50,39µm, con una STD di 18,91 µm, mentre dopo coltura era di 47,65 µm (STD 84,22 µm) e di 45 µm (STD 133,78 µm) rispettivamente in presenza od in assenza di glutine nel terreno di coltura (Grafico 4). La media delle altezze degli enterociti basali era 20,55 micron (µm), con una STD di 115,04 µm. La media delle altezze degli enterociti diminuiva dopo coltura a 16,1 µm (STD 5,7 µm) e 13,85 µm (STD 6,84 µm) rispettivamente se in coltura con o senza glutine (Grafico 5). 13

15 Grafico 1: MEDIA MEDIA Colt. con glutine Colt. senza glutine Basale Grafico 2: MEDIA m Colt. con glutine Colt. senza glutine Basale 14

16 Grafico 3: MEDIA 1,2 1 0,8 0,6 0,4 MEDIA 0,2 0-0,2 Colt. con glutine Colt. senza glutine Basale Grafico 4: MEDIA Colt. con glutine Colt. senza glutine Basale MEDIA 15

17 Grafico 5: MEDIA MEDIA Colt. con glutine Colt. senza glutine Basale Poiché l'altezza degli enterociti sembrava essere l'unico parametro morfometrico significativo, abbiamo calcolato la media delle differenze tra le altezze degli enterociti basali e dopo coltura, rispettivamente con o senza aggiunta di glutine. Questa media delle differenze era di 4,45 µm (STD 6,7 µm) tra basali e terreno di coltura standard, e 9,79 µm (STD 7,97 µm) tra basali e terreno di coltura con aggiunta di PT-digesto di gliadina (Grafico 6). Grafico 6: MEDIA Serie1 0-5 Basale - no Glut. Basale - con Glut. 16

18 CONCLUSIONI RIGUARDO ALLO STUDIO MORFOMETRICO SU BIOPSIE DI FARRO E stata evidenziata una riduzione dell altezza degli enterociti dopo coltura, sia con che senza glutine, rispetto ai valori basali. Questa riduzione è maggiore nei frammenti bioptici posti in coltura con PT-digesto di gliadina. Gli altri parametri morfometrici (profondità delle cripte, altezza dei villi, rapporto villo/cripta e numero di linfociti intraepiteliali) non hanno mostrato alterazioni significative tra i due gruppi. Questi risultati dimostrano come sia possibile quantificare cambiamenti morfologici durante coltura d organo ed evidenziare la sensibilità mucosale al glutine in soggetti celiaci non in trattamento, utilizzando l altezza degli enterociti come parametro morfometrico d elezione. Tali risultati necessitano di conferma con studi condotti su un più ampio numero di soggetti. TEST IN VITRO CON TRITICUM DICOCCUM Per la valutazione in vitro della tossicità di selezionate line di Farro (Triticum Dicoccum) sono stati reclutati 10 pazienti celiaci in dieta libera. Di ognuno di essi un frammento bioptico è stato posto in coltura in terreno di coltura standard, due in terreno di coltura con aggiunta di PTdigesto di gliadina e di Triticum Dicoccum rispettivamente. E stata testata la linea di Triticum Dicoccum selezionata come quella a minor tossicità sia da precedenti valutazioni che dalle analisi immunoelettroforetiche condotte nell ambito di questo stesso studio. RISULTATI ATTESI NEI TEST IN VITRO CON TRIRICUM DICOCCUM Lo scopo di questa fase dello studio era descrivere eventuali alterazioni istologiche e morfovolumetriche nei campioni incubati con glutine di farro, ed evidenziare una differenza statisticamente significativa tra i risultati delle analisi morfometriche nei campioni bioptici incubati con glutine di frumento e con glutine di farro. RISULTATI DEI TEST IN VITRO CON TRITICUM DICOCCUM L altezza media degli enterociti nei frammenti posti in coltura con PT-digesto di gliadina era 16,07 micron (µm) con una STD di 6,15 µm. L altezza media nei frammenti posti in coltura con PT-digesto di Tritticum Dicoccum risultava di 15,65 µm, con una STD di 5,97 µm. L altezza degli enterociti in campioni posti in coltura con terreno standard era di 16,03 µm con una STD di 6,39 µm (Grafico 7). 17

19 Grafico 7: MEDIA MEDIA 5 0 Colt. Con Farro Colt. Con Glutine CONCLUSIONI RIGUARDO AI TEST IN VITRO CON TRITICUM DICOCCUM Con il presente studio si è standardizzato un metodo di coltura in vitro di frammenti bioptici di mucosa intestinale e si è definita l altezza degli enterociti come parametro morfometrico d elezione. Tale metodologia appare utile per valutare la sensibilità della mucosa intestinale a diverse sostanze, valutando le modificazioni istologiche o morfologiche indotte nella mucosa stessa dalla sostanza in studio. Si è utilizzata tale metodologia per valutare in vitro la tossicità del Triticum Dicoccum, linea 55,58, su mucose intestinali di pazienti celiaci. Non si sono evidenziate differenze statisticamente significative nel parametro morfometrico valutato tra campioni bioptici incubati con glutine di Frumento e con Triticum Dicoccum. Tale risultato appare condizionato dalla limitata numerosità della popolazione esaminata. Risulterebbe utile un eventuale aumento della numerosità del campione con ulteriori saggi ed eventualmente l effettuazione di test su soggetti non a dieta libera ma in stato di alimentazione controllata. RIFERIMENTI BIBLIOGRAFICI RIGUARDANTI LO STUDIO CONDOTTO SU ESPIANTI DI EPITELIO INTESTINALE (1) (2) Spaenij Dekking, Kooy Winkelaar, Koning et.al., Natural Variation in Toxicity of Wheat: Potential for Selection of Nontoxic Varieties for Celiac Disease Patients, Gastroenterology 2005; 129 : Molberg, Uhlen, Sollid et.al. Mapping of Gluten T-cell Epitopes in the bread wheat ancestors: implication for celiac disease. Gastroenterology 2005; 128:

20 (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) Pizzutti, Buda, Martines et.al. Lack of intestinal mucosal toxicity of Triticum Monococcum in celiac disease patients. Scandinavian Journal of Gastroenterology, 2006; 41: Silano, De Vincenzi. In vitro screening of food peptides toxic for celiac and other glutensensitive patients: review. Toxicology 1999; 132: El Asmar, Catassi, Fasano et.al. The microsnapwell system: a new in vitro polarized model for studying the intestinal barrier functions using small intestinal biopsy specimens. J Pediatr Gastroenterol Nutr 2001; 32 (3): 354. Martucci, Fraser, Biagi, Corazza, Ciclitira, Ellis. Characterizing one of the DQ2 candidate epitopes in coeliac disease:a.gliadin toxicity assessed using an organ culture system. Eur J Gastroenterol Hepatol Dec;15(12): Browning, Trier. Organ Culture of Mucosal Biopsies of Human Small Intestine. J Clin Invest Aug;48(8): Myron Falchuk, Strober et.al. Effect of Gliadin on intestinal epithelial cells of patients with gluten-sensitive enteropathy in organ culture. J Clin Invest Feb;53(2): Hauri, Hekkens et.al. Re-evaluation of the technique of organ culture for studying gluten toxicity in coeliac disease. Gut Dec; 19 (12): (10) Falchuk, Kasarda et.al. Gluten-sensitive enteropathy. Influence of histocompatibility type on gluten sensitivity in vitro. J Clin Invest Aug;66(2): (11) Picarelli, Anania, et.al. Forty-Eight Hours of Biopsy Culture Improve the sensitivity of the in Vitro Gliadin Challenge in the Diagnonis of Celiac Disease. Clin Chem Oct;47(10): (12) Troncone, Auricchio et.al. Gliadin activates mucosal cell mediated immunity in cultured rectal mucosa from coeliac patients and a subset of their siblings. Gut Oct;43(4): (13) Van de Wal, Koning et.al. Small Intestinal Tcells of celiac disease patients recognize a natural pepsin fragment of gliadin. Proc Natl Acad Sci USA Aug; 95: (14) Frasr, Ciclitira et.al. Coeliac disease:in vivo toxicity of the putative immunodominat epitope. Gut. 2003; 52: (15) Corazza GR et al., Quantitative assessment of mucosal architecture of jejunal biopsy specimens: a comparison between linear measurements, stereology, and computer aided microscopy. Journal of Clinical Patology 1985; 38: (16) Goldstein et.al., Morfologic features suggestive of gluten sensitivity in architecturally normal duodenal biopsy specimens Am J Clin Pathol 2001; 116: (17) Howle PD et al., Gluten sensitivity of small intestinal mucosa in vitro: quantitative assessment of histologic change. Gastroenterology 1981; 80: