Elettroforesi. Migrazione di particelle cariche sotto l influenza di un campo elettrico

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1 Migrazione di particelle cariche sotto l influenza di un campo elettrico

2 La velocità di una molecola carica che si muove in un campo elettrico è direttamente proporzionale alla forza del campo elettrico (E) e alla carica della molecola (q) ed è inversamente proporzionale alle dimensioni della molecola e alla viscosità del mezzo in cui si muove (forze frizionali f o resistenza): dove f=6πrη v = Eq/f

3 Fattori che influenzano la velocità di migrazione CAMPIONE (Carica, Dimensioni, Forma) TAMPONE (Concentrazione, ph) SUPPORTO (Adsorbimento, Filtrazione molecolare)

4 SUPPORTI Non setaccianti (Carta), acetato di cellulosa Setaccianti Gel di poliacrilammide (PAG) Gel di Agarosio

5 Setaccio molecolare un gel in cui la resistenza al movimento di una particella aumenta all aumentare delle dimensioni della particella stessa In un gel con capacità di setaccio molecolare aumenta la differenza di mobilità tra proteine di diverso peso molecolare Questa è la base per la separazione

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9 Può essere: Nativa Denaturante

10 Nativa Le proteine vengono separate sulla base della loro carica netta e in base alle dimensioni La sua risoluzione è relativamente bassa Discrimina tra proteine con PM uguale ma con carica differente Permette la rapida purificazione e il recupero di proteine in condizioni native Può essere usata per una colorazione catalitica Permette lo studio di proteine polimeriche

11 Denaturante E la metodica che normalmente viene usata per lo studio delle proteine e viene indicata come SDS-PAGE Le proteine vengono separate solo sulla base del loro peso molecolare Le proteine vengono denaturate usando il detergente Sodio Dodecil Solfato o SDS Inoltre si aggiunge ai campioni β- mercaptoetanolo per ridurre i ponti disolfuro

12 Denaturante A ph leggermente alcalino l SDS porta due cariche negative e quindi rende tutta la proteina carica negativamente Il rapporto carica/massa sarà uguale tra le diverse proteine Tuttavia alcune proteine legano l SDS in proporzioni differenti per la presenza di maggiori o minori quantità di residui aminoacidici idrofobici e quindi la loro mobilità elettroforetica sarà diversa da quella attesa sulla base del loro peso molecolare

13 Dato che stiamo cercando di separare molte proteine differenti con diverse forme e dimensioni, ciò che vogliamo per prima cosa è di renderle lineari in modo che le proteine non abbiano più una struttura secondaria, terziaria o quaternaria Perché non solo la massa ma anche la forma di un oggetto determinerà la facilità di movimento in un mezzo

14 Abbiamo quindi bisogno di un mezzo per convertire tutte le proteine alla stessa conformazione Per questo si usa l SDS (sodio dodecil solfato) Detergente anionico che si lega fortemente alle proteine in rapporto di circa una molecola di SDS per ogni due residui di aminoacidi

15 L SDS è un detergente anionico che può dissolvere molecole idrofobiche e possiede una carica negativa (quella del solfato) le proteine saranno solubilizzate ed inoltre esse saranno coperte da molte cariche negative (1,4 g di SDS per 1 g di proteine)

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17 L interazione SDS/proteine: provoca la destabilizzazione della struttura terziaria della proteina denaturandola le conferisce una carica netta negativa rendendo trascurabile la carica della proteina nativa Il risultato è che la proteina assume una forma linearizzata ed una carica negativa approssimativamente proporzionale alla sua massa, in modo che il rapporto carica /massa sarà essenzialmente identico per proteine diverse

18 La separazione dei complessi SDS-proteine (quando sottoposti ad un campo elettrico) avviene quindi in base agli effetti di setaccio molecolare dovuti alle dimensioni dei pori del gel Ciò fa sì che le proteine più piccole si muovano rapidamente attraverso il gel, mentre quelle di dimensioni maggiori rimangono più rallentate, migrando di meno

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20 Proteine con peso molecolare uguale si muoveranno formando delle bande omogenee (appunto per peso molecolare)

21 Se le proteine fossero denaturate e sottoposte ad un campo elettrico in assenza di un mezzo o setaccio molecolare, queste si muoverebbero tutte verso il polo positivo alla stessa velocità (quindi senza separarsi in base al peso molecolare) L ambiente o mezzo preferito è la poliacrilamide che è un polimero di monomeri di acrilamide. Quando si forma questo polimero, esso diventa un gel attraverso il quale faremo passare della corrente elettrica per far muovere le proteine Il gel contenente SDS si chiama SDS-PAGE

22 SDS-PAGE separa le proteine sulla base del loro peso ma non sulla base della sequenza aminoacidica. Per questo se abbiamo molte copie di due proteine diverse ma formate da 500 aminoacidi ognuna, esse migreranno insieme in un unica banda eterogenea Come risultato avremo che con l SDS- PAGE non saremo in grado di separare le due proteine. Si potrà ad esempio usare il 2D PAGE

23 Nella SDS-PAGE si utilizza un gel discontinuo composto da stacking gel nel quale vengono formati i pozzetti in cui vengono depositati i campioni da analizzare running gel (gel di risoluzione) che è la matrice in grado di separare le singole macromolecole

24 Il gel di poliacrilamide è chimicamente inerte e viene preparato facendo copolimerizzare monomeri di acrilamide in presenza di piccole quantità di N,N - metilenbisacrilamide (che viene utilizzata come agente in grado di formare legami trasversali) e di ammonio persolfato e TEMED

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26 La poliacrilamide è il polimero piu utilizzato per la elettroforesi di proteine con PM tra e I suoi vantaggi sono: - notevole resistenza meccanica sia quando sono idratati che quando vengono seccati - completa trasparenza sia nel visibile che nell UV, la trasparenza resta anche quando sono seccati - aderisce bene al vetro evitando che si creino vie preferenziali - La sua porosita puo essere controllata ed e tale che si puo modulare l effetto di setaccio molecolare - E utilizzabile per la elettroforesi sia nativa che denaturante : il monomero e una potente neurotossina

27 I gel di poliacrilamide vengono definiti in base alla percentuale totale di acrilamide (acrilamide+bis-acrilamide) presente e le dimensioni dei pori del gel sono determinate dalle concentrazioni di acrilamide e bisacrilamide impiegate 37.5:1 per le proteine 29:1 per gli acidi nucleici e le proteine 19:1 per il sequenziamento degli acidi nucleici

28 Gel a percentuale bassa (3-5%) possiedono pori di grosse dimensioni e sono utilizzati nei gel di impaccamento (stacking gel) che permettono il caricamento e la concentrazione del campione Il gel di separazione vero e proprio (running gel) ha una percentuale compresa fra il 7,5 e il 20%, in cui le dimensioni ridotte dei pori producono un effetto di filtrazione che contribuisce a separare le macromolecole in base alla loro grandezza

29 Il running gel viene fatto polimerizzare fra due lastre di vetro che sono mantenute parallele e separate da sottili spaziatori di plastica. Normalmente il gel ha uno spessore di mm e le sue dimensioni dipendono dalla risoluzione che si vuole ottenere, di solito 10 x 10 cm Sulla superficie del running gel viene depositata un piccola quantità di acqua o di butanolo per ottenere una superficie piatta

30 Dopo la rimozione dell acqua o del butanolo, al di sopra del running gel viene colato quello che sarà lo stacking gel Prima che il gel polimerizzi si sistema sul lato superiore del gel un pettine di plastica che a gelificazione ultimata viene tolto lasciando nel gel i pozzetti di alloggio per il caricamento dei campioni

31 Quando il gel è pronto, esso viene assemblato nell apparato per l elettroforesi, rappresentato essenzialmente dalla cella elettroforetica costituita da due vasche a contatto con le due estremità del gel Tali vasche, contenenti ciascuna un elettrodo, vengono riempite di una soluzione tampone opportuna (T. di corsa)

32 Dopo aver preparato e depositato i campioni nei pozzetti, tra i due elettrodi viene applicata una differenza di potenziale per mezzo di un alimentatore ed in questo modo si genera un gradiente di potenziale elettrico In queste condizioni, proteine con dimensioni molecolari differenti migreranno in maniera diversa

33 Togliendo il campo elettrico prima che le molecole da analizzare abbiano raggiunto il fondo del gel avremo ottenuto una separazione dei singoli componenti in base alla loro mobilità elettroforetica A questo punto essi vengono visualizzati mediante opportuni metodi di colorazione o di rilevamento

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35 Disc-elettroforesi Elettroforesi discontinua in cui il gel è funzionalmente diviso in due parti: lo stacking gel o di impaccamento e il running gel o di separazione

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37 La disc-elettroforesi, usualmente, si fa verticale con il catodo in alto, così che le proteine migrano verso l anodo in basso Il tampone contenuto nelle due vaschette e identico ed è il tampone di corsa Le proteine (in SDS e β-mercaptoetanolo) vengono caricate nei pozzetti e la maggior densità del campione (dovuta all aggiunta di glicerolo) fa sì che non si mescoli con il tampone di corsa

38 Lo stacking e la separazione Lo stacking viene preparato con: 1. poliacrilamide al 4% (3-5%) e quindi non ha potere di setaccio molecolare 2. Tampone Tris/HCl M ph6.8 e SDS Il running viene preparato con: 1. poliacrilamide al % 2. Tampone Tris/HCl M ph8.8 e SDS

39 Lo scopo della disc-elettroforesi e quello di permettere una separazione molto efficiente delle proteine sulla base del solo peso molecolare Per questo è necessario comprimere le proteine contenute nel pozzetto di caricamento in una banda molto sottile in modo che tutte le proteine siano allineate sulla linea di partenza rappresentata dal bordo superiore del gel di separazione

40 La concentrazione (o impaccamento) delle proteine in una banda sottile viene ottenuta grazie al ph discontinuo Infatti nei due gel sono presenti tamponi (Tris-HCl) a ph diverso (stacking ph6.8 e running ph8.8) Nel tampone di corsa (Tris-Glicina ph8.3) è presente anche un diverso tipo di ioni (Glicinato) Anche il campione è tamponato a ph6.8

41 Il ph dello stacking gel è inferiore di circa 2 unità rispetto a quello del tampone di corsa. In quest ultimo il ph è 8.3 e la glicina è quindi presente per il 95 % sotto forma di ione dipolare (zwitterione CH 2 (NH 3+ )COO - ) e solo per il 5% sotto forma di anione glicinato (CH 2 (NH 2 )COO - )

42 La glicina (presente nel tampone di corsa) è un acido debole e può esistere in due stati uno zwitterione senza carica netta oppure come anione glicinato cioè carico negativamente A basso ph esso è protonato e quindi privo di carica netta A ph più alti (tampone di corsa ph8.3) è carico negativamente

43 Quando si manda corrente elettrica al gel tramite un alimentatore (a voltaggio costante o a corrente costante) cosa accade?

44 Quando viene applicata la corrente gli ioni di glicina nel tampone di corsa si muovono allontanandosi dal catodo (elettrodo negativo) per cui si dirigono verso il campione e lo stacking gel ma con una mobilità inferiore rispetto allo ione cloruro (Cl-) In quel punto il ph è basso (6.8) per cui gli ioni glicina perdono molta della loro carica e rallentano il loro movimento In questo modo la glicina non potrà portare efficacemente la corrente e saranno le stesse proteine a portarla, migrando verso l anodo

45 Allo stesso tempo nello stacking gel e nel campione gli ioni cloruro altamente mobili (carichi negativamente) si muovono per allontanarsi dal catodo Questo crea una zona ristretta nella parte superiore dello stacking gel in cui la conduttanza è molto bassa (cioè c è un alta resistenza)

46 Si osserva un aumento di voltaggio nella zona contenente lo ione glicinato meno mobile ed una diminuzione di voltaggio nella zona contenente lo ione cloruro più mobile Gli ioni di coda tenderanno quindi ad accelerare ed a raggiungere gli ioni di testa mentre gli anioni proteici di mobilità intermedia si troveranno nel mezzo dei due fronti

47 Come risultato si avrà una concentrazione degli anioni proteici a ridosso degli ioni cloruro in ordine di mobilità ionica decrescente. Cl - > proteine > glicinato Le proteine penetrano nel gel di corsa sotto forma di bande sottilissime al seguito dello ione cloruro

48 L effetto di questa zona mobile ad alto voltaggio è che tutte le proteine raggiungono il running gel virtualmente allo stesso tempo così che la migrazione delle proteine è veramente una funzione del peso molecolare e non è influenzata dal modo in cui sono state caricate e dal modo in cui è stato applicata la corrente

49 Quando la massa di ioni in movimento raggiunge il running gel cambia tutto

50 Il ph aumenta di molto (ph 8.8) e la glicina diventa deprotonata (e quindi maggiormente carica negativamente) La mobilità della glicina aumenta di molto e la mobilità delle proteine rallenta di molto a causa delle proprietà di setaccio molecolare del gel La mobilità dello ione glicinato supera quella degli anioni proteici accelerando la propria migrazione

51 Il risultato è che la glicina corre oltre le proteine e quindi queste non si ritrovano più in una zona molto ristretta in cui la resistenza è molto alta e il campo elettrico molto alto Le proteine si ritrovano in un campo elettrico più rilassato e uniforme dove possono muoversi sulla base del loro peso molecolare grazie alle proprietà di setaccio molecolare del gel

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53 Quando gli anioni cloruro sono tutti fuoriusciti dal gel di corsa il ph del gel sale a 9.5 poiché essi vengono sostituiti dagli ioni glicinato più basici In condizioni native, aumenta quindi la carica negativa degli anioni proteici che pertanto migrano in un campo elettrico uniforme con una velocità che dipenderà dal rapporto carica/ massa e dai vincoli imposti dal setaccio molecolare del gel

54 Quando il fronte del colorante (presente nel campione) raggiunge la prossimità del fondo del gel, è il momento di interrompere la corsa Tuttavia se è nota la posizione della banda a più basso peso molecolare (ad esempio caricando un marker di proteine a fianco ai campioni) è possibile lasciare uscire il colorante dal gel

55 Per monitorare la progressione della corsa elettroforetica uno o più pozzetti vengono generalmente dedicati ai markers di peso molecolare Questi sono miscele di proteine precolorate e di peso molecolare noto capaci quindi di indicare la migrazione di proteine di peso molecolare simile

56 Standards di pesi molecolari Proteine incognite

57 La massa molecolare relativa (Mr) di una proteina può essere determinata confrontando la sua mobilità con quella di una serie di proteine standard, delle quali si conosce la massa molecolare relativa, separate sullo stesso gel

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60 E da tenere presente che tramite questa metodica si determina il peso molecolare apparente di una proteina, in quanto alcune proteine, per loro natura (composizione aminoacidica, modificazioni, ecc.) migrano in modo anomalo, non rispecchiando il loro effettivo peso molecolare

61 Standard proteici In commercio sono disponibili diversi standard proteici che coprono un'ampia gamma di pesi molecolari (PM) diversi. Ve ne sono per tutte le applicazioni: per determinare con la massima approssimazione il peso molecolare, per verificare l'efficienza di trasferimento su membrana

62 I marker possono essere non colorati oppure pre-colorati I primi permettono una determinazione più accurata del PM, mentre i secondi sono più adatti per la conferma dell'andamento dell'elettroforesi e del trasferimento su membrana. La maggior parte dei marker precolorati in commercio produce 8-12 bande che possono essere tutte dello stesso colore oppure di colori diversi. L uso di colori differenti facilita l'identificazione del PM di ogni proteina

63 Rivelazione delle proteine su gel Una volta completata l'elettroforesi, il gel deve essere analizzato per avere informazioni sulla posizione e sulla quantità di ogni proteina.

64 Poiché le proteine non sono direttamente visibili, il gel deve essere processato La procedura più comune di rivelazione è la colorazione In genere, dopo che le proteine sono state colorate, il gel viene fotografato o essiccato

65 Colorazione delle proteine totali su gel I kit disponibili sul mercato per la colorazione e la quantificazione delle proteine totali su PAGE includono sistemi rapidi e più o meno sensibili a base di blu Coomassie, kit di colorazione argentica (silver staining), sistemi per colorazione reversibile con zinco o rame e coloranti fluorescenti

66 Ogni sistema di colorazione ha i suoi pregi e difetti: la colorazione con blu Coomassie, ad esempio, è lineare e quindi in grado di fornire una quantificazione più accurata di quanto non faccia il silver staining (non lineare), ma è molto meno sensibile (fino a 100 volte) Coomassie 100 ng Argentica 1 ng

67 Blu Coomassie: Il blu Coomassie si lega alle proteine attraverso legami ionici tra i gruppi sulfonici del colorante e i gruppi amminici delle proteine oltre che attraverso forze di Van der Waals Colorante-SO 3 -+ NH 3 -L-COOH Si aggiunge il colorante in acido acetico e metanolo, si lascia a reagire finche tutto il gel e diventato blu poi si decolora con acido acetico e metanolo

68 Argento: Si fissano le proteine con il metanolo, si aggiunge nitrato di argento che si lega alle proteine Si aggiunge quindi formaldeide in bicarbonato per ridurre l Ag+ ad argento metallico. La reazione viene fermata con acido acetico Il procedimento e analogo a quello dello sviluppo fotografico

69 Conservazione dei risultati Fotografia Scansione ottica Il gel può essere conservato in glicerolo tra due foglietti di plastica sigillati oppure può essere essiccato

70 Coomassie Blue Staining Method Reagents Fixing solution (50% methanol and 10% glacial acetic acid) Staining solution (0.1% Coomassie Brilliant Blue R-250, 50% methanol and 10% glacial acetic acid) Destaining solution (40% methanol and 10% glacial acetic acid)

71 Procedure 1. Fix gel in Fixing solution for 1 hr with gentle agitation. 2. Stain gel in Staining solution for 2 hr to overnight with gentle agitation until the gel is a uniform blue color. 3. Destain gel in Destaining solution. Replenish the solution several times until background of the gel is fully destained. Bands will begin to appear in 1-2 hr

72 Blue Coomassie Argento

73 Emissione di calore Il problema della maggior parte dei tipi di elettroforesi è che la potenza generata nel mezzo in cui passa la corrente viene dissipata sotto forma di calore

74 Il calore può avere i seguenti effetti negativi: aumento della velocità di diffusione dei campioni e degli ioni del tampone che determina la formazione di bande meno definite comparsa di correnti convettive, che portano al mescolamento dei campioni separati denaturazione di quei campioni che sono poco stabili alle alte temperature diminuzione della viscosità del tampone e, quindi, diminuzione della resistenza del mezzo

75 Durante l elettroforesi viene applicato un potenziale costante agli elettrodi l'intensità di corrente però non rimane costante, a causa di variazioni della resistenza del mezzo V=IR o I=V/R

76 Diminuzioni di resistenza determinano un aumento di corrente e quindi del calore sviluppato Per questo motivo si utilizzano alimentatori che impongono una corrente costante In questo modo si eliminano le fluttuazioni di calore e si limitano gli effetti negativi sopra descritti

77 Il costante sviluppo di calore rimane comunque un serio problema Infatti, il tempo che occorre per eseguire l'elettroforesi dipende dall'intensità di corrente Si devono adottare delle condizioni di compromesso con l'uso di intensità di corrente adatte per avere tempi di separazione accettabili Si deve utilizzare un buon sistema di refrigerazione per dissipare il calore prodotto

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