Patologia Generale ONCOLOGIA Prof. Ciminale

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1 Patologia Generale ONCOLOGIA Prof. Ciminale Oncologia: C.I. del Corso di Patologia e Fisiopatologia Generale Prof. Vincenzo Ciminale v.ciminale@unipd.it 10/10/08 Testi consigliati: Tolone, Oncologia Generale, Medical Books IV edizione Tannock, Hill, Brstow, Harrington. The basic science of Oncology. Mc Graw Hill, IV edizione Il professore ritiene il secondo testo migliore ma è solamente disponibile in lingua inglese, raccomanda l attenzione e la presenza alle lezioni. Programma del corso: Lezioni frontali: La trattazione riguarderà i meccanismi che portano alla trasformazione neoplastica. Il percorso di modificazione che porta una cellula sana a diventare tumorale è un processo complesso, multifattoriale e multifasico, infatti, si estende nel tempo, che può essere molto lungo. Suddivisione delle 4 aree di interesse della ricerca Oncologica: Epidemiologia: scienza descrittiva osservazionale che studia la distribuzione di una malattia a livello della popolazione generale e ricerca legami della malattia con elementi ambientali o familiarità. Esempio: cancro al colon retto-lavoro in aree inquinate (porto Marghera) L epidemiologia indica le cause possibili di una neoplasia ne indica l eziologia. Le possibili cause della formazione di una neoplasia possono essere: -fattori esogeni (chimici, fisici, virali) -fattori endogeni (genetiche e ormonali) Patogenesi molecolare dei tumori: il suo fine è comprendere i meccanismi molecolari che permettono a una proteina alterata di far mutare la cellula dove è presente in una cellula neoplastica. Esistono geni che intervengono nella trasformazione neoplastica: -protoncogeni (acceleratore della trasformazione) -oncosoppressori (freno della trasformazione) Fenotipo delle cellule neoplastiche: caratteristiche alterate nella morfologia, utili alla diagnosi molecolare e riconoscimento delle proteine delle cellule mutate. Principali applicazioni cliniche: diagnostica molecolare e terapie del bersaglio (targeted terapie) Le implicazioni pratiche dello studio molecolare sono necessarie al fine di utilizzare la diagnostica molecolare e terapie mirate contro specifiche proteine. Esempio: le cellule tumorali normalmente proliferano maggiormente rispetto alle cellule normali, soluzione: colpire le cellule che proliferano maggiormente che saranno neoplastiche. In realtà la terapia antineoplastica tradizionale (chemio) colpisce anche molte altre cellule che sono in proliferazione. Invece terapie bersaglio colpiscono solo le molecole mutate nelle cellule. Lezioni operative e applicative: come riconoscere le neoplasie in un paziente. Le prime due esercitazioni prevedono la ricerca di alterazioni fenotipiche le ultime due genotipiche. - Giovedì 23/10 Istopatologia: ricerca alterazioni morfologiche del tumore, anatomia patologica tumorale, esempio: osservazioni caratteristiche istologiche e citologiche. - Giovedì 30/10 Turnover cellulare: equilibrio tra velocità di proliferazione e di morte cellulare, valutazione delle velocità. - Giovedì 6/11 Citogenetica: ricerca mutazioni cromosomiali molto grandi - Giovedì 13/11 Oncologia molecolare: mutazioni genetiche puntiformi. Definizione di neoplasia Una neoplasia è una massa abnorme di tessuto la cui crescita ECCEDE e NON E COORDINATA con quella del tessuto normale e PERSISTE nella stessa maniera eccessiva dopo la cessazione dello stimolo che l ha provocata

2 -Willis,1952 Crescita che eccede: rigonfiamento senza coordinazione che PERSISTE, l aumento di compartimenti cellulari possono indicare crescita neoplastica non regolata che continua ad essere alterata nel tempo. Cancer is a group of disease characterized by uncontrolled GROWTH and SPREAD of abnormal cells. If the spread is not controlled, it can result in death (A.C.S.) Nomenclatura Esistono 2 grandi tipi di tumori, essi sono classificati in base ai foglietti embrionali da cui derivano: Carcinomi endoderma Sarcomi mesoderma Sito utile: www. cancer.gov Principali carcinomi: polmone, mammella, colon retto, vescica, prostata Principali sarcomi: adipe osso, muscolo. Neoplasie ematologiche (liquide): -leucemie: cellule neoplastiche presenti nel sangue periferico -linfomi: originati dai linfociti B o T, possono dare leucemie ma danno di solito andamento linfoma toso e si accumulano negli organi linfoidi come timo e milza e non sono visibili nel prelievo di sangue periferico. A seconda della derivazione del tumore prendono nomi particolari: Ghiandole adenomi (benigni) adenocarcinomi (maligno) Cartilagine condroma (benigno) condrosarcoma (maligno) Muscolo liscio meiomiomi (benigno) meiosarcomi (maligno) Muscolo striato rabdomiomi (benigno) rabdomiosarcomi (maligno) Ecc vedi slide. Patologie neoplastiche e sanità pubblica Il tumore è la seconda causa di morte dopo le patologie cardiovascolari. -1individuo su 3/4 si ammala di tumore nel corso della vita; -1 individuo su 4/5 soccombe al tumore; -in Italia più di morti per tumore in un anno. La distribuzione dei tumori varia a seconda dell incidenza, esistono 3 tipi principali di tumore: Uomo: prostata polmoni - colon retto Donna: mammella polmoni - colon retto La mortalità dipende anche dal tipo di tumore, i tumori polmonari che sono al terzo posto come incidenza sono al primo posto per mortalità. Ci sono diversi gradi di mortalità: polmone è definito big killer, il tumore prostatico è maggiormente trattabile, carcinoma duttile del pancreas (organo che ha una componente endocrina e una esocrina) è particolarmente difficile da trattare, altissima la mortalità. Il mesotelioma è un tumore con altissima mortalità e incidenza bassa, causato dall inalazione di fibre d amianto, si prevede che nei prossimi anni ci sarà un picco dei casi di mesotelioma. Altre neoplasie sono meno aggressivi. Epidemiologia dei tumori Qual è la principale causa dei tumori? L età. L 87% dei tumori insorge dopo i 55 anni; ciò è causato dall invecchiamento cellulare a livello molecolare. Esistono anche sindromi che causano invecchiamento precoce ciò causa aumento dell insorgenza dei tumori. Esempio del tumore della prostata: tutti entro i 90 anni sviluppano focolai di cellule neoplastiche, la sua penetranza è completa al 100% entro 100 anni d età. Ci sono alcune eccezioni: tumori pediatrici o morbo di Hodgkin ha andamento bifasico e presenta 2 picchi di insorgenza a anni e dopo i 40 anni.

3 Etiologia dei tumori IARC- International agency for research on cancer. Esamina continuamente letteratura e studi per identificare nuove sostanze potenzialmente cancerogene e identificano e classificano le sostanze a seconda della loro cancerogenicità. Esempi di sostanze cancerogeniche: - Aflatossina: cancerogeno chimico, tossina prodotta dal fago Aspergillus flavus, provoca tumori epatici, è spesso presente nelle arachidi contaminate; - Asbesto (amianto): materiale isolante usato nelle costruzioni, auto, freni, ecc. provoca mesotelioma pleurico e tumore al tratto gastrointestinale - Benzene: usato nelle benzine come detonante oltre che in vernici, colle e colori. Provoca leucemia e linfomi di Hodgkin - Cromo e suoi composti (cromo esavalente): pigmenti e colori. Provoca tumori polmonari. - Dietilstilbestolo: provoca tumori di vulva e vagina. - Ossido di etilene: presente negli additivi per il controllo della maturazione della frutta. Provoca leucemie - Helicobacter pilory: agente infettivo batterico cancerogeno. Provoca cancro allo stomaco. - Virus infettivi come epatiti B e C: Provocano neoplasie al fegato. - Naftilamina: Provoca tumori vescicali. - Radon: gas radioattivo presente nelle miniere, nelle buche e avvallamenti si accumula nei punti declivi e nell acqua. - Radiazioni solari: Componente ultravioletta della luce è dannosa anche grazie al buco dell ozono. - Cloruro di vinile: presente negli stabilimenti di porto Marghera. Provoca angiosarcomi del fegato. Misture: Fumo di sigaretta: rischio oncogenico e di arterosclerosi; Eccesso di bevande alcoliche: rischio epatico. Cosa fare? Prevenzione: -Primaria: prevenzione attraverso rimozione fattori di rischio/causali -Secondaria: intervengo e modifico evoluzione malattia consentendo terapia curativa, diagnosi precoce e individuazione lesioni preneoplastiche, utilizzo: screening di massa screening soggetti a rischio Cancerogenesi: Etiologia. Agenti causali: età - predisposizione ereditaria(5%) ambiente (10%) virus (10%) Patogenesi (alterazioni genetiche e/o epigenetiche multiple): attivazione protoncogeni e inattivazione geni oncosoppressori. Fenotipo: hallmarks of cancer tratti caratterizzanti fenotipici dei tumori. Hallmarks: Proliferazione aumentata e incontrollata; le cellule diventano insensibili agli stimoli antiproliferativi. Resistenza all apoptosi. Capacità di auto sostenere l angiogenesi. Potenziale re plicativo illimitato, nelle cellule normali è presente un potenziale re plicativo limitato, un orologio replicativo ovvero la lunghezza dei telomeri che permettono 30 proliferazioni e poi bloccano la proliferazione; le cellule tumorali riallungano i telomeri e hanno potenziale re plicativo illimitato. Capacità di invadere tessuti e acquisire fenotipo metastatico. Capacità di evasione dal sistema immunitario. Instabilità genetica, compromissione del fenotipo e acquisizione di un fenotipo impreciso tale da accumulare mutazioni. 13/10/2008 Nella lezione precedente c eravamo fermati a questa diapositiva: dopo aver visto alcuni esempi dell importanza degli studi epidemiologici nella ricerca delle cause e diverse malattie della patologia neoplastica in particolare avevamo fatto riferimento a questo schema generale che sarà visto a più riprese nel corso delle lezioni.

4 Avevamo abbozzato una divisione in : 1) EZIOLOGIA: complesso delle cause che portano all insorgenza di neoplasie. Le principali sono: Invecchiamento, probabilmente il fattore principale; Fattori Ambientali; Alterazioni Ereditarie, cioè mutazioni genetiche ereditate dal paziente; Agenti Infettivi. Tali diverse cause producono in un alterazione delle proprietà delle cellule neoplastiche con vari meccanismi patogenetici. Possono essere divisi in 2 grandi tronconi, che sono rappresentati dalle Alterazioni GENETICHE: Alterazioni che coinvolgono una o più sequenze geniche Tali alterazioni sono a carico di una serie di geni che sono divisi in base alla loro azione: Protoncogeni: geni che favoriscono lo sviluppo del fenotipo neoplastico; Geni Oncosopressori: geni che contrastano lo sviluppo di neoplasie. Ricordiamo per questo caso l esempio del pedale dell acceleratore e del freno sul processo di trasformazione neoplastica. Nella maggior parte dei casi le Mutazioni sono mutazioni acquisite dal paziente; le Mutazioni Ereditate coprono circa il 5 % delle cause eziologiche. Attenzione a non confondere che mutazioni in generale con le mutazioni ereditate dal paziente. Esempio: esiste una mutazione X che favorisce l insorgenza di tumori; questa mutazione può essere o ereditata dal paziente da uno dei due genitori, oppure acquisita dal paziente nel corso della vita: lo stesso tipo di mutazione X sullo stesso tipo di Gene. Ciò che fa la differenza è la TRASMISSIBILITA, ossia che questa mutazione si trovi nella linea germinale. Quindi la mutazione X e sempre nella cellula tumorale perche da il fenotipo tumorale; questa mutazione può venire o dalla linea germinale oppure può essere ereditata ma acquisita nel corso della vita dalla cellula tumorale. Vi sono i complessi delle Mutazioni Multifasiche: più mutazioni che impiegano tempo per accumularsi nel paziente. Per tale motivo la causa dell Invecchiamento è così importante: ci vuole del tempo perche procurino questo fenotipo neoplastico. Le neoplasie quindi si possono vedere come una patologia Age-Related, poiché il processo di Invecchiamento è caratterizzato tra le varie cose dall accumulo di mutazioni. La Bussola, identificata da Weimer nel 2000 che riassume i principali tratti comuni o distintivi. Il punto fondamentale della patologia tumorale è l accumulo delle mutazioni. Queste mutazioni tuttavia possono non essere Alterazioni Genetiche, cioè può essere che il gene coinvolto nella patogenesi tumorale non sia mutato. Può essere che vi siano delle Alterazioni EPIGENETICHE: Alterazioni che non coinvolgono la sequenza genica, ma coinvolgono quelle modificazioni che regolano l Espressibilità di quel gene. Esempio: Alterata metilazione e alterata acetilazione degli Istoni. La differenza tra Alterazioni Genetiche e Alterazioni Epigenetiche è molto importante dal punto di vista della diagnostica molecolare del paziente: se non si trovano mutazioni genetiche in un paziente, perché gli strumenti della diagnostica molecolare non ne trovano, bisogna ricordarsi che potrebbero esserci anche delle mutazioni epigenetiche, le quali vanno ricercate con altre metodiche. Il nostro Genoma non è contenuto soltanto nel Nucleo. Le cellule hanno: il Genoma Nucleare: quello cui normalmente pensiamo, contenuto all interno del Nucleo; e il Genoma Mitocondriale. Vi sono alcune patologie che sono legate alla trasmissione di mutazioni del DNA Mitocondriale, che hanno una caratteristica trasmissibilità per via materna. Sono stati trovati alcuni tumori in cui ci sono mutazioni del DNA mitocondriale. Inoltre le mutazioni a carico del DNA Mitocondriale andranno a colpire molto probabilmente le subunità della catena respiratoria. Soltanto una parte delle sub unità della catena respiratoria sono codificate nei Mitocondri. Le rimanenti sono prodotte dal Genoma Mitocondriale, il quale è molto compatto (non ha Introni e ha poche sequenze Intercalanti) e codifica principalmente: -per subunità della catena respiratoria o della ATP-asi di membrana; - per trna mitocondriali, diversi da quelli citoplasmatici; -per Rna Ribosomiali mitocondriali. Il Mitocondrio ha quindi un macchinario suo per la sintesi delle proteine. Quindi una mutazione a carico del DNA Mitocondriale darà un difetto di trasporto di Elettroni da un complesso all altro della catena respiratoria. Questi Elettroni andranno a interagire con l Ossigeno circostante generando dei radicali liberi (esempio: Perossidi, Superossidi, ecc.), i quali a loro volta danneggiano tutte le macromolecole cellulari tra

5 cui anche il DNA Nucleare. Esempio classico: Otooxogualmina, uno dei principali danni prodotti dall Ossigeno sul DNA Nucleare. Tale processo va sotto il nome di OXIDATIVE STRESS: si crea un circolo vizioso in cui le mutazioni del DNA Mitocondriale provocano mutazioni sul DNA Nucleare. Mutazioni del DNA avvengono frequentemente, e non solo per cause esogene (mutageni ambientali), ma anche per cause endogene (come effetti collaterali della catena respiratoria o come effetti collaterali dell attività metabolica, come le reazioni di trans metilazione che modificano il DNA). I meccanismi adibiti a riparare tali mutazioni mantengono la stabilità del Genoma, e se smettono di funzionare correttamente possono portare a delle patologie tumorali. Vi sono infine delle mutazioni dovute ad errori replicativi nel ciclo cellulare: il macchinario sintetico DNA polimerasico che replica il DNA può andare incontro a degli errori che sono corretti da sistemi appositamente dedicati (sistema del MISMATCHED REPAIR). CANCEROGENESI = perturbazione dell omeostasi tissutale il cui il numero di cellule contenuto in un dato organo o tessuto non è più conservato ai suoi livelli fisiologici, ma si osserva un accumulo di massa tumorale. Tale massa acquisterà delle ulteriori caratteristiche patologiche che daranno a queste cellule il POTENZIALE INVASIVO, che porterà alla meta statizzazione a distanza. Da un punto di vista anatomopatologico l accumulo di cellule in un determinato tessuto è classicamente distinto in: IPERTROFIA: aumento del volume di un tessuto per aumentato volume cellulare. Esempio: nel musc. Scheletrico e nel musc. Cardiaco, l atleta che fa un esercizio soprattutto di tipo anaerobico ha uno sviluppo massivo del volume del muscolo per aumentato volume cellulare. Esempio: l Ipertensione sistemica si associa a ipertrofia del Ventricolo sinistro. IPERPLASIA: aumento del volume di un tessuto per aumentato numero di cellule. Quest aumento non è necessariamente legato ad una Neoplasia. Esempio: iperplasie dell Utero e della Mammella durante le fasi estrogeniche del ciclo mestruale, aumento del numero di cellule che tuttavia mantengono le caratteristiche morfologiche e funzionali proprie di quel tessuto. METAPLASIA: sostituzione di un tipo cellulare differenziato in un altro, una specie di riprogrammazione del pattern di differenziazione di quel tipo di cellula. Esempio: nell Epitelio di rivestimento bronchiale dei fumatori le cellule di Epitelio pseudostratificato diventano cellule di Epitelio squamoso. Tali alterazioni sono in genere reversibili (alla cessazione dello stimolo le cellule ritornano alla loro differenziazione normale) e non patologiche (apparte alcuni casi). DISPLASIA: alterazione del processo di differenziazione cellulare che si accompagnano a due tipi di modificazioni: o modificazioni Citologiche, in cui una cellula acquisisce si per se delle caratteristiche che la distinguono dalle cellula normali che le stanno vicino. Esempi: PLEOMORFISMO: cellule diverse le une dalle altre; ANOMALIE NUCLEARI: rapporto Nucleo Citoplasma alterato, colorazione istologica del Nucleo diversa; MITOSI ATIPICHE: Mitosi tripolari o quadri polari con tre o quattro fusi mitotici; Mitosi non solo nello strato deputato alla moltiplicazione ma anche in altri strati (Esempio: Mitosi non solo nello Strato Basale ma anche in quelli superficiali); POLARITA: alterazioni di posizione: in molti tessuti la proliferazione cellulare è limitata ad alcune aree. Esempio: nell Epidermide la proliferazione avviene nello strato basale; nella Displasia invece si potranno trovare cellule in mitosi anche verso lo strato cheratinizzato; o Perdita di architettura tissutale: l organizzazione spaziale normale che caratterizza il tessuto è persa. ANAPLASIA: esempio estremo di displasia, significa assenza di differenziamento: le cellule perdono qualsiasi caratteristica morfologica che caratterizza quel tipo cellulare diventando simili a cellule embrionali CARCINOMA IN SITU = cellule con fenotipo tumorale contenute nel tessuto da cui originano. Normalmente un tessuto tumorale acquisisce il fenotipo di invasività; tuttavia nelle prime fasi, in cui tali cellule sono contenute all interno del tessuto di origine, prendono tale definizione. La Displasia è SEMPRE un fenomeno di tipo patologico, a differenza di fenomeni quali Ipertrofia, Iperplasia e Metaplasia che possono essere fenomeni fisiologici. Tuttavia non tutti i tipi di Displasia sono di tipo precanceroso; inoltre nelle sue forme più lievi è un fenomeno reversibile.

6 Esempio:. Nei Tumori di origine virale le displasie della Cervice Uterina possono essere reversibili. Normalmente sono valutati nei Pap Test, esame citologico che si fa sulle cellule epiteliali rilasciate nella Cervice; non si valuta l architettura cellulare ma le singole cellule. Le cellule displastiche sono poi catalogate come Displasie di diversi gradi (CIN: Cervical Intraepitheliar Neoplasia) CIN I: Displasia lieve; REVERSIBILE CIN II: Displasia moderata; REVERSIBILE CIN III: Displasia grave. IRREVERSIBILE, danno un elevato rischio di progredire verso il Carcinoma della Cervice Uterina propriamente detto. ALTERAZIONI PRECANCEROSE = patologie non ancora neoplastiche che hanno un rischio relativo elevato di diventare tumori. (rischio relativo: una persona con alterazione precancerosa ha un rischio volte maggiore di contrarre un tumore rispetto ad una persona senza tale alterazione). Esempio di alteraz. Precancerose: Displasie Cervicali ad alto grado; Esofago di Barret, o Metaplasia intestinale dell Esofago: Metaplasia dell Epitelio di rivestimento dell esofago che diventa simile all Epitelio dello Stomaco o dell Intestino. Fenomeno associato a problemi di Reflusso Gastroesofageo di succo acido. Fattore di rischio notevole per il Carcinoma Esofageo, uno dei più aggressivi che si conosca. È monitorato con le Gastroscopie; va trattato utilizzando dei Farmaci inibitori delle pompe protoniche dello stomaco; Gastrite cronica atrofica in Anemia perniciosa: fattore di rischio per il Carcinoma gastrico; Polipi villosi dell Intestino; Rettocolite ulcerosa: malattia infiammatoria cronica che da un rischio notevole di sviluppare Canrcinomi del Grosso Intestino; Leucoplachie, soprattutto orali: lesioni epiteliali biancastre che si possono riscontrare a livello della mucosa orale; Criptorchidismo (ritenzione del Testicolo): rischio aumentato di tumori al Testicolo; Neoplasie Ereditarie: non c è una lesione anatomopatologica precancerosa, ma il paziente presenta delle mutazioni che aumentano il rischio di contrarre una Patologia Neoplastica. Classificazione di un tumore si fanno in base a CRITERI ANATOMICI: importanti perché alla sede anatomica di un Tumore sono legate: la sintomatologia, (Esempi:. Un Tumore cerebrale darà dei sintomi neurologici da compressione endocranica; un Tumore del Pancreas darà Ittero del paziente per compressione delle vie biliari) evoluzione clinica, prognosi e trattamento (Esempi:. Vi sono dei tumori resecabili chirurgicamente a altri no in base alla loro sede anatomica) CRITERIO MORFOLOGICO: aspetto macroscopico: colloide, midollare, ecc. e aspetto microscopico: classificazione istogenetica: cercare di capire da quale tessuto origina quel tumore. Aspetto non banale: vi sono organi complessi che hanno al loro interni più tipi cellulari. Esempi: un tumore del Pancreas può originare dagli Acini, dal loro Epitelio, dall Epitelio dei dotti, dalle Cellule α o β delle isole del Langerhans.. Oppure potremmo trovarci di fronte a un tumore di derivazione chiaramente metastatica, con le sue Cellule individuate nel Linfonodo, in assenza di un Tumore primitivo; esistono molti casi in cui è diagnosticata prima la metastasi linfonodale, senza capire da dove sia partito il tumore primitivo. Solo nel 10% dei tumori metastatici si riesce ad individuare il Tumore primitivo. La classificazione istogenetica può essere difficile in caso di Tumore fortemente anaplastico, in cui le caratteristiche di differenziazione di un tumore sono completamente perse. Per fare tale classificazione vi sono dei criteri morfologici per determinare a cosa assomigliano queste cellule; inoltre vi sono dei Marcatori specifici per alcuni tessuti. Infine questa classificazione è importante per vari motivi, ad esempio vi sono dei tipi di Tumori che rispondono ad un trattamento in base alla loro origine istogenetica. GRADING; GRADO ISTOLOGICO DI MALIGNITA :valutazione soprattutto a livello citologico e in parte anche istologico del grado di differenziazione, dell anomalia morfologica del tumore; somiglia alla valutazione del grado di Displasia di un tumore. È distinto in grado 1, 2, 3 e in alcuni casi 4 a seconda di una valutazione

7 occhiometrica (il Professore dice così, bah..) del patologo: questi conta le Cellule nel campo del vetrino e riporta quante secondo lui sono indifferenziate. I gradi sono: 1) Cellule differenziate dal 75% al 100% del totale cellulare; 2) Cellule differenziate dal 50% al 75% del totale cellulare; 3) Cellule differenziate dal 25% al 50% del totale cellulare; 4) Cellule differenziate dal 0% (tutte le Cellule sono indifferenziate) al 25% del totale cellulare. Bisogna ricordare che più alto è il grado, più alta è l indifferenziazione. Inoltre la valutazione del grado è abbastanza soggettiva. Il Patologo nel valutare il Grading prende in considerazione: - attività mitotica; - stroma - membrana basale; - infiltrazione capsula ; - invasione vascolare; - filamenti intermedi (Cheratine, esempio classico di molecola ricercata in diagnostica: si può valutare se una Cellula epiteliale è normale se ha lo stesso pattern di Cheratine delle Cellule normali); - molecole di differenziazione sulla superficie cellulare (nelle Neoplasie emolinfopoietiche tutte le molecole della classe CD, che significa Cluster Differentiation, le quali caratterizzano un cero tipo cellulare Quindi nella Leucogenesi chimica i Linfociti T maturando nel Timo sono prima doppio negativi, poi doppio positivi, poi CD4 ed infine CD8. Individuando il marcatore sul Linfocita T si può quindi risalire al luogo dell oncogenesi.). STAGING; CLASSIFICAZIONE IN STADI: serve a valutare l estensione della malattia. Si valuta per esempio il diametro di un Tumore primitivo e l invasività del tumore, se quindi ha infiltrato Linfonodi o ha dato Metastasi a distanza. Ci dice quanto il Tumore è diffuso nel Paziente. Per valutare quindi la Prognosi di un Paziente sarà più importante valutare lo Staging del suo tumore: esso è il parametro clinico per eccellenza che definisce Prognosi e Trattamento, il tipo di Terapia del Paziente Notando il grafico (vedi lucidi) si può notare come la Prognosi del paziente riportata in Ordinata si correla in genere con il grado istologico del tumore. Normalmente un grado alto si associa ad una serviva o prognosi peggiore per il Paziente. Questa è una misurazione soggettiva non precisissima, tuttavia in genere ci può dare delle informazioni per valutare la malignità del Tumore. Questo è uno schema generico. Ci sono delle eccezioni: tumori in cui le varianti ad alto grado (Cellule poco differenziate) hanno una Prognosi più fausta delle varianti a basso grado. Ad esempio i Linfomi B in cui gli alti gradi rispondono meglio alla Chemioterapia: essendo Cellule meno differenziate che proliferano di più tendono a rispondere meglio alla Chemioterapia, in quanto questa agisce sulle Cellule in Mitosi. Volendo estrapolare i dati fondamentali che TUMORE BENIGNO TUMORE MALIGNO differenziano un Tumore benigno da un Tumore maligno Velocità di crescita Lenta Rapida Tipo di crescita Espansiva Invasiva Metastasi No Si (possibile) Anaplasia (grado di differenziazione, morfologia) Segni Generali (dimagrimento, debolezza, ecc.) No No Si (possibile) Si Questo succede nella maggior parte dei casi ma non sempre: dipende dal tipo di tumore; Il Tipo di crescita e Metastasi sono i 2 fattori più importanti per determinare la malignità del tumore; Criterio accessorio. Questo succede nella maggior parte dei casi ma non sempre. Criterio accessorio. Questo succede nella maggior parte dei casi ma non sempre. Probabilmente la stadi azione è un parametro che ci avvicina molto alla valutazione prognostica del Paziente perché ci dice quanto diffusa è la Neoplasia nel Paziente. Questo concetto implica che il tratto fondamentale dei Tumori maligni è l invasività: un tumore è maligno se ha un

8 fenotipo fortemente invasivo e se cresce per invasione piuttosto che per espansione locale. Un tumore che si diventa molto grosso, crescendo molto velocemente ma senza il fenotipo invasivo sarà un tumore benigno; invece un tumore che cresce lentamente ma che diventa subito invasivo sarà maligno. In generale un tumore porta alla morte del paziente perché metastatizza. Ci sono tuttavia delle eccezioni: ad esempio i Tumori cerebrali possono uccidere un paziente per ipertensione endocranica anche prima o senza essere diventati metastatici. Invece un Tumore al Fegato uccide perché va in metastasi, non perché si espande nel fegato. In generale un Tumore non acquisisce immediatamente un fenotipo di malignità in quanto la sua formazione é un processo multifasico; vedremo in molti esempi (anche clinici) dei Carcinomi colon-rettali come la progressione anche istologica da Papilloma a Carcinoma sia dovuta a ben precise mutazioni geniche. In base alle conoscenze fin oggi ottenute si sa che un Tumore passa sempre per stadi intermedi in cui non ha un fenotipo invasivo. In alcuni casi si é scoperta la patogenesi molecolare di ciascuno stadio di avanzamento del fenotipo neoplastico. Se si vuole valutare un paziente con patologia neoplastica e stadiarlo la cosa migliore da fare é valutare quanto la malattia sia diffusa nel paziente. Per farlo esistono una serie di Parametri che sono 4, e permettono di capire quanto la malattia é diffusa nel paziente. Questi sono: lo staging clinico: l'analisi clinica convenzionale del paziente; lo staging radiografici: si eseguono mediante TAC, Risonanza Magnetica o PET (Tomografia ad Emissione di Positroni) in cui si sottopone il paziente a queste indagini e si analizzano le dimensioni del tumore primitivo, se ci sono linfonodi interessati, se ci sono localizzazioni a distanza, ecc.; lo staging chirurgico: qualora al paziente sia diagnosticato un Tumore va incontro ad una operazione chirurgica in cui il Chirurgo non si limita solamente a rimuovere la massa tumorale ma provvede a fare un'analisi del paziente. Ad esempio nel tumore al Colon Retto il Chirurgo in sede operatoria va a vedere se vi sono linfonodi regionali interessati, se il Peritoneo é interessato, se il Fegato é intatto, ecc.; lo staging patologico: in sede operatoria il Chirurgo provvede a fare dei prelievi bioptici che sono analizzati in estemporanea dal Patologo. Questi parametri servono a fornire una Prognosi, cioè per dire la probabilità del paziente di sopravvivere dopo 5 anni. Inoltre danno indicazioni sulla terapia: tumori di stadi diversi sono trattati con diverse terapie. Infine serve anche per stabilire il Follow-Up del paziente: per analizzare i risultati di una terapia il paziente è sottoposto a delle stadiazioni periodiche più o meno frequenti a seconda del tipo di Tumore per vedere se questo viene fuori di nuovo. Ovviamente la stadiazione secondo criteri definiti é importante per rendere comparabili le osservazioni tra una clinica e l'altra: un Carcinoma stadiato a Padova deve essere stadiato nella stessa maniera di un Carcinoma stadiato a Boston. Una volta fatta la stadiazione le valutazioni emerse sono valutate in uno score che è data sul sistema TNM (Tumore; Noduli o linfonodi; Metastasi). Con questo sistema si valuta quanto grosso é il Tumore primitivo, se ci sono Linfonodi interessati e se ci sono metastasi a distanza. A ciascuno stadio sono poi associati dei numeri che vanno da T0 a T4 per esempio a seconda di quanto grande é il tumore primitivo: più grande sarà il tumore primitivo più alto sarà il numero associato. Lo stesso concetto è applicato ai linfonodi: N0 se non ci sono linfonodi interessati, da 1 a 3 se sono più o meno interessati sia come dimensioni sia come numero, e X se non ci sono dati sufficienti Infine la Metastasi ha solo 2 stadi: 0 per assenza di metastasi a distanza, e 1 per presenza di metastasi a distanza. Questi numeri sono poi messi insieme (ad esempio un paziente potrà essere T3, N1 e M0) e riassunti in uno stadio del tumore che nella maggior parte dei casi va da 1 a 4, anche se ogni tipo di tumore ha una sua stadiazione particolare. Ad esempio nel Carcinoma dell'esofago l'estensione del tumore è valutata a seconda di quanto il tumore si approfondì negli strati del tessuto adiacente: T1 invade la Tonaca Mucosa e Sottomucosa; T2 la Muscolare; T3 la tonaca Sierosa; T4 oltre la sierosa. La sopravvivenza del paziente ha una fortissima relazione con la stadiazione del tumore, quindi più lo stadio é avanzato e meno pazienti saranno sopravvissuti dopo diverso tempo. Alterazione della proliferazione cellulare Patogenesi tumorale significa diverse cause che si traducono in mutazioni genetiche o epigenetiche che colpiscono uno o più dei cosiddetti hallmarks delle cellule tumorali. Di questo hallmarks forse il più ovvio e il primo ad essere scoperto per ordine di tempo é rappresentato dal fatto che spesso le cellule tumorali proliferano di più delle cellule normali, o proliferano in modo abnorme.

9 Queste cellule quindi acquisiscono autosufficienza dai segnali che controllano normalmente la crescita cellulare e insensibilità agli stimoli negativi che inibiscono la proliferazione. Semplificando si può pensare al fenotipo neoplastico come ad una alterazione in cui un pool di cellule tumorali è paragonato ad un lavandino: questo può essere più pieno o più vuoto a seconda di quanto è riempito il rubinetto di carico e a seconda di quanto è svuotato il rubinetto di carico. Questi due rubinetti sono rappresentati dal processo di proliferazione, che é il rubinetto di riempimento, e dal tappo di scarico che é rappresentato da una serie di processi tra cui quello principale é il processo che regola la morte cellulare programmata, o Apoptosi. I due processi insieme vanno sotto il nome di Sell Turnover, o Turnover Cellulare: equilibrio che c'é tra velocità proliferativa e velocità di morte cellulare. Proliferazione Cellulare. La Proliferazione Cellulare non é una caratteristica delle cellule tumorali; ci sono molte cellule che replicano fisiologicamente, per esempio le cellule dei compartimenti staminali dei diversi organi (Stem Cells). Queste cellule staminali hanno la capacità di replicare e la capacità di differenziale in uno spettro più o meno ampio di tipi cellulari. Nei nostri tessuti adulti ad esempio le cellule staminali dell'intestino possono differenziarsi in tutte le cellule intestinali. Le cellule staminali embrionali (Embrionic Stem Cells) hanno una capacità proliferativa topipotente, possono dare origine a tutto l'organismo; ad esempio nei topi knock-out si prendono delle cellule staminali, si cambia qualche gene e ripiantandolo nella blastocisti si rigenera tutto il topo. Le cellule staminali hanno delle caratteristiche distintive: capacità di auto rinnovamento prolungata (Cell Renewal): tali cellule non hanno quella specie di orologio replicavo dovuta all'accorciamento delle estremità telomeriche; possono quindi andare incontro ad un numero indeterminato di replicazioni. Capacità di replicazione asimmetrica: questo é forse il tratto che più le distingue da altre cellule replicanti. Quando una cellula si replica, una delle due cellule figlie resterà staminale mantenendo il fenotipo di staminalità, mentre l'altra comincia a differenziare. E' emerso che come i tessuti normali anche i tessuti tumorali in alcuni casi hanno una popolazione tumorale, quindi anche un tumore é mantenuto da una frazione piccola di cellule staminali, che sono in grado di rigenerare tutto il tumore. La loro funzione é quella di rendere rinnovabili i nostri tessuti, fenomeno dall'importanza decisiva nella longevità dell'organismo. Tuttavia questa rigenerabiltà ha un prezzo: veniamo esposti alle patologie della replicazione, in modo primari dalle patologie tumorali. Questo meccanismo é stato in parte limitato dallo sviluppo dei geni oncosopressori. Questi elementi staminali sono contenuti in genere in compartimenti anatomici ben definiti, dette Nicchie o Niche in inglese; tali cellule staminali sono sempre una frazione molto piccola del loro determinato tessuto Ad esempio le cellule staminali dell'epitelio intestinale si trovano nelle Cripte intestinali; non proprio nella parte più inferiore, dove sono localizzate le cellule di Paneth, ma subito sopra; nel Fegato le cellule staminali sono localizzate nei Canali di Herring; nella Cornea le cellule staminali sono localizzate nel limbo tra Cornea e Congiuntiva Le slides indicate sono quelle del secondo file. La replicazione cellulare non è una caratteristica peculiare delle cellule tumorali. Noi siamo organismi che mantengono un potenziale replicativo nella maggior parte dei nostri organi soprattutto, ma non soltanto, nei compartimenti staminali (accenni nella lezione precedente). La patologia tumorale vista come patologia del processo replicativo è il prezzo pagato per mantenere questo compartimento di cellule proliferanti e rinnovabili nei nostri tessuti. A differenza degli organismi più semplici manteniamo dei compartimenti staminali che ci danno la rinnovabilità dei tessuti rendendoci quindi più longevi rispetto agli organismi più semplici. Questo ci espone a queste patologie della proliferazione cellulare. Infatti molti tipi di tumori possono insorgere nella più grande varietà di tessuti capaci di andare incontro a proliferazione cellulare. Prima di entrare nel merito delle alterazioni del ciclo cellulare nelle patologie neoplastiche ricordiamo dei concetti di base della regolazione del ciclo.

10 Il ciclo cellulare è suddiviso in 4 fasi in cui si succedono eventi ben precisi. Le due fasi critiche del ciclo cellulare sono la fase S (in cui avviene la replicazione del DNA e si passa così da un genoma 2N a uno 4N). e la fase M (mitosi) in cui il genoma, raddoppiato nella fase S, viene ripartito tra le due cellule figlie. Dunque S ed M sono le fasi critiche. In mezzo ad esse ci sono le fasi G. La fase G1 precede la fase S; la fase G2 precede la fase M. La sigla G sta per gap, ossia qualcosa che sta tra altre due. In alcuni testi viene indicata stare per growth perché la cellula si accresce in qualche modo in tale fase. E più corretto però intenderla come gap. G1 e G2 sono fasi in cui nella cellula non avviene molto perché la cellula non si replica o divide in esse. Durante queste due fasi però avvengono i principali fenomeni REGOLATORI del ciclo. Il ciclo cellulare è caratterizzato oltre che da queste quattro fasi anche da altri tre punti importanti. Slide 7 e 8. UN RESTRICTION POINT: punto di restrizione, cioè punto critico in mezzo in genere alla fase G1 e in cui la cellula è sensibile a stimoli che la possono farla entrare in ciclo. Ciò significa che una cellula non replicante in fase G1 o G0 (stato di quiescenza replicativo) può essere spinta ad entrare in replicazione in risposta a determinati stimoli proliferativi sotto forma di vari fattori di crescita. Se non ci sono questi stimoli la cellula non si replica. Viceversa è vero anche che una volta che la cellula ha superato il restriction point non è più dipendente dai fattori di crescita e procede nel ciclo a meno che non avvengano altri eventi che descriveremo dopo. Normalmente comunque la cellula ingaggiata procede nel ciclo. DUE CHECKPOINT, punti che precedono immediatamente le due fasi critiche S e M. Servono per controllare che tutto sia a posto prima di procedere alla fase successiva. Il primo checkpoint, prima di S e che accompagna la sintesi, serve per controllare che il DNA prima di essere replicato non abbia delle grossolane mutazioni, durante la sintesi che il DNA venga replicato in modo completo e solo una volta. In una cellula eucaristica la replicazione avviene in modo apparentemente discontinuo partendo da più origini di replicazione. In E. coli c è una OR, nei cromosomi umani molte per cromosoma. La cosa che rende la fase S così complessa e lunga (in media ca. 8 ore, in E. coli in crescita logaritmica 20 min ca.) è in parte la grandezza del genoma, in parte la presenza di molte OR che si trovano in più punti del cromosoma e che vengono inoltre attivate in modo asincrono. Non è semplice pertanto per la cellula controllare che l OR abbia replicato e che lo abbia fatto anche quella vicino e che l altra più lontana non abbia replicato più volte. Esistono dei sistemi di controllo di qualità governati da una famiglia di proteine dette MCM che servono a garantire che il genoma venga replicato in modo completo una sola volta. In oncologia uno dei tipi di mutazione che possiamo trovare nelle cellule tumorali è l amplificazione genica, processo attraverso cui una regione cromosomica può essere replicata più volte. Avviene così che un gene che dovrebbe trovarsi in copia singola nel genoma aploide si trovi in più copie in esso. Tutto ciò è dovuto a difetti del sistema di controllo della replicazione a livello del processo di sintesi. Se nella sintesi avvengono degli errori si possono avere come risultato delezioni, se un pezzo non viene replicato, o amplificazioni, se un pezzo viene replicato più volte. Il secondo checkpoint è quello che precede e accompagna la mitosi. La cellula deve controllare, dopo aver verificato che la replicazione sia avvenuta in modo corretto, che i cromosomi si siano condensati, che i cromosomi condensati si siano attaccati a livello del centromero al fuso mitotico e siano attaccati solo in un punto e non in più punti per cromosoma e deve controllare anche che le cellule figlie abbiano ricevuto ciascuna un numero corretto di copie di cromosomi. C è un ulteriore controllo di qualità sul processo di partizione del genoma tra le due cellule. Ovviamente difetti di questi checkpoint, ossia di sistemi di controllo di qualità, si incontrano anche nelle patologie tumorali e danno origine a una caratteristica del fenotipo tumorale, che è la presenza di grosse anomalie cromosomiche. La cellula tumorale può avere per esempio anomalie numeriche, cioè un numero di cromosomi maggiore o minore del normale, oppure anomalie strutturali, cioè dei cromosomi non diversi per numero ma per struttura rispetto al normale (manca un braccio, hanno traslocazioni ecc.). Si vedranno esempi durante le esercitazioni. Diversi tipi di cellule possono avere comportamenti diversi. Ci sono le PERMANENT CELLS ossia cellule che non si replicano (ad esempio i neuroni del SNC o i cardiomiociti) che si trovano normalmente in uno stato G0. Ci sono altri tipi di cellule che sono stabilmente QUIESCENTI come ad es. gli epatociti. Essi normalmente non vanno incontro a replicazione però se a una persona o animale viene asportato un pezzo di fegato o avviene un processo di distruzione di una parte della popolazione epatocitaria, quelli che restano sono in grado di replicare e di ristabilire la massa cellulare di origine. Sono cellule resting, ossia non ciclanti, ma che possono essere richiamate in ciclo in risposta ad opportuni stimolazioni. Quindi stable cells. Ci sono anche le cellule continuamente ciclanti, cioè che normalmente si trovano sempre in ciclo cellulare. Sono per esempio le cellule dei compartimenti staminali ed intermedi subito successivi a quelli staminali. Se ne parlerà successivamente.

11 Come si fa a far proliferare di più una cellula? Si potrebbe immaginare due meccanismi diversi. Stimolare la cellula a superare i restriction point e quindi entrare in ciclo o si può abbreviare le fasi del ciclo. Di questi due meccanismi quello prevalente che avviene fisiologicamente ed è più soggetto a controllo è il primo. Si controlla l entrata della cellula in ciclo. Ci possono comunque pure essere controlli della durata del ciclo, nel senso che cellule di tessuti diversi possono avere una durata del ciclo diversa. Le cellule embrionali si dividono molto rapidamente e anche le cellule del sistema immunitario hanno in base alla loro ontogenesi dei rate proliferativi estremamente elevati. Le cellule dei centri germinativi dei follicoli linfatici possono avere anche un ciclo di 8 ore. La durata media del ciclo cellulare è di 24 ore ca. La sensibilità di una cellula ad entrare in ciclo cellulare piuttosto che rimanere in fase G0 è soprattutto controllata a livello del restriction point. E controllata da una serie di segnali extracellulari, cioè da tutto un corteo di fattori di crescita. Possiamo dividere il ciclo cellulare in due componenti: una rappresentata dall apparato motore del ciclo cellulare, l altra dai sistemi di controllo. Vedremo che l apparato motore del ciclo cellulare è rappresentato dai vari complessi ciclina/kinasi che regolano le transizioni tra i diversi punti del ciclo cellulare. Ci sono poi vari stimoli esterni di cui verranno citati alcuni esempi di particolare interesse oncologico che rendono questo motore accelerabile o rallentabile. Vedremo anche alcuni esempi di come in cellule tumorali questo apparato possa rendersi a volte indipendente dai pedali del freno o dell acceleratore. E come un motore che gira sempre al massimo dei giri, quindi indipendentemente dai segnali esterni. Quanto detto implica alcuni aspetti importanti che ritroveremo più volte. Sono che il ciclo cellulare serve a controllare due cose: la proliferazione, divisione delle cellule e la stabilità genetica perché ci sono quei checkpoint citati prima. La conservazione dell integrità del nostro genoma dipende in larghissima misura dai checkpoint di sintesi e di mitosi che normalmente controllano il ciclo cellulare. L ovvio corollario di questa cosa è che se ci sono alterazioni del ciclo cellulare le conseguenze saranno che la cellula prolifera di più e che sviluppa instabilità genetica, cioè tende ad accumulare mutazioni. L accumulo di mutazioni è un evento critico della patogenesi tumorale. Se non si raggiunge un certo numero di mutazioni le cellule non assumono un fenotipo tumorale completo. Non è facile trasformare una cellula normale in una tumorale. Ci vogliono molte alterazioni. Dunque le conseguenze di quanto detto prima sono che: 1. la cellula prolifera di più;2. sviluppa un qualche tipo di instabilità genetica. In realtà tre dei punti, degli hallmarks, delle caratteristiche distintive che caratterizzano il fenotipo tumorale. Slide 10. L apparato motore è rappresentato da una componente enzimatica attiva che sono i complessi CICLINA- KINASI, che sono dimerici e formati da una subunità cataliticamente attiva che è la Cdk, la kinasi ciclo dipendente. Si conoscono nell uomo 10 Cdk diverse. Esse sono indicate con dei numeri. La Cdk fosforila altre proteine. C è poi la subunità regolatoria che è rappresentata dalle cicline. Se ne conoscono otto e sono indicate con delle lettere. Ciascuna fase del ciclo è caratterizzata dalla presenza specifica di determinati complessi ciclina/kinasi che sono caratteristici di quella fase. Esiste dunque una specificità sia di interazione tra ciclina e kinasi, sia di specificità tra fase del ciclo e complesso catalitico attivo.. Esistono sia dei regolatori positivi del ciclo sia dei regolatori negativi. Essi sono rappresentati da una famiglia di inibitori del ciclo cellulare che inibiscono in modo diverso i complessi ciclina/kinasi. Esiste una specificità tra complesso catalitico e fase del ciclo. Nella slide n.11 è raffigurato schematicamente l andamento temporale dell attività di ciascun complesso ciclina/kinasi. Durante la transizione nel tempo attraverso le varie fasi del ciclo il complesso ciclica D/cdk4 caratteristico della fase G1, aumenta durante la fase G1 e scende verso la fine della stessa fase. Questo si chiama timing che si potrebbe tradurre come regolazione temporale, cinetica di regolazione di questi complessi. Tutti gli altri complessi specifici per le seguenti fasi del ciclo subiscono un tipo di regolazione simile. Il complesso ciclina E/cdk2 aumenta durante la fine di G1, resta alto durante la sintesi e scende verso la fine della sintesi. La ciclina A/cdk2 aumenta a metà della sintesi, sale durante G2, rimane in alto durante gran parte della mitosi e poi cade molto drasticamente. Il complesso ciclica B/cdk1 specifico per la mitosi,.viene attivato all inizio della mitosi e down regolato alla fine di essa. Quindi esiste un timing ben preciso, una regolazione temporale ben precisa di questi complessi. Come avviene la regolazione temporale? I concetti fondamenta sono che la regolazione non riguarda tanto l espressione della subunità catalitica, cioè non sono le Cdk tanto ad essere regolate. Le Cdk sono espresse in modo abbastanza costante durante il ciclo, però non riescono a esercitare la loro attività perché è regolata la subunità regolatrice, cioè la ciclina. Per cui le cicline sono la componente del complesso catalitico più soggetto a regolazione. La regolazione è di diversi tipi a seconda delle diverse cicline. C è un controllo nella produzione. In molti casi però queste cicline sono regolate in modo importante attraverso la via degradativa proteasomica. Questa caduta così

12 drastica delle attività dei complessi che caratterizza la fine delle diverse fasi del ciclo è regolata dall attivazione della degradazione selettiva delle cicline, come regola. Questa degradazione è mediata dalla via proteasomica, quindi passa attraverso uno stadio di poliubiquitinazione di queste cicline. Il complesso di ubiquitinazione del proteasoma 26S attraverso le subunità E1, E2, E3 attiva l ubiquitina, la coniuga e la lega alla proteina da degradare sotto forma di polimeri di ubiquitina, che è una piccola proteina. Questo processo di poliubiquitinazione nella maggior parte dei casi dà un segnale di degradazione proteica, di proteolisi. Attenzione a non confonderlo col processo di momo od oligo ubiquitinazione che in genere non è un segnale di degradazione ma viene usato, ad esempi,o per controllare il traffico intracellulare di alcune proteine. La regolazione più stretta e più precisa è la regolazione delle cicline. Il meccanismo più frequente è quello della degradazione controllata e della sintesi. Esistono però anche altri meccanismi che sono rappresentati per esempio dal controllo della localizzazione intracellulare di queste cicline che svolgono la loro azione solo se sono nel nucleo. Se tenute sequestrate nel citoplasma, anche se ci sono non possono agire. Questo è un meccanismo generale che regola la funzione di diverse molecole che trasducono il segnale. Ad es. smad, nfkb. A volte c è un fenomeno di regolazione attraverso la sequestrazione della proteina nel posto sbagliato. Questo complesso motore del ciclo cellulare rappresentato dai complessi ciclina/kinasi è regolato da sistemi di regolazione sia positivi che negativi che controllano l attivazione del complesso. Quali sono questi fenomeni regolatori del complesso motore del ciclo cellulare? Primo la formazione del complesso. Se la kinasi non è legata alla ciclina non ha attività catalitica. Cdk da sola non funziona. E necessario che sia prodotta, sia in giro e sia nel posto giusto la ciclina e che si formi il complesso ciclina/kinasi. E questo il primo stap. Questo complesso ciclina/kinasi non è di per sé attivo. Deve andare incontro a un altro evento che è la fosforilazione su un residuo di treonina conservato nel T-loop di attivazione di queste kinasi. Le Cdk appartengono a una famiglia di kinasi che hanno delle somiglianze strutturali. Una di queste è l ansa di attivazione (T-loop) che è molto simile in diverse chinasi ed è importante perché contiene questo residuo di treonina fosforilabile da una kinasi che si chiama CAK ( Cdk Activating Kinase). Questa fosforilazione ha un significato attivatorio rappresentata dal fosfato attaccato alla cdk quindi alla chinasi. Questo è il complesso cataliticamente attivo: ciclina/ Cdk con T-loop fosforilato Questo complesso attivo può essere disattivato in diversi modi. Uno è stato citato prima. La degradazione del subunita regolatoria, dellla ciclina. Se viene staccata la ciclina il complesso non funziona. L altra possibilità è di effettuare altre fosforilazioni che sono questa volta di carattere inibitorio. Sono anche queste su due residui conservati: Treonina 14 e Tirosina 15. Dunque esistono fosforilazioni attivatorie e fosforilazioni inibitorie. Due kinasi che hanno azione inibitoria sono la WIN1 E la MIT1. L inattivazione mediante successiva fosforilazione può essere a sua volta revertita da una fosfatasi che aggiunge un gruppo fosfato. Questa fosfatasi è la cdc25. E molto importante perché attiva o mantiene attivo il complesso. E alterata in alcuni tipi di tumore. La cdc25, fosfatasi attivatoria, esiste in 3 forme: cdc25 A, B, C. Esse sono regolate in modo diverso nelle diverse fasi del ciclo. La cdc25 A serve a mantenere attivi i complessi ciclina/kinasi specifici per il checkpoint G1/S. Cdc25 B e C sono specifiche per i complessi ciclina/kinasi delle fasi successive, del checkpoint mitotico. Il complesso attivato con Kinasi fosforilata da CAK può essere a sua volta inattivato da una famiglia di proteine che si chiamano INIBITORI DEL COMPLESSO CICLINA/KINASI. Sono KINASI INIBITORIE e vengono indicate con la sigla Cdki. Dunque i complessi ciclina/kinasi attivati possono essere bloccati dal legame di queste proteine inibitorie. Nello schema presente nella slide 12 si vede una ciclina/cdk con T-loop fosforilato a livello di una Treonina da Cak, le fosforilazioni inibitorie operate da Wee-1 e Myt-1, la Cdc25 che è in grado di rimuovere queste fosforilazioni inibitorie in quanto fosfatasi e Cdki che è in grado di bloccare il complesso. Cdc25 che è una fosfatasi è in grado di rimuovere questa fosforilazione inibitoria, quindi svolge azione attivatoria. FUNZIONAMENTO DEI CHECKPOINT. Slide 15. Il CHECKPOINT G1/S è forse quello più critico per la proliferazione perché stabilisce se questa avverrà o no. E controllato da fattori di crescita esterni o da fattoti esterni che inibiscono la proliferazione cellulare. Ha un funzionamento abbastanza semplice. C è una proteina chiamata Rb. Deve il suo nome al fatto di essere mutata nel retinoblastoma ereditario. Primo esempio che troviamo di gene mutato in una patologia tumorale. Rb biochimicamente è un REPRESSORE TRASCRIZIONALE. Controlla la trascrizione genica in senso negativo legando dei promotori responsivi a due fattori trascrizionali positivi che sono E2F e DP1. Dunque lega gli attivatori trascrizionali E2F e DP1 e li tiene fermi. Più in dettaglio Rb esercitala sua attività di repressore trascrizionale reclutando un complesso di proteine dette HDAC che controlla il rimodellamento cromatinico di queste regioni promotrici. Deacetila gli istoni favorendo l impaccamento del DNA in queste regioni.

13 Tutto questo agisce sul ciclo cellulare perché tra i due promotori responsivi a E2F e DP1 ci sono diversi geni critici per la progressione del ciclo cellulare. Questi geni sono quelli della CICLINA A, E ed alcuni specifici per la fase S (es. timidina chinasi, istone H2A... v. slide 16), geni che servono a replicare il DNA. E2F e DP1 controllano in modo specifico la sintesi delle due cicline successive alla ciclina D che è la prima che agisce nel ciclo. Sono la ciclina E ed A. L accensione della sintesi di queste due cicline che vengono dopo nel ciclo è quindi strettamente legata a questi due fattori trascrizionali. Fino a quando Rb è legata a E2F e DP1 il ciclo non può avanzare. Come si fa a sbloccare il sistema interrotto da Rb? Lo sblocco del sistema è mediato dall attività enzimatica catalitica dei complessi ciclina/kinasi specifici per la fase G1. Avremo la ciclina D con le Cdk 2, 4,6. Questo complesso cataliticamente attivo svolge la sua funzione di Kinasi fosforilando altre proteina tra cui la più importante è proprio Rb. L iperfosforilazione di Rb ha come effetto il distacco di Rb da E2F-DP1. Questo praticamente è un meccanismo di SBLOCCO DELLA TRASCRIZIONE di questi geni mediato dai complessi ciclina/kinasi della fase G1 che attivati iperfosforilano Rb che allora si stacca da E2F-DP1. Quindi l iperfosforilazione di Rb è l indicatore forse più preciso dell entrata in ciclo della cellula. E il meccanismo più importante nella regolazione del checkpoint G1. Come viene controllato il rimodellamento cromatinico? Slide 17.Il nucleo soma è formato da 4 istoni (H2A, H2B, H3, H4) ciascuno in duplice copia. Il loro assemblaggio a formare il nucleosoma è controllato fondamentalmente dalla loro affinità elettrostatica per il DNA. Gli istoni sono infatti basici, il DNA è ricco di cariche negative date dai suoi gruppi fosfato. Tre tipi di modificazioni post tradizionali possono indebolire questo legame elettrostatico permettendo lo srotolamento del DNA dal nucleo soma. Queste modificazioni sono: L acetilazione su residui di Lys, aminoacido carico positivamente. L acetilazione o la metilazione del gruppo amminico di Lys rimuove UNA carica netta positiva. Diminuiamo così l affinità verso il DNA degli istoni rimuovendo cariche positive. La Lys è normalmente NH3+ terminale. La fosforilazione su residui di Ser, un amminoacido polare ma che non ha carica netta. Fosforilandolo in due punti si aggiungono 2 cariche nette negative. Acetilazione e metilazione: rimozione di cariche positive. Fosforilazione: aggiunta di cariche negative. Nel CHECKPOINT G2/M il complesso più importante è rappresentato prima dalla ciclicaa/cdk2, ma soprattutto dal complesso ciclicab/cdk1 specifico per la fase mitotica. Slide 20. Il complesso ciclicab/cdk1 era stato inizialmente denominato MPF (Maturaturing Promoter Factor), denominazione presente ancora in alcuni testi. E una denominazione derivante dal fatto di essere stato scoperto negli oociti di Xenopus dove dirige il processo di maturazione dell oocita. Attenzione che la cdk1 è indicata anche come cdc2. Quindi ciclicab/cdk1=mpf, cdk1=cdc2. Come viene regolato il superamento del checkpoint G2/M? I principi generali sono abbastanza simili. C è un processo che controlla la SINTESI della subunità regolatoria, cioè della ciclica B che si attacca a cdk1. Il complesso viene poi attivato dalla fosforilazione della treonina 161 del T- loop. Può essere spento poi dalle sue fosforilazioni inibitorie come visto prima. Quindi il complesso ciclina/kinasi con la fosforilazione del T-loop è attivo e spinge la cellula ad andare in mitosi. Questo complesso alla fine della mitosi spegne la sua attività avvenendo la degradazione della ciclica. Il processo viene anche qui regolato con un meccanismo simile a quello visto per il checkpoint G1/S. Come fa il complesso a spingere la cellula ad andare in mitosi? Slide 21.Lo fa controllando una serie di bersagli che la cellula deve modificare andare incontro a mitosi. Perchè avvenga ciò è necessaria la condensazione dei cromosomi. Questo è un evento criticamente controllato dalla fosforilazione dell istone H1 da parte del complesso ciclina B/cdk1. L istone H1 si trova nella zona adiacente al core istonico, nella zona dove il DNA entra ed esce dal nucleosoma. La fosforilazione dell istone H1 è importante perché attiva il processo di condensazione del DNA in strutture più complesse di quelle del nucleosoma. In pratica succede che l istone H1 fosforilato può interagire con altri H1 fosforilati. Questo porta la struttura nucleosomiale ad arrotolarsi intorno a questi nuclei centrali di istoni H1. E un auto assemblaggio. Questo è il fenomeno che attiva l impaccamento del DNA in strutture di complessità crescente nel quale intervengono anche le proteine della famiglia delle HNG proteins. Si arriva così alla struttura maggiormente condensata che sono i cromosomi mitotici. Il paking rate, cioè il rapporto di impaccamento di un

14 cromosoma mitotico è ca , ossia il cromosoma mitotico è ca volte più corto di quello che sarebbe seil DNA fosse completamente srotolato. Altri bersagli del complesso ciclina B/ cdk1 sono per esempio le proteine che controllano l assemblaggio dell involucro nucleare. La mitosi è caratterizzata infatti anche dalla dissoluzione dell involucro nucleare. E l unica volta in cui la cellula eucaristica non è tale, perché non ha la struttura fisica che la rende tale. Questo evento è controllato dalla fosforilazione delle lamins. Sono proteine strutturali che si trovano sulla superficie interna dell involucro nucleare. L apertura di esso è legata a questo evento di fosforilazione. Altro evento importante è la formazione del fuso mitotico. Il complesso ciclina B/ Cdk1 attiva l instabilità dei microtubuli che ne favorisce la polimerizzazione. Anche gli organelli come il Golgi e l ER andranno incontro a frammentazione.nel corso della mitosi. Questo per quanto riguarda la parte ATTIVATORIA del complesso motorio ciclina/kinasi. Inibitori del ciclo cellulare Slide 25. Esistono proteine che appartengono alla famiglia degli inibitori del ciclo cellulare. Esse sono divise in due famiglie: la KIP (kinase inhibitory proteins) e la INK (inhibitors of cdk4). Queste due famiglie sono composte da diverse proteine. Le KIP sono rappresentate da p21, p27, p57. Gli inibitori appartenenti a questa famiglia hanno come caratteristica di funzionare un po diversamente dagli inibitori della famiglia INK perché legano sia la ciclina che la kinasi, cioè l intero complesso e si legano ai complessi ciclina/kinasi in modo non selettivo. Questo significa che sono in grado di fermare il ciclo in più punti. La p21, p27 e p57 che sono le 3 KIP sono attive un po su tutti i complessi ciclina/kinasi. Cioè non hanno un azione fase specifica. La loro produzione e la loro attività è controllata in modo molto stretto. Avevamo visto che la produzione delle Kinasi non è molto controllata, quella delle cicline è molto controllata, quella di questi inibitori è invece strettamente controllata. In particolare questo controllo è esercitato da proteine di grande interesse oncologico. La prima è la p53. E un ONCOSOPPRESSORE. Esercita questa sua attività in modo complesso. Uno dei bracci oncosoppressori della p53 è legato al fatto che essa è in grado con la sua funzione di attivatore trascrizionale di attivare la sintesi di p21, uno degli inibitori della famiglia KIP. Il controllo principale di p21 è esercitato da p53. Immaginate la p53 come un polipo oncosoppressore che ha molti tentacoli. Uno di questi è rappresentato dalla capacità di indurre la sintesi di p21, quindi di arrestare il ciclo. Un altra regolazione interessante è quella di un altro componente della famiglia KIP, cioè il p27. Esso è regolato in modo prevalente dal TGF-Beta. Esso è uno dei principali segnali antiproliferativi per gli epiteli e ha anche funzioni più differenziate. E prevalente comunque la prima. Nel pathway segnalativo del TGF-Beta rientrano le molecole SMAD che sono di interesse oncologico. Le SMAD sono proteine che hanno prevalentemente attività oncosoppressoria perché hanno una funzione ponte di inibizione nella proliferazione degli epiteli. E emerso ultimamente che esse hanno anche una funzione nei processi di invasività. Questi inibitori molto potenti sono regolati dagli oncosoppressori. Il controllo di questi fattori è 1. per p21 prevalentemente trascrizionale e operato da p53; 2. per p27 è un controllo esercitato sulla proteina, quindi esercitato sostanzialmente sulla traduzione e sulla sua degradazione. Ricordiamo che per p27 c è come si vedrà successivamente anche un controllo che consiste nella sua sequestrazione citoplasmatica. La famiglia INK è rappresentata da proteine più piccole delle KIP, dal peso molecolare inferiore. Le INK rappresentate da p15, p16, p18, p19 hanno una funzione fase specifica. Sono inibitori specifici del checkpoint G1/S. L altra caratteristica è che legano non il complesso ciclina/kinasi come facevano le KIP ma soltanto la kinasi. Le INK sono molto importanti e sono coinvolte in alcuni processi critici come per esempio la senescenza cellulare. La senescenza cellulare è un meccanismo oncosoppressore molto importante e la p16 svolge un ruolo prominente nella induzione della sensescenza. La senescenza cellulare è l invecchiamento della cellula che perde la competenza replicativa. La cellula senescente è viva ma incapace di replicarsi. L altra proteina importante nella risposta al TGF-Beta è la p15. La p18 invece è stata evidenziata in alcuni processi di differenziazione accompagnati alla incompetenza replicativa. Si sa che le cellule del muscolo scheletrico si differenziano e poi non si replicano più. Questi processi differenziativi a volte sono accompagnati dalla perdita di competenza replicativa. Slide 26. Si ricordi che le KIP colpiscono più checkpoint e che le INK invece colpiscono soltanto il checkpoint G1/S. Unificando queste informazioni consideriamo alcuni esempi di regolazione fisiologica e di alterazioni patologiche di particolare interesse. Questi sono esempi di regolazione fisiologica completamente normale e che controlla

15 l omeostasi di un tessuto epiteliale. Molti fattori di crescita, per esempio l EGF, TGF-alfa (fattore proliferativo per gli epiteli con azione simile all EGF), HGF, PDGF, agiscono fondamentalmente spingendo la cellula in ciclo controllando l attivazione delle cicline della fase G1 precoce o tardiva, quindi i complessi ciclina D/cdk4 e ciclina E/cdk2. Al contrario invece gli inibitori del ciclo cellulare come ad esempio TGF-Beta e P53, fermano l attivazione di questo checkpoint G1/S, quindi il superamento del punto di restrizione, inducendo p27 per TGF-Beta e p21 per p53. Esempi con cui si entra nell ambito della patologia tumorale sono rappresentati da meccanismi che colpiscono Rb. Come si dovrebbe colpire Rb per favorire la formazione di un fenotipo tumorale? Bisogna inattivarlo. Finchè Rb è attivo infatti lega i suoi bersagli E2F-DP1e il ciclo non va avanti. Nel retinoblastoma ereditario la presenza di mutazioni bialleliche inattivanti nel gene per RB fa sì che esso sia assente o strutturalmente non funzionante. Se solo uno dei due alleli di RB è funzionante non si genera il fenotipo retinoblastico.un secondo meccanismo è invece l inattivazione funzionale. Vuol dire che nel retinoblastoma Rb c è ma non funziona perché viene bloccato da qualcosa. Gli esempi più classici sono quelli di alcune proteine di virus oncogeni. Nella slide 27 sono citati i virus del papilloma umano, HPV, ed SV40 e le relative proteine che bloccano Rb. Esse sono E7 per HPV e il T antigen per SV40. Rb a seconda delle proteine virali che lo legano viene o degradato o staccato dal substrato. E2F-DP1 sono liberi di agire per la trascrizione. La cellula andrà in ciclo in modo incontrollato. Nell esempio del motore esso girerà al massimo dei giri senza che nessuno acceleratore abbia accelerato e non rispondendo ai segnali di freno. Questi virus hanno dunque capacità oncogenica perché bloccano degli oncosoppressori. Altri esempi da citare sono quelli riguardanti molecole di segnalazione a valle. Si consideri Myc che è classificato dal punto di vista oncologico come un oncogene, cioè gene che spinge la trasformazione cellulare, e che biochimicamente è un attivatore trascrizionale pertanto presente nel nucleo. Slide 29. I domini principali di Myc sono il DNA-binding domain e il transactivation domain. Il dominio di legame al DNA lega una serie di promotori responsivi che hanno al loro interno una sequenza E-box esonucleotidica. Attraverso i quattro domini transattivatori è in grado di controllare l espressione genica dei geni attaccati a quei promotori. Come fa Myc a controllare l espressione genica? Il meccanismo principale di controllo della trascrizione è anche in questo caso a livello del controllo del rimodellamento cromatinico. Attraverso proteine adattatrici intermedie Myc è in grado di reclutare dei complessi enzimatici HAT che sono acetiltransferasi istoniche. Myc fa un po il contrario di Rb. Le acetiltransferasi istoniche acetilano gli istoni e permettono lo srotolamento del DNA rendendolo accessibile. Myc non agisce da solo ma legandosi con la proteina Max. Il dimero Myc-Max ha un azione in genere attivatoria per la trascrizione. Max può però formare anche dimeri con un altra proteina, la Mad. In tessuti in differenziazione, per esempio, in cui si è visto esserci uno switch di espressione da Myc a Mad, si formano dimeri Mad-Max che hanno invece una funzione repressoria. Questa funzione repressoria è legata al reclutamento invece di HDAC. E sempre un azione prevalente di rimodellamento creatinico ma in senso opposto. Myc ha un azione sul rimodellamento cromatinico e una ulteriore azione di controllo trascrizionale dopo che è avvenuto lo srotolamento della cromatina. Myc favorisce la trascrizione in due modi: reclutando i fattori trascrizionali dell apparato basale e iperfosforilando in associazione con Max la coda dell RNA polimerasi. Il primo modo dunque avviene reclutando proteine dell apparato basale di trascrizione servendosi dei suoi domini transattivatori. Il processo di trascrizione necessita dell assemblaggio dei vari fattori di trascrizione, il primo è TFII D, attorno al TATA box per formare l apparato basale che avvia la trascrizione. La trascrizione operata dalla RNA polimerasi richiede, oltre il riconoscimento del TATA box e l assemblaggio dell apparato basale, anche di un ulteriore stap biochimico che consente la processività della polimerasi. La RNA polimerasi ha una coda carbossi terminale che viene iperfosforilata. L iperfosforilazione della coda serve a staccare la RNA polimerasi da quel complesso di fattori trascrizionali che l hanno portata sul punto di inizio. Questo processo di distacco si chiama promoter clearance. Le cariche negative aggiunte sulla coda della RNA polimerasi hanno un azione repulsiva rispetto ai fattori dell apparato basale. Ciò consente il distacco della polimerasi che può procedere nella trascrizione dell intero mrna. Myc quando forma un dimero con Max, oltre ad altre azioni, recluta il fattore P-TEFb che favorisce l iperfosforilazione della coda. Si può dunque dire che Myc è un fattore che favorisce la clearance del promotore. Myc è un fattore trascrizionale non molto potente ma molto tentacolare. Degli studi hanno infatti valutato che ca. il 10% dei geni sono controllati nella loro espressione da Myc.

16 Slide 31.Cosa centra Myc con il ciclo cellulare? Myc è coinvolto in diverse vie di trasduzione del segnale dei fattori di crescita.myc nel nucleo compie il lavoro di trasmissione finale del segnale. Myc ha una funzione molto potente nel controllo del ciclo cellulare e svolge molte funzioni che favoriscono l entrata in ciclo e la progressione di esso. Come favorisce Myc l ingresso nel ciclo cellulare? Myc come attivatore trascrizionale aumenta l espressione delle cicline D1 e D2, le prime che agiscono nel ciclo, quindi favorisce il superamento del primo restriction point. Myc aumenta anche l espressione della cdc25 che è la fosfatasi attivatoria che rimuove eventuali fosforilazioni inibitorie. In ultimo Myc è in grado di inibire con meccanismi diversi l attività di inibitori del ciclo cellulare delle 2 KIP, p21 e p27 e l INK p15. Myc quindi non solo fa entrare le cellule in ciclo superando il restriction point attraverso l aumento dell espressione delle cicline e di cdc25 ma anche rimuove eventuali meccanismi inibitori che la cellula dovesse avere e che dovessero limitare la capacità proliferativa della cellula. Tuttavia se Myc è overespresso la cellula va in ciclo e si replica per un certo numero di volte oltre il quale va in apoptosi. Tutte queste proteine potenzialmente oncogeni che, tra cui Myc, hanno delle azioni che sono sì oncogeni che ma che vengono normalmente controllate in qualche modo. Una cellula infatti per diventare tumorale potrà overesprimere Myc ma questo non sarà sufficiente di per sé a renderla tale perché si attivano queste vie che limitano la funzione oncogenica di Myc. Quali sono i motivi che rendono Myc così importante per il ciclo cellulare? Sono i meccanismi di attivazione. Per spingere il ciclo si può o attivare un attivatore o inibire un inibitore. Quali attivatori attiva Myc? Myc attiva il complesso ciclina D/cdk4, perché aumenta l espressione della ciclina D, la subunità regolatoria, quindi aiuta la cellula a superare il punto di restrizione. L altro fattore attivatore indotto da Myc è l aumento di espressione di cdc25 che è una fosfatasi attivatoria perché rimuove i fosfati inibitori. Questi invece p15, p21, p27 sono inibizioni di inibitori. Chi controlla l espressione di Myc? E controllata da diversi fattori. Uno di essi è l oncogene Fos. Domanda: Myc inibisce la trascrizione di p21 direttamente oppure induce la produzione di proteine che ne inibiscono la trascrizione? In questo caso agisce indirettamente. Per p27 è stato dimostrato un meccanismo diretto di repressione trascrizionale. Myc in genere è un attivatore trascrizionale ma non sempre. L azione di inibizione degli inibitori svolta da Myc è prevalentemente indiretta, nel senso che Myc induce l espressione di proteine che o degradano o bloccano gli inibitori. In alcuni casi invece c è un meccanismo diretto di repressione trascrizionale. In pratica tirando le somme, cellule che overesprimono Myc andranno in ciclo cellulare anche se non c è nessun fattore di crescita che la stimoli a farlo. E un meccanismo che controlla direttamente il motore. Ugualmente cellule che overesprimono Myc grazie ai meccanismi degli inibitori degli inibitori saranno meno responsive a quei meccanismi che normalmente bloccano la progressione del ciclo. L esempio classico di tumore in cui Myc è deregolato e il linfoma di Burkitt. Slide 32.E una neoplasia dei linfociti B, in cui l alterazione molecolare originaria è una traslocazione cromosomica. Essa è una alterazione non numerica ma strutturale in cui avviene lo scambio di un tratto del proprio DNA tra due cromosomi. In questo caso un pezzo del cromosoma 8 finisce sul cromosoma 14 e viceversa. Come fa la traslocazione cromosomica ad attivare Myc? Il breakpoint, il punto di rottura che interessa questa traslocazione 8 14 coinvolge sul cromosoma 8 il gene MYC e sul cromosoma 14 il gene che codifica per la catena pesante delle immunoglobuline. Questa traslocazione unisce la regione del promotore ed enhancer del gene delle immunoglobuline con la regione codificante di Myc. Questa traslocazione produce un gene Myc che non è più sotto il controllo del proprio promotore ma che è sotto il controllo di promotore ed enhancer del gene delle immunoglobuline. Quindi il linfocita B portatore di questa traslocazione durante la produzione di immunoglobuline oltre a produrle con un altro allele produrrà Myc. Sarà quindi spinto a proliferare in modo inadeguato. Questo è un esempio classico di come una mutazione provoca l espressione inappropriata di un gene. Myc normalmente è espresso durante l ontogenesi cellulare ma non in quel punto. Quindi l espressione di un gene, un oncogene in questo caso, può essere o esagerata o semplicemente inappropriata, può avvenire nel momento sbagliato o durare troppo. 21/10/2008 Nella lezione precedente abbiamo affrontato il tema del controllo della regolazione del ciclo cellulare abbiamo fatto cioè un ripasso dei meccanismi che normalmente controllano il ciclo cellulare (restriction point, check point) e abbiamo puntualizzato che i meccanismi di controllo del ciclo cellulare servono a controllare 1)quanto la cellula

17 replica e 2)la stabilità del genoma. La conseguenza di questo nella patologia è che se questi meccanismi diventano difettosi (in vari modi che vedremo) la conseguenza è che una cellula replica in modo inappropriato e che darà instabilità genetica (la cellula tenderà spontaneamente ad accumulare più mutazioni). Nella lezione scorsa abbiamo iniziato anche a citare alcuni esempi che collegavano questo motore intrinseco del ciclo cellulare a meccanismi esterni di controllo, abbiamo citato cioè il caso del gene MYC: abbiamo visto che MYC che con vari meccanismi stimola la progressione del ciclo cellulare e inibisce invece la funzione di altri geni (inibitori del complesso ciclina-chinasi) che rallenterebbero il ciclo. Prima di occuparci della patologia del ciclo cellulare parliamo del gene p53: è il gene oncosoppressore principale che controlla la stabilità delle nostre cellule. P53 è un gene oncosoppressore perché si oppone, con vari meccanismi, al processo di trasformazione neoplastica. Lo si può paragonare ad una specie di creatura tentacolare la quale con ogni tentacolo esercita varie funzioni che si oppongono ai processi di trasformazione. Uno di questi tentacoli è rappresentato dal meccanismo con cui p53 inibisce il ciclo cellulare: con questo meccanismo p53 controlla la trascrizione di p21. P21 è uno degli inibitori del complesso ciclina-chinasi della famiglia???, che si lega al complesso ciclina-chinasi e inibisce le varie fasi del ciclo. Quindi p53 aumenta l espressione di p21 e p21 blocca il ciclo in più punti. Per quanto riguarda i meccanismi di attivazione del gene p53, se, con metodiche immunologiche, andiamo a vedere quanta p53 c è in una cellula normale, ne troveremo poca perché p53 normalmente, in quanto oncosoppressore, viene attivata in risposta a stimoli potenzialmente patogenici, fra i quali ci sono gli agenti genotossici ovvero tutta una serie di condizioni chimiche, fisiche e metaboliche che causano danni al DNA (DNA damage. Questa serie di cause destabilizza il nostro genoma inducendo mutazioni). Altre condizioni che attivano il gene p53 sono le condizioni di stress cellulare: particolari condizioni metaboliche o biochimiche (per esempio nel caso in cui la cellula abbia dei livelli di specie reattive dell ossigeno più elevate). Un altra condizione di stress cellulare è il cosiddetto sbilanciamento oncogenico. Questo vuol dire che, con dei meccanismi, solo in parte noti, il sistema di trascrizione cellulare è in grado di distinguere la segnalazione fisiologica di alcuni geni (tutta una serie di segnalazioni fisiologiche per es fattori di crescita) ma quando MYC va incontro a delle alterazioni si ha sbilanciamento oncogenico: la cellula sente che MYC è espresso in modo sbagliato ( c è qualcosa che non va ) e questo è dovuto alla durata dell azione o all equità cioè ai livelli di espressione. Questi sono tutti meccanismi che servono a percepire che i livelli di espressione e la durata dell attivazione di particolari geni sono non fisiologici. Questo è un esempio di oncogene embalance (sbilanciamento oncogenico). Questi stimoli (sbilanciamenti oncogenici e danni al DNA) attivano p53, quindi se, per esempio, prendiamo cellule normali e le irradiamo con radiazioni ionizzanti, vediamo che cresce il livello di p53 che si accumula e fa diverse cose: una di queste è arrestare il ciclo perché per una cellula è conveniente NON replicare DNA mutato. La concentrazione di p53, normalmente, nella cellula è tenuta molto bassa perché p53 è controllato da un feedback negativo. Questo feedback di regolazione negativa è legato al fatto che p53, fattore trascrizionale, controlla l espressione di alcuni geni, e fra i geni di cui controlla l espressione c è il gene MDM2. Questo gene MDM2, in vari modi, principalmente portando p53 sulla via degradativa proteasomiale, abbatte i livelli di p53; quindi p53, in pratica, spinge alla produzione di una proteina che lo distrugga e questo ne tiene i livelli normalmente bassi. Quindi questo è il circuito di regolazione di p53: vedremo come, in risposta a danno genotossico, si possa uscire da questo feedback positivo, altrimenti il livello di p53 rimarrebbe sempre basso. In sintesi: p53 lega il promotore di MDM2, MDM2 lega il prodotto, lega p53 e degrada p53. Uno dei meccanismi con cui si può uscire da questo feedback di regolazione che tiene molto bassi i livelli di p53 è rappresentato dalla fosforilazione di p53. La fosforilazione di p53, che avviene ad opera di alcune chinasi come la ATM, rende p53 resistente a MDM2 e innalza quindi i livelli di p53. Quindi p53 fosforilata non viene più attaccata e degradata. ATM è una protein-chinasi che fosforila p53 e deriva il suo nome dal fatto che è stata identificata inizialmente come gene mutato in una condizione patologica in cui i pazienti sviluppano delle neoplasie ereditarie: questa sindrome si chiama teleangectasia. ATM è una chinasi che fosforila p53 e che viene comunemente attivata da danno a DNA infatti si ritiene che ATM sia una di quelle proteine che interviene nel cosiddetto apparato sensore del danno al DNA al quale appartengono una serie di proteine che per prime si reclutano nei punti di DNA danneggiato. Quindi questo DNA danneggiato recluta e attiva ATM, ATM fosforila p53 e p53 diventa resistente a MDM2 e quindi i livelli di p53 aumentano. ATM è attivato soprattutto da tagli che comportano la rottura dei legami fosfodiestere di uno o entrambi i filamenti (si

18 rompe il filamento) dovuti ad una serie di agenti, per esempio radiazioni ionizzanti (comportano trasferimento di energia elevato). Tipicamente quindi, ATM è attivata da rottura del filamento di DNA. Abbiamo quindi visto il tentacolo replicativo di p53 con il quale p53 attiva l espressione di p21. Un altro tentacolo fondamentale è il tentacolo apoptotico nel senso che tra i bersagli trascrizionali di p53 ci sono alcuni geni pro-apoptotici che stimolano o attivano la morte cellulare programmata. Uno di questi è BAX. Comunque il meccanismo generale è che p53 induce l espressione di geni che inducono morte cellulare programmata. L altro tentacolo di p53 è quello con cui controlla un altra proteina: GADD45 che controlla i processi di riparazione del DNA. Tutti questi tentacoli di p53 hanno una logica che li unisce: logica di risposta a situazioni che causano danno genotossico. Quindi il danno genotossico attiva p53 che attiva i processi di riparazione del DNA (perché la cellula innanzitutto cerca di riparare i danni). Per fare questo però bisogna che la cellula non entri in S perché se comincia a replicare danni al DNA vuol dire che trasmette alle cellule figlie le mutazioni che ha subito, quindi questo è un tentacolo molto importante per prevenire la propagazione delle mutazioni. Se poi il danno al DNA è di entità tale che la cellula non riesce a ripararlo in tempo utile (viene arrestato il check point G1-S) il programma che viene attivato è quello apoptotico (all organismo conviene togliere dai piedi le cellule che hanno subito mutazioni: se non si riesce a riparare le mutazioni è meglio uccidere la cellula). Quindi in risposta a danni genotossici la cellula arresta il ciclo e cerca di riparare i danni ma se non ci riesce attiva il programma di autodistruzione cellulare. Invece, nelle cellule tumorali, se questa via viene compromessa, succede che la cellula che ha ricevuto insulto genotossico non si arresterà: andrà avanti nel ciclo, replicherà la mutazione, e, soprattutto, accumulerà un carico mutazionale tale che ucciderebbe cellule normali attraverso la via di attivazione dell apoptosi ma che non uccide cellule tumorali perché il difetto della via di p53 le rende anche resistenti. A volte non è critico che ci sia la mutazione di un gene in particolare ma è critico che ci sia la mutazione di quel pathway controllato dal gene (mutazioni epistatiche; a volte non è mutato un gene ma è mutato il gene che gli sta sopra o sotto e l effetto è molto simile dal punto di vista fenotipico). Ci sono due geni molto importanti codificati dal locus cromosomico INK4a. Questo locus è molto importante perché controlla le due principali vie oncosoppressorie cellulari: Rb e p53. Ci sono altre proteine oncosoppressorie ma le due principali strade oncosoppressorie della cellula sono Rb e p53. Come fa questo locus a controllare queste due vie oncosoppressorie? Lo fa producendo due proteine: p16ink e p14. p16ink (funzione specifica per il checkpoint G1-S nell inibizione del ciclo cellulare) inibisce complessi G1-S specifici cioè ciclinad-cdk4/6 che inibiscono Rb tramite fosforilazione (p16 inibisce il complesso CDK4, CDK4 inibisce Rb quindi p16 stimola Rb). Il primo prodotto di questo locus è dunque p16 che ha azione stimolatoria su Rb, è dunque un locus oncosoppressorio che controlla in modo positivo entrambe le due strade oncosoppressorie e le controlla con questo meccanismo di doppia inibizione. La logica di questi circuiti di regolazione inibitori di inibitori è una logica delle due negazioni che affermano (l inibitore dell inibitore stimola). Lo stesso meccanismo di inibizione dell inibitore avviene per l altro prodotto genico di questo locus: p14arf. Quest ultimo è un gene codificato attraverso un meccanismo di splicing alternativo cioè il locus cromosomico è lo stesso, il primo esone può essere unito al secondo esone secondo due diversi modi di lettura unendo il primo esone beta al secondo esone, o il primo esone alfa al secondo esone, quindi una diversa scelta di esoni genera moduli di lettura diversi (proteine con sequenza diversa). Questo p14arf inibisce la degradazione di p53 MDM-mediata (inibisce MDM2 e MDM2 inibisce p53) quindi p14 favorisce l espressione di p53. Chiudiamo dunque questa parte di regolazione fisiologica ed entriamo a vedere nel dettaglio cosa succede in cellule tumorali. Innanzitutto, dal punto di vista generale, le alterazioni del ciclo cellulare sono uno di quei tratti specifici del fenotipo tumorale. Le alterazioni del ciclo cellulare hanno un significato pratico clinico importante nel caso di alcuni tumori perché la presenza di alterazioni del ciclo cellulare costituisce un fattore prognostico negativo cioè pazienti con lo stesso tipo di tumore, se hanno determinate alterazioni del ciclo cellulare, hanno una prognosi più sfavorevole; lo stesso è molto importante per predire la risposta alla chemioterapia o alla radioterapia (concetto di marcatore predittivo: un marcatore predittivo è un marcatore che ci permette di predire la risposta alla terapia di un particolare tumore). È importante quindi sapere che in alcuni casi è possibile decidere a terapia in base alla presenza o meno di marcatori predittivi: in pratica al paziente, prima di fare la terapia A piuttosto che la terapia B, vado a fare

19 un indagine molecolare e un indagine dei marcatori del ciclo e si vede se ha una buona probabilità di rispondere alla terapia. Sempre dal punto di vista generale un concetto importante è che se le cellule che compongono la massa tumorale hanno proliferazione rapida, la probabilità di risposta a terapie convenzionali (chemio e radioterapia) è più alta. Le terapie convenzionali sono terapie che, in vari modi, colpiscono cellule in replicazione quindi più le cellule replicano più sono sensibili alla chemio e alla radioterapia convenzionale. L esempio classico che si cita in questo caso è quello dei linfomi B (di diversi tipi) che sono classificati ad alto grado o a basso grado. Quelli a basso grado sono più differenziati e in genere hanno velocità proliferativa più bassa (simili ai linfociti B normali perché finchè non vengono stimolati con antigene non possono proliferare per i fatti loro), quelli ad alto grado invece sono più anaplastici (meno differenziati) e in genere hanno un range proliferativo più rapido e questo è un esempio classico perché la prognosi dei linfomi B ad alto grado sarebbe più sfavorevole (tumori che crescono di più) però nella pratica clinica la prognosi di questi tumori non è sfavorevole perché rispondono molto bene alle terapie convenzionali quindi tutto sommato un paziente con linfoma B ad alto grado può essere curato con buoni risultati (altro esempio sono le malattie emolinfoproliferative pediatriche:le leucemie dei bambini hanno successo terapeutico alto). In contrapposizione a queste terapie convenzionali ci sono anche terapie mirate (target therapies): non sono terapie che colpiscono le cellule in quanto replicano ma colpiscono una molecola alterata (terapie molecolari) della cellula neoplastica. Quali sono le cause dell alterazione del ciclo cellulare nelle cellule tumorali? Sono: aumento di attività di regolatori positivi e diminuzione di attività di regolatori negativi. Dal punto di vista pratico cosa succede a cellule che abbiano subito questo tipo di alterazione? 1)possono bypassare i punti di restrizione (il punto di restrizione principale è dalla fase G1 ad S che decide se una cellula entra o no in ciclo. Quindi se, per esempio, overesprimo una ciclina il controllo dei checkpoint non sarà più tanto regolato da fattori esterni ma la cellula sarà intrinsecamente pronta ad entrare in fase S, ecco perché si dice bypass) 2)sviluppo di insensibilità a stimoli inibitori (stimoli inibitori che rallentano il ciclo: GFbeta e p53 sono i due principali) infatti le cellule che replicano di più e tendono ad accumulare lesioni genetiche. Come possiamo ottenere un aumento di attività dei regolatori positivi? Lo si può ottenere con tre meccanismi principali che sono i meccanismi con cui, in generale, un oncogene (gene che favorisce il processo di trasformazione neoplastica) può essere attivato. Gli oncogeni sono geni normalmente presenti nelle cellule; essi controllano delle vie di conduzione del segnale fondamentali (per es. MYC), questi geni, quando sono presenti in forma normale e normalmente controllata nella cellula, sono denominati come proto-oncogeni (MYC normale si chiama protooncogene c-myc). quando invece questo gene viene in qualche modo deregolato durante il processo di trasformazione neoplastica si trasforma in oncogene propriamente detto (conversione da proto-oncogeni ad oncogeni). Come avviene questo processo di conversione oncogenica? Avviene con tre meccanismi molecolari principali. 1- mutazione puntiforme che, in qualche modo, attiva questo oncogene (per esempio: mutazione puntiforme del proto-oncogene RAS attivato ad oncogene) 2- processo di amplificazione genica. Il gene viene ricopiato in copie multiple: invece che esserci una singola copia nel genoma apolide di quel particolare gene ci sono molte copie. Nel processo di amplificazione genica un pezzo di DNA di un locus cromosomico viene copiato più volte: questo è il risultato, per esempio, di errori nel processo di controllo di qualità della replicazione del DNA (controlla che ciascun pezzo di cromosoma replichi solo una volta e non più volte). Quindi questo gene viene espresso di più per la semplice ragione che è espresso in più copie nel genoma. 3- Traslocazione cromosomica: il gene viene alterato nella sua espressione o nella sua struttura (per es MYC) perché la regione cromosomica che codifica per quel gene viene traslocata da un altra parte (o sullo stesso cromosoma o su un altro cromosoma). Anche qui i meccanismi sono diversi, ora, per semplicità, citiamo solo il meccanismo della deregolzione dell espressione in cui il gene traslocato viene espresso in modo eccessivo o inappropriato. Questi tre sono i meccanismi generali; nel dettaglio ci sono anche quelli virali. Come si applica questo concetto ai geni del ciclo cellulare? Innanzitutto abbiamo l aumentata attività dei regolatori positivi. I regolatori positivi più frequentemente deregolati sono le cicline, non tanto le chinasi (la deregolazione di chinasi è molto più rara, per esempio la CDK4 del checkpoint G1-S può essere amplificata, con processo di

20 amplificazione genica, in alcuni tumori. Altro esempio interessante è la mutazione puntiforme con significato attivatorio che rende la chinasi insensibile all azione dell inibitore). Sono dunque molto più frequenti sono le mutazioni delle cicline e questo è logico perché nel controllo del ciclo cellulare quello che è regolato soprattutto è proprio l espressione delle cicline, non tanto delle chinasi. È quindi logico che siano gli elementi regolati ad essere perturbati nelle patologie tumorali. I processi molecolari che portano a questa deregolazione sono: amplificazione genica, traslocazione cromosomica o semplicemente l aumentata espressione attraverso meccanismi indiretti (questi possono anche avere significato prognostico quindi in alcuni pazienti si va a ricercare ne preparato istologico se c è o non c è la particolare ciclina overespressa per prevedere un decorso clinico più o meno severo per quel paziente). La più importante dal punto di vista clinico è la ciclina E perché i pazienti con alterazione della ciclina E hanno decorso clinico più grave). Trovare una certa ciclina overespressa può avere un significato prognostico favorevole o negativo a seconda del tipo di ciclina (dipende molto dai vari casi clinici non c è una logica fissa). Anche cdc25 può essere overespressa (fosfatasi che toglie le fosforilazioni inibitorie). Per quanto riguarda invece la diminuita attività degli inibitori (famiglia INK e kip) : il concetto da mettere a fuoco è che le alterazioni dei geni della famiglia kip ( geni p21 e p27 che sono i più importanti in patologia neoplastica) sono molto frequenti ma sono raramente di tipo genetico cioè questi geni non sono tanto spesso colpiti da mutazioni o da delezioni (sono funzionalmente geni che contrastano la trasformazione neoplastica quindi la cellula avrebbe mutazioni con perdita di funzione, non attivatorie) e quindi la mutazione genica di questi geni della famiglia kip non è frequente. Quello che invece è più frequente sono alterazioni a livello di espressione della proteina (più o meno proteina) oppure delle alterazioni della localizzazione intracellulare della proteina come, per esempio, avviene per la p27. Vediamo il caso di p21. Le mutazioni di p21 sono rare però il difetto di espressione di p21 è frequente. Il meccanismo più frequente di questo difetto è rappresentato da mutazioni di p53: p21 è attivata da p53 e quindi, se abbiamo difetti di p53, in teoria abbiamo come effetto un difetto di p21. Un altro caso interessante è quello di p27, un altro gene di importanza clinica molto rilevante perché è un fattore prognostico molto importante (nel carcinoma mammario i due parametri prognostici più importanti sono l overespressone di ciclina E e il difetto di espressione di p27). Questa p27 è alterata in patologie neoplastiche o perché ce n è di meno o perché si trova nel posto sbagliato (mislocalizzazione citoplasmatica: i complessi ciclina-chinasi sono attivi nel nucleo quindi gli inibitori per inibirli devono trovarsi nel nucleo). Il bersaglio degli inibitori del ciclo si trova nel compartimento nucleare quindi se un inibitore come p27 viene sequestrato nel citoplasma, anche se c è, non può funzionare. L altro esempio interessante che viene frequentemente alterato è rappresentato dagli inibitori della famiglia INK soprattutto p15 e p16. Questi possono essere colpiti da mutazioni con perdita di funzione (per esempio alcune forme di melanoma ereditario presentano alterazione di p16) oppure, molto frequenti, soprattutto per p16, sono le alterazioni epigenetiche: il gene non è mutato ma la regione promotore del gene è ipermetilata nel tumore (il gene c è ma non può essere espresso perché il promotore è ipermetilato). Quindi in un paziente non è sufficiente andare a ricercare mutazioni geniche, spesso bisogna utilizzare delle tecniche in cui si va a vedere lo stato di metilazione di quel gene. Spesso in un tumore le alterazioni a carico di p16 e di Rb sono reciproche cioè un tumore ha o una o l altra: mai entrembe (hanno il cosiddetto pattern di espressione reciproca). P27 è un marcatore prognostico molto importante: è un gene che si trova ad essere alterato in una moltitudine di tumori (un po come p53) è coinvolto quindi in moltissimi tumori (tumori cerebrali, linfomi, mammella, polmone, tratto gastroenterico etc) tuttavia, a differenza di p53 (alterato per mutazione) la p27 è raramente mutata o deleta. Quello che invece è molto più frequente nella maggior parte dei tumori è che i livelli di proteina sono o ridotti o la proteina si trova nel posto sbagliato. Un altro concetto importante è che la presenza di questa alterazioni è un fattore prognostico negativo molto importante cioè che il paziente che abbia queste alterazioni è indice di cattiva prognosi. Nella patogenesi delle neoplasie mammarie frequentemente (circa il 30% delle pazienti) è presente un alterazione molecolare: l amplificazione genica di un gene che si chiama HER2 anche detto neu. questo è un gene che appartiene alla famiglia dei recettori tirosin chinatici attivati da fattori di crescita epidermici della famiglia egf. diversi membri di questa famiglia (HER1,2,3,4) sono specifici per diversi ligandi; per quanto riguarda HER2 (modificato nelle neoplasie mammarie) non si conosce il ligando ma si sa che il recettore HER2 forma eterodimeri con altri membri della famiglia; la formazione di questi eterodimeri è importante per la trasduzione del segnale a valle, quindi anche altri recettori utilizzano HER2 come partner per tradurre il segnale. Cioè: HER2 (gene amplificato in neoplasie mammarie) non ha un suo ligando cioè un fattore di crescita extracellulare che lo leghi come gli altri membri della famiglia, però è capace di formare dei partner (eterodimeri) con gli altri membri che invece il ligando ce l hanno,