Ingegneria dei tessuti. Gel Polimerici In Ingegneria dei Tessuti
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1 Ingegneria dei tessuti Gel Polimerici In Ingegneria dei Tessuti
2 Alcune Applicazioni Di Uso Quotidiano COSMETICI FARMACOLOGIA PANNOLINI TERRENO ARTIFICIALE
3 Applicazioni Bio-medicali
4 Cenni Preliminari Il termine gel trae origine dal termine gelatina, riferito ad un materiale proteico derivante dalla denaturazione del collagene. Il gel ha la caratteristica di essere formato da una rete tridimensionale di macromolecole polimeriche legate tra di loro chimicamente o fisicamente e può assorbire e ritenere solventi per i quali mostra affinità. Assorbimento reversibile di solvente Soluzione Polimerica n - Macromolecole Rete Tridimensionale 1 - Macromolecola Causa
5 Sintesi di Hydrogel
6 Gel fisici e gel chimici
7 Forze di swelling La solubilità completa di un hydrogel è prevenuta da forze di tipo elastico (stretching tra crosslink tra le catene polimeriche)
8 Forze di swelling
9 Sistemi interpenetrati Double network
10 Double network Hydrogels
11 Double network Hydrogels
12 Cinetiche di swelling
13 Interazioni acqua-polimero
14
15 Slip-link Hydrogels
16 Meccanica degli hydrogel
17 Meccanica degli hydrogel
18 Meccanica degli hydrogel
19 Perché hydrogel in Ingegneria dei tessuti? Hanno un struttura ECM-Like In ingegneria dei tessuti vengono utilizzati principalmente Hydrogel (alta affinità con acqua). Intrappolare cellule vitali per ottenere costrutti con densità cellulare uniforme e di forma desiderata. Soluzione Polimero / Cellule Costrutto Cellulare
20 Perché hydrogel in Ingegneria dei tessuti? MATERIALI DA IMPIANTO (lenti a contatto, cornee artificiali, protesi mammarie, dischi intervertebrali, tessuti soffici, pelle artificiale, tendini e legamenti artificiali, riparazione e ricostruzione di tessuti cartilaginei, corde vocali artificiali) DISPOSITIVI MEDICI (dispositivi a contatto con il sangue, membrane per emodialisi, fili di sutura, sensori per endoscopia, cateteri, celle per elettroforesi, sistemi di rilascio controllato di farmaci).
21 Perché hydrogel in Ingegneria dei tessuti? L alto stato di idratazione garantisce un trasporto efficiente di nutrienti e prodotti di scarto del metabolismo cm nm-µm Proprietà meccaniche e di trasporto modulabili. Sistema poco reticolato Aumento delle proprietà meccaniche Sistema molto reticolato Aumento delle proprietà di trasporto e grado di swelling
22 Perché hydrogel in Ingegneria dei tessuti? Hanno una chimica modulabile: sfruttare la chimica dei polimeri per ottenere materiali con caratteristiche idonee allo scopo dell igegneria dei tessuti. Biodegrdabilità: il materiale che ospita le cellule deve degradare per lasciare spazio al tessuto sintetizzato. Realizzazione di Co-polimeri. Aggiunta di gruppi idrolizzabili o digeribili da enzimi secreti dalle cellule Spazio per la crescita di tessuto Signaling (interazione cellula / materiale) Adesione cellulare Trasmissione di stimoli esterni
23 Perché hydrogel in Ingegneria dei tessuti? Permettono diverse strategie di intervento. Soluzione Polimero / Cellule Sistemi iniettabili, gelificazione in vitro, coltura in vitro e impianto (Bioreattori) Sistemi iniettabili, gelificazione in vitro e coltura in sito Sistemi iniettabili e gelificazione in sito
24 Classificazione Degli Hydrogel Diversi tipi di classificazione Origine: Naturali Sintetici Stabilità Chimica: Degradabili Non Degradabili Capacita Di Assorbimento Di H 2 0: Low Swelling (20-50%) Medium Swelling (50-90%) High Swelling ( %) Super Absorbent (>99.5%) Meccanismo Di Reticolazione: Gel fisici (entanglements) Gel Chimici (legami covalenti) Carica lungo le catene: Gel Neutri (carica assente) Gel polielettroliti (gruppi ionizzabili lungo le catene) (un esempio di poli elettrolita nel nostro corpo è la cartilagine)
25 Cenni Sui Meccanismi Di Reticolazione Prima richiesta è la formazione del polimero Gruppi funzionali, funzionalità 1 + Non avviene il processo di polimerizzazione e non si può ottenere un gel
26 Cenni Sui Meccanismi Di Reticolazione Gruppi funzionali, funzionalità Si ottengono polimeri lineari che possono eventualmente dare origine ad un gel fisico.
27 Cenni Sui Meccanismi Di Reticolazione Gruppi funzionali reagenti, funzionalità 3 (>2) Gruppi funzionali prodotti, funzionalità 3 (>2) + Si ottengono polimeri ramificati che possono reticolare e dare origine ai gel chimici
28 Gruppi Funzionali Più Comuni Ammine Acido carbossilico Aldeidi Esteri Alcoli -NH2 -COOH -CHO -COOR -OH Solfoni -SO 2 - Acidi Sulfonici -SO 3 H
29 Equilibrio dei Gel Monomeri Polimero (Sol) può fluire sotto uno sforzo Gel: il sistema si blocca Il suo comportamento è più vicino ad un solido Blocco Chimico, permanente Blocco Fisico, reversibile Intervallo di transizione Sol - Gel: ph T Reazione Chimica (T, UV, scambio ionico) Estrazione di Solvente Cristallizzazione Quando ci si trova in zona gel (caso generale):
30 Equilibrio dei Gel Gel Neutri, non sono presenti gruppi ionizzabili lungo la catena Assorbimento di acqua per affinità F mix Reazione elastica delle catene F el All equilibrio F el + F mix = 0 Rapporto di swelling, W sw (peso rigonfio) W dr (peso secco), può essere determinato da pesate successive fino all equilibrio. Q = W W W sw sw dr Dipende da: Temperatura (affinità polimero solvente, elasticitàdel reticolo) Grado di reitcolazione
31 Equilibrio dei Gel Gel ionici (POLIELETTROLITI), sono presenti gruppi ionizzabili lungo la catena. Dissociazione dei gruppi ionici durante il processo di sweeling Poli-anionici: Carica fissa sul reticolo negativa Ioni liberi positivi in soluzione Poli-cationici: Carica fissa sul reticolo positiva Ioni liberi negativi in soluzione
32 Equilibrio dei Gel Gel ionici (POLIELETTROLITI): l equilibrio è regolato da più variabili, bisogna tenere conto della carica elettrica. F mix : tendenza alla miscelazione F el : reazione elastica del reticolo F ion : forza di natura elettrostatica dovuta alla densità di carica fissa dul reticolo che tende ad allontanare le cariche dello stesso segno presenti sulla maglia. Tale forza spingente dipende dalla costante di equilibrio di dissociazione delle specie ioniche e quindi da tutte le variabili che la influenzano. Dipende da: Q = W W W sw sw dr Temperatura (affinità polimero solvente, elasticità del reticolo, costante di dissociazione) Grado di reitcolazione ph e Forza Ionica del solvente (dissociazione dei gruppi ionici)
33 Meccanica dei Gel
34 Meccanica dei Gel
35 Hydrogel termoreversibli Thermoswelling Thermoshrinking
36 Hydrogel ph-reversibli Bassi PH diminuiscono lo swelling di idrogeli poliacidi (-COOH) ed aumentano lo swelling di polibasi Alti PH riducono lo swelling di idrogeli polibasi ed aumentano lo swelling di poliacidi
37 Hydrogel in TE Gel Termoreversibili PEO-PPO (S) sol C < C* e T<T*, gel C > C* e T>T* [T* ca C] PEG-g-PLGA (S) NiPAAm-co-Aac (S) Agarosio (N) sol a T > 38 C gel a T < 38 C [polisacaride] GEL ph Reversibili Chitosano (N) Collagene (N) sol a ph acido, gel a ph Neutro [polisacaride] sol a Tamb e ph 3, gel a T =37 C e ph=7 [proteina] Gel non reversibili Scambio ionico- Alginato (N) [polisacaride] Reazione Enzimatica- Fibrina (N) [proteina] Fotopolimerizzazione- PEGDA (S) S = sintetico N = Naturale
38 Hydrogel in TE PEO-PPO-PEO (Pluronic, Copolimero Sintetico, gel fisico) PEO: parte idrofila PPO: diventa idrofobo al di sopra di una temperatura T*. Si ha la formazione di micelle. Se il polimero supera una concentrazione critica C*, tali micelle si aggregano fisicamente gelificando la struttura. È una soluzione a basse temperatura, diventa gel aumentando la temperatura. La temperatura di transizione può variare tra C per cui è molto utilizzato in ingegneria dei tessuti sia come vettore per iniettare e trattenere cellule in vivo, sia per rigenerazione in vitro di tessuti. Rigenerazione di cartilagine
39 Hydrogel in TE AGAROSIO (polisaccaride di origine naturale, gel fisico) Alta Temperatura 80 C Bassa Temperatura < 37 C Soluzione polimerica Formazione di Eliche Incastro Condrociti Tessuto
40 Hydrogel in TE COLLAGENE (proteina, gel fisico) L unità ripetitiva è formata da tre amminoacidi (Gly-Xaa-Yaa), la Glicina è sempre presente, Xaa e Yaa sono prevalentemente rappresentati da Prolina e d Idrossiprolina Microfibrilla Fibrilla Fibre Network È molto utilizzato per indurre orientamento alle cellule le quali depositano tessuto lungo le linee di polarizzazione. Tessuti orientati come tendini, pareti delle arterie
41 Hydrogel in TE PEG-DA (Sintetico, Gel Chimico) O PEG, può polimerizzare ma non reticolare, bassa funzionalità CH 2 =C-C -OCH 2 -CH 2 - O-C-C= CH 2 CH 3 n CH 3 Gruppi Acrilati, aumentano la funzionalità Si prepara una soluzione di polimero cellule ed iniziatore. O I gruppi funzionali vengono attaccati e resi reattivi da un iniziatore. L iniziatore può essere attivato termicamente oppure attraverso radiazione luminosa (fotoiniziatori) I fotoiniziatori sono preferiti perché non si è legati alla temperatura Si espone la soluzione a radiazione ultravioletta, che attiva l iniziatore (PI). PI hv PI R R + RP P + P RP RPP Il polimero si ramifica e reticola
42 Cartilagine Hydrogel in TE
43 Hydrogel in TE PEG-DA (Sintetico, Gel Chimico) Alcune applicazioni Incapsulameto di cellule primarie (condrociti, osteblasti) per rigenerazione di cartilagine ed osso Incapsulamento di cellule staminali mesanchimali per il differenziamento in cartilagine ed osso. STEM cell non differenziate STEM Cell differenziate in condrociti
44 CSMA: condroitin solfato metacrilato Hydrogel in TE
45 Hydrogel in TE Fibrina (proteina naturale, gel fisico) Forma il clot dopo una ferita. I costituenti principale sono il Fibrinogeno (glico proteina)e la Trombina (proteina) che sono secreti dal nostro corpo. Il fibrinigeno è formato da tre domini schematizzabili come un centrale e due estremità. Un dominio è una sequenza caratteristica presenti su una proteina Fibrino-Peptidi
46 Hydrogel in TE Fibrina 1. Attacco della trombina Th Gruppi funzionali 2. Protofibrille di fibrina 3. Accrescimento del network per assembly covalente laterale (responsabile Fattore XIII, transglutaminase)
47 Caratterizzazione di sistemi iniettabili Veicolare cellule Reticolare senza danni per le cellule Opportune proprietà meccaniche Garantire vitalità e differenziamento
48 Proprietà meccaniche e cinetiche di gelificazione Prove Reologiche Studio della cinetica di reticolazione Moduli elastici Cella di carico G' G" G', G'' [Pa] Iniezione della pasta ancora fluida Time [s]
49 Caratterizzazione Gel di Fibrina: Metodi Proprietà meccaniche e cinetiche di gelificazione Prove Dinamico-Meccaniche Proprietà del materiale formato In condizioni di esercizio fisiologico Displacement E* = σo εo Cella di carico Load ε Displacement [mm] Load [10 2 grf] Time [s]
50 Effetti della composizione sulle proprietà meccaniche del gel Modulo Elastico (G ) Modulo Complesso E* Gel T setting [s] G eq [KPa] E* [KPa] F F F F
51 Effetti della composizione sulla Morfologia 5 mg/ml 50 mg/ml Struttura fine Struttura grossolane
52 Effetti Della Composizione Sulla Morfologia Cellulare 5 mg/ml 24h 48h 72h composizione 50 mg/ml
53 Composizione Gel di Collagene: materiale Materiali Compositi a base di collagene Collagene Soluzione di collagene tipo I Fase semi-interpenetrante Acido ialuronico (HA) 150 KDa Acido ialuronico (HA) 1200 KDa Gel finale Coll. 1.2; 2.4 mg / ml HALMW 10 mg / ml HAHMW 10 mg / ml FN 10; 50; 100 µg / ml LM 10; 50; 100 µg / ml Laminina (LM) Fibronectina (FN)
54 Gel di Collagene: Proprietà Meccaniche Il Gel di Collagene si comporta come un gel debole 1000 G' G'' G', G'' [Pa] Concentrazione Collagene [mg/ml] Modulo G [Pa ] Frequency [Hz]
55 Gel di Collagene: Proprietà Meccaniche Comportamento meccanico dei gel Compositi Coll / HA L acido ialuronico fa aumentare la proprietà meccaniche del gel di collagene G' [Pa] 10 HMW HA IPN LMW HA IPN Collagen Coll 2.4 mg / ml da 0.03 KPa a 0.1 KPa Frequency[Hz] Coll. 1.2 mg / ml poca variazione
56 Gel di Collagene: Iniettabilità Cinetica del processo di gelificazione : evoluzione temporale di G (t) red L acido ialuronico ritarda il processo di fibrillogenesi G' red G = 40% G fin LMW HA IPN HMW HA IPN Collagen Time [s]
57 Gel di Collagene: Proprietà Meccaniche Comportamento meccanico dei gel Compositi Coll / LM Coll / FN 20 G''+ FN G', G'' [Pa] G' collagen G'' collagen G' + FN G' +LM G'' + LM FN o LM [µg/ml] FN: 1Hz [Pa] LM: 1Hz [Pa] Frequency [Hz]
58 Gel di Collagene: Attività Cellulare EBs Effetto della concentrazione di collagene sullo sviluppo dei corpi embrioidi (EBs) Collagene 2.4 mg/ml Collagene 1.2 mg/ml In collagene 1.2 mg/ml Gli EBs sono vitali e crescono: Sviluppo Cavità tipica SVILUPPO
59 Gel di Collagene: Attività Cellulare MSCs Effetto della concentrazione di Collagene sulle Cellule Mesenchimali Staminali (MSCs) in matrici 3D A B In collagene 1.2 mg/ml MSCs crescono meglio Maggiore proliferazione Mofologia Osservazione al microscopio a contrasto di fase di MSCs cresciute per 9 giorni in collagene 2.4 mg/ml (A) e 1.2 mg/ml (B).
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