EMOADSORBIMENTO DEI VIRUS

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1 METODO NAZIONALE STANDARD VSOP 45 Emesso da Standards Unit, Department for Evaluations, Standards and Training Centre for Infections Revisione numero: 2 Data di revisione Emesso da: Standards Unit, Evaluations, Standards and Training Pagina 1 di 11

2 STATO DEI METODI NAZIONALI STANDARD I Metodi Nazionali Standard, che includono le procedure operative standard (POS) algoritmi e linee guida, promuovono l adozione di elevati livelli di qualità, contribuendo ad assicurare la possibilità di confronto delle informazioni diagnostiche ottenute in laboratori diversi. Ciò consente la standardizzazione della sorveglianza sostenuta dalla ricerca, sviluppo e verifica, promovendo nello stesso tempo la salute pubblica e la fiducia del paziente nelle proprie strutture sanitarie. I metodi sono ben referenziati e rappresentano un buon standard minimo per la microbiologia clinica e per la salute pubblica. Comunque, utilizzando i Metodi Nazionali Standard, i laboratori dovranno tenere in considerazione le esigenze locali e potranno intraprendere ricerche addizionali. I metodi forniscono inoltre un punto di riferimento per un loro ulteriore sviluppo. I Metodi Nazionali Standard sono stati sviluppati, revisionati ed aggiornati con una procedura aperta di consenso ove le opinioni di tutti i partecipanti sono state tenute in adeguata considerazione ed i documenti elaborati riflettono il consenso della maggior parte degli stessi. I rappresentanti di alcune organizzazioni professionali, incluse quelle il cui logo appare sulla prima pagina, sono membri dei gruppi di lavoro che sviluppano i Metodi Nazionali Standard. L inclusione del logo di una organizzazione nella prima pagina implica sostegno agli obiettivi ed al processo di preparazione dei metodi standard. I componenti di queste organizzazioni scientifiche hanno partecipato allo sviluppo dei Metodi Nazionali Standard ma le loro opinioni personali non rispecchiano necessariamente quelle dell organizzazione di cui sono membri. L elenco attuale delle organizzazioni professionali partecipanti può essere ottenuto tramite all indirizzo [email protected]. Le prestazioni dei metodi standard sono condizionate dalla qualità di reagenti, strumentazione, procedure commerciali o prove messe a punto in loco. I laboratori dovrebbero assicurare che queste siano state validate e dimostrate idonee allo scopo prefissato. Devono essere adottate procedure di controllo di qualità interno ed esterno. Nonostante siano state osservate le più scrupolose attenzioni nella preparazione di questa pubblicazione, la Health Protection Agency o qualsiasi organizzazione di sostegno non può essere ritenuta responsabile dell accuratezza o dell utilizzo o di qualsiasi conseguenza derivante dall uso o da modifiche delle informazioni contenute in questo documento. Queste procedure sono intese solamente come una risorsa generale per i professionisti che esercitano in questo settore, operanti nel Regno Unito, pertanto si dovrà ricorrere ad altri consulenti quando ritenuto necessario. Se si apportano modifiche a questa pubblicazione, si deve porre in evidenza dove sono state apportate modifiche al documento originale. La Health Protection Agency (HPA) dovrà essere informata in ogni circostanza. La HPA è una organizzazione indipendente che ha lo scopo di proteggere la salute della popolazione. Ad essa confluiscono esperienze professionali già appartenenti ad organizzazioni ufficiali. Maggiori informazioni riferibili alla HPA possono essere ottenute al sito La HPA è un organizzazione che mira ad essere completamente in accordo con le direttive Caldicott. Ciò significa prendere ogni possibile precauzione per prevenire la diffusione non autorizzata di informazioni sui pazienti e di garantire che le informazioni relative agli stessi siano mantenute in condizioni di sicurezza 1. Maggiori dettagli possono essere ottenuti dal sito web. Contributi allo sviluppo dei documenti possono essere forniti contattando l indirizzo [email protected]. Si informa il lettore che la tassonomia completa di questo documento è aggiornata al momento della pubblicazione. Per cortesia prendere nota che la bibliografia è attualmente formattata con il software Reference Manager. Se si modifica o si cancella il testo senza avere installato nel computer il Reference Manager; la bibliografia non sarà aggiornata automaticamente. Riferimento suggerito per questo documento: Health Protection Agency (2010). Haemadsorption of viruses. National Standard Method VSOP 45 Emissione 2. Revisione numero: 2 Data di revisione: Emesso da: Standards Unit, Evaluations, Standards and Training Pagina 2 di 11

3 INDICE STATO DEI METODI NAZIONALI STANDARD... 2 INDICE... 3 PROCEDURA DI MODIFICA... 4 SCOPO DEL DOCUMENTO... 5 INTRODUZIONE CONSIDERAZIONI SULLA SICUREZZA PRELIEVO DEL CAMPIONE TRASPORTO E CONSERVAZIONE DEL CAMPIONE PROCEDURA SUL CAMPIONE PRELIEVO DEL CAMPIONE TEMPO OTTIMALE DI PRELIEVO DEL CAMPIONE TIPO DI CAMPIONE APPROPRIATO E METODO DI PRELEVO QUANTITA ADEGUATA ED APPROPRIATO NUMERO DI CAMPIONI TRASPORTO E CONSERVAZIONE DEL CAMPIONE TEMPO FRA PRELIEVO DEL CAMPIONE E PROCEDURA CONSIDERAZIONI PARTICOLARI PER RIDURRE IL DETERIORAMENTO STRUMENTAZIONE E REAGENTI STRUMENTAZIONE REAGENTI PROCESSO/PROCEDURA SUL CAMPIONE SELEZIONE DELLA PROVA COLTURA E RICERCA IDENTIFICAZIONE ASSICURAZIONE DELLA QUALITA VERIFICA DEL PREPARATO ASSICURAZIONE DELLA QUALITA INTERNA ED ESTERNA LIMITI PROCEDURA DI REFERTAZIONE REFERTI TEMPO DI REFERTAZIONE SEGNALAZIONE ALLA HPA (SERVIZI LOCALI E REGIONALI ED AL CENTER FOR INFECTIONS) RINGRAZIAMENTI E CONTATTI BIBLIOGRAFIA Revisione numero: 2 Data di revisione: Emesso da: Standards Unit, Evaluations, Standards and Training Pagina 3 di 11

4 PROCEDURA DI MODIFICA Documento di riferimento controllato Titolo del documento controllato VSOP 45 Emoadsorbimento dei virus Ciascun Metodo Nazionale Standard possiede una registrazione separata con le modifiche. Le modifiche di questa revisione sono riportate in questa pagina. Le precedenti modifiche sono disponibili presso la Qualora vi sia una revisione di pagine o vengano emesse pagine nuove il proprietario di ciascun documento controllato dovrebbe aggiornare la copia in laboratorio Modifica Numero/ Data 8/ Emissione no. Scartata Inserita Emissione no. Pagina Sessione(i) interessate Modifica Intero documento Documento revisionato, non sono richiesti aggiornamenti Revisione numero: 2 Data di revisione: Emesso da: Standards Unit, Evaluations, Standards and Training Pagina 4 di 11

5 SCOPO DEL DOCUMENTO Questo Metodo Nazionale Standard (MNS) descrive la procedura per l esecuzione dell emoadsorbimento dei virus. INTRODUZIONE Molti virus (influenza, parainfluenza, morbillo, parotite ed alcuni picornavirus) sono dotati di glicoproteine di superficie note come emoagglutinine (EA). Esse sono in grado di legare le cellule ematiche. Quando i virus si replicano nelle colture cellulari, le molecole delle EA compaiono sulla superficie delle cellule delle colture. Se si aggiungono emazie di una appropriata specie alle colture in cui il virus si sta replicando, queste aderiranno alle cellule fenomeno noto come emoadsorbimento 2. La presenza di virus emoadsorbenti può pertanto essere rilevata alcuni giorni prima della comparsa dell effetto citopatico. L identificazione può essere confermata con metodi d inibizione dell emoagglutinazione, inibizione dell emoadsorbimento, o attualmente, più semplicemente, con l immunofluorescenza. Questo documento non contiene riferimenti alle caratteristiche delle colture cellulari, descritti nella VPOS 39 - Procedure for the care and propagation of cell cultures for virus isolation. INFORMAZIONE TECNICA / LIMITI Revisione numero: 2 Data di revisione: Emesso da: Standards Unit, Evaluations, Standards and Training Pagina 5 di 11

6 1 CONSIDERAZIONI SULLA SICUREZZA PRELIEVO DEL CAMPIONE Contrassegnare in modo appropriato il rischio secondo le strategie locali. 1.2 TRASPORTO E CONSERVAZIONE DEL CAMPIONE E essenziale il rispetto delle attuali regolamentazioni postali e del trasporto. Può essere utilizzato un appropriato terreno di trasporto del virus ed il campione deve essere inserito in un sacchetto di plastica chiuso, separato dal modulo di richiesta. 1.3 PROCEDURA SUL CAMPIONE Le procedure di laboratorio che comportano l insorgenza di aerosol infettivi devono essere condotte in una cabina microbiologica di sicurezza di classe 1 (CMS) E strettamente raccomandato di calzare guanti monouso per l inoculo dei campioni o la manipolazione delle colture cellulari. 2 PRELIEVO DEL CAMPIONE 2.1 TEMPO OTTIMALE DI PRELIEVO DEL CAMPIONE I campioni respiratori sono quelli più frequenti e devono essere prelevati nelle fasi più precoci dopo e non oltre il quinto giorno dall esordio dei sintomi. Tutti i campioni devono essere prelevati prima della somministrazione di anti-virali. La possibilità di rilievo del virus nei campioni clinici dipende dalla qualità del materiale ricevuto per l inoculo. Molti virus sono sensibili a disidratazione, condizioni di ph sfavorevoli e variazioni dell osmolarità. Per questi motivi i campioni devono essere inseriti in un appropriato terreno di trasporto immediatamente dopo il prelievo. Per escludere altri microrganismi patogeni possono essere richiesti campioni duplicati. 2.2 TIPO DI CAMPIONE APPROPRIATO E METODO DI PRELIEVO 2.3 QUANTITA ADEGUATA ED APPROPRIATO NUMERO DI CAMPIONI 3 TRASPORTO E CONSERVAZIONE DEL CAMPIONE 3.1 TEMPO FRA IL PRELIEVO DEL CAMPIONE E LA PROCEDURA I campioni devono essere trasportati in laboratorio ed immediatamente processati. In caso di ritardi, refrigerarli prima dell invio in laboratorio. In caso di ritardato inizio della procedura analitica, conservare a 4 C; se il ritardo supera le 24 ore, il materiale deve essere conservato a -70 C e scongelato prima della procedura. Devono essere evitati congelamenti e scongelamenti ripetuti. 3.2 CONSIDERAZIONI PARTICOLARI PER RIDURRE IL DETERIORAMENTO Revisione numero: 2 Data di revisione: Emesso da: Standards Unit, Evaluations, Standards and Training Pagina 6 di 11

7 4 STRUMENTAZIONE E REAGENTI 4.1 STRUMENTAZIONE Pipette sterili 4.2 REAGENTI I globuli rossi di cavia (GRC) sono conservati a 2 C 8 C in tampone di trasporto. Le emazie scadono dopo dieci giorni dal prelievo e devono essere scartate con i rifiuti da autoclavare Preparare un tampone fosfato 10X e diluire poi alla concentrazione normale utilizzando acqua distillata sterile filtrata. Conservare a 2-8 C Terreno di mantenimento della coltura privo di antibiotici Controllo positivo del virus (virus parainfluenza) in provetta con linea cellulare PLC/PRF/5 utilizzata invece delle cellule di Rene di Scimmia Rhesus (RMK Rhesus Monkey Kidney, che, per motivi etici, non saranno più disponibili nel Regno Unito dopo il mese di Aprile 2006) o cellule di rene di cane Madin Darby (MDCK Madin Darby cells kindey) Una provetta non seminata di cellule del lotto d uso corrente PLC/PRF/5 o MDCK rappresenta il controllo negativo 5 PROCESSO/PROCEDURA SUL CAMPIONE 5.1 SELEZIONE DELLA PROVA 5.2 COLTURA E RICERCA Preparazione dei GR 13 (globuli rossi) Trasferire i GR in una provetta conica da centrifuga di 15 ml. Centrifugare per cinque minuti a 500x g. Aspirare il sopranatante ed il Buffy coat Sospendere di nuovo i GR in PBS freddo (2 C 8 C). Lavare in PBS freddo fino a sopranatante limpido (due o tre volte) Aspirare il PBS dopo l ultimo lavaggio. Determinare il volume residuo delle cellule utilizzando provette da centrifuga graduate. Aggiungere la quantità di PBS necessaria ad ottenere una sospensione cellulare del 10% L emoadsorbimento è eseguito con una sospensione di GR a 0.4%, preparata con terreno di mantenimento cellulare Emoadsorbimento 13 Calzare i guanti durante le procedure e lavorare in cabina di sicurezza di Classe 1 o 2 Aspirare il liquido di conservazione dalla provetta del campione del paziente e da quelle dei controlli da saggiare in modo per renderli disponibili sul monostrato cellulare Aggiungere 0.2 ml della sospensione 0,4% di GR ad ogni provetta. Fare attenzione ed evitare contaminazione crociata fra le provette. Devono infine essere saggiati il controllo positivo e negativo Scuotere gentilmente il porta-provette per ottenere il contatto della sospensione con il monostrato cellulare. Inserire il porta-provette a 4 C per trenta minuti. Le provette devono stazionare in posizione orizzontale in modo che la sospensione dei globuli rossi ricopra il monostrato cellulare Dopo l incubazione, capovolgere rapidamente le provette per rimuovere i GR sedimentati sullo strato cellulare Esaminare la provetta di coltura cellulare con microscopio a 4x per la ricerca di GR adesi al monostrato. Leggere le provette subito dopo la loro rimozione dal frigorifero Revisione numero: 2 Data di revisione: Emesso da: Standards Unit, Evaluations, Standards and Training Pagina 7 di 11

8 Allontanare la sospensione di GR. Lavare con PBS ed aggiungere terreno di mantenimento per l incubazione successiva 5.3 IDENTIFICAZIONE Negativa Assenza di emoadsorbimento di GR e nelle cellule del terreno liquido. I GR fluttuano liberamente nel terreno. Positiva Emoadsorbimento dei GR sulle cellule infette o nel terreno liquido di coltura. La tipizzazione del virus deve essere eseguita con IF. Fotografia di emoadsorbimento da virus influenzale su cellule primarie di rene di scimmia Fotografia cortesemente concessa dal DR. KEN Mutton 6 ASSICURAZIONE DELLA QUALITA (consultare QSOP 27 Quality assurance in the diagnostic virology and serology laboratory) 6.1 VERIFICA DEL PREPARATO Deve essere predisposto un sistema per assicurare un appropriata verifica della qualità interna ed esterna ed il mantenimento delle procedure del controllo di qualità. E indispensabile che i laboratori dispongano di un appropriata validazione di metodi, strumentazione e procedure commerciali o di laboratorio che dimostrino la loro idoneità alle richieste. 6.2 ASSICURAZIONE DELLA QUALITA INTERNA ED ESTERNA 7 LIMITI L isolamento dei microrganismi dipende da: corretto prelievo del campione, trasporto, conservazione, metodo di analisi, qualità e numero di linee cellulari usate, appropriate condizioni di coltura e informazioni cliniche adeguate/disponibili. Devono essere utilizzate solo linee cellulari note per la loro sensibilità ai virus respiratori e questa caratteristica deve essere verificata sulle forniture ed a intervalli regolari. Le cellule prelevate dall idrogeno liquido devono essere verificate prima del loro utilizzo. Revisione numero: 2 Data di revisione: Emesso da: Standards Unit, Evaluations, Standards and Training Pagina 8 di 11

9 La procedura(e) di questo documento aiuta a descrivere standard microbiologici di buona qualità per specifici tipi di campioni. Possono essere richieste altre procedure ed è essenziale l interpretazione dei risultati da parte di personale qualificato. Prendere nota, per cortesia, che la conoscenza delle malattie infettive si aggiorna costantemente e sebbene questo MNS sia regolarmente riveduto, potrebbe non includere patogeni emergenti. Le precedenti indicazioni devono essere supplementate con la valutazione del rischio. 8 PROCEDURA DI REFERTAZIONE 8.1 REFERTI Colture negative devono essere refertate come Virus non isolato Le colture positive devono essere refertate come Isolato virus emoadsorbente Se si procede ad altri accertamenti, deve essere emesso un successivo referto che notifica l attesa di altri risultati. Questo è il caso di tutti i pazienti con virus influenzali e parainfluenzali che richiedono la conferma della prova di adsorbimento e la tipizzazione e sottotipizzazione del virus. 8.2 TEMPO DI REFERTAZIONE L identificazione di un virus emoadsorbente deve essere eseguita il più presto possibile e consentire la refertazione dell identificazione virale di una coltura positiva entro un giorno lavorativo dal primo riscontro della prova di emoadsorbimento positiva. Quando l identificazione non è disponibile o si verificano ritardi, deve essere emesso un referto con la dizione Isolamento in coltura cellulare di virus emoagglutinante. Seguirà identificazione. I clinici, informati per telefono, dovrebbero procedere ad una verifica per l identificazione presuntiva del virus. 9 SEGNALAZIONE ALLA HPA (SERVIZI LOCALI E REGIONALI ED AL CENTER FOR INFECTION) 16 I virus emaadsorbenti saranno classificati e tipizzati con altre modalità. Tutti i virus positivi all emoadsorbimento devono essere segnalati all HPA. Revisione numero: 2 Data di revisione: Emesso da: Standards Unit, Evaluations, Standards and Training Pagina 9 di 11

10 10 RINGRAZIAMENTI E CONTATTI Questo Metodo Nazionale Standard è stato proposto e sviluppato dal National Standard Methods Working Group for Clinical Virologyy ( Si ringraziano per la collaborazione i numerosi operatori dei laboratori di virologia e le organizzazioni specialistiche che hanno fornito informazioni e commenti durante lo sviluppo di questo documento, ed il Redattore Medico per la revisione finale. I National Standard Method sono emessi dalla Standards Unit, Department for Evaluations, Standards and Training, Centre for Infections, Health Protection Agency London. Per altre informazioni prendere contatti con: Standards Unit Evaluations and Standards Laboratory Centre for Infections Health Protection Agency Colindale London NW9 5EQ [email protected] Come da accordi intercorsi con la Health Protection Agency, la presente traduzione è a cura del Dott. Roberto Rescaldani, già Direttore del Laboratorio di Microbiologia e Virologia dell Ospedale Universitario San Gerardo dei Tintori di Monza. E.mail: [email protected] Revisione numero: 2 Data di revisione: Emesso da: Standards Unit, Evaluations, Standards and Training Pagina 10 di 11

11 BIBLIOGRAFIA 1. Department of Health NHS Executive: The Caldicott Committee. Report on the review of patientidentifiable information. London. December Koneman EW, Allen S D, Janda W M, Schreckenberger P C, Winn W C, Jr., editors. Color Atlas and Textbok of Diagnostic Microbiology. 5th ed. Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins; p Advisory Committee on Dangerous Pathogens Approved List of Biological Agents. p Public Health Laboratory Service Standing Advisory Committee on Laboratory Safety. Safety Precautions: Notes for Guidance. 4 th ed. London: Public Health Laboratory Service (PHLS); Control of Substances Hazardous to Health Regulations General COSHH. Approved Code of Practice and Guidance, L5. Suffolk: HSE Books; Health and Safety Executive. 5 steps to risk assessment: a step by step guide to a safer and healthier workplace, IND (G) 163 (REVL). Suffolk: HSE Books; Health and Safety Executive. A guide to risk assessment requirements: common provisions in health and safety law, IND (G) 218 (L). Suffolk: HSE Books; Health Services Advisory Committee. Safety in Health Service Laboratories. Safe working and the prevention of infection in clinical laboratories and similar facilities. 2 nd ed. Suffolk: HSE Books; NHS Estates. Health Building Note 15. Facilities for pathology services. 2nd ed. London: The Stationary Office; BS EN 12469: Biotechnology - performance criteria for microbiological safety cabinets. London: British Standards Institution (BSI); BS 5726: Microbiological safety cabinets. Part 2. Recommendations for information to be exchanged between purchaser, vendor and installer and recommendations for installation. London: British Standards Institution (BSI); BS 5726: Microbiological safety cabinets. Part 4. Recommendations for selection, use and maintenance. London: British Standards Institution (BSI); Cann AJ, editor. Virus Culture A Practical Approach. Oxford: Oxford University Press; p Snell JJS, Brown D F J, Roberts C, editors. Quality Assurance Principles and Practice in the Microbiology Laboratory. London: Public Health Laboratory Service; p Clinical Pathology Accreditation (UK) Ltd. Standards for the Medical Laboratory. Sheffield p Health Protection Agency. Laboratory reporting to the Health Protection Agency. Guide for diagnostic laboratories Issue no: 2 Issue date: Issued by: Standards Unit, Department for Evaluations, Standards and Training Page no: 11 of 11 This NSM should be used in conjunction with the series of other NSMs from the Health Protection Agency