CONTEGGIO DI BATTERI COLIFORMI E DI ESCHERICHIA COLI CON MEMBRANA DI FILTRAZIONE

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1 soake HPA STANDARD METHOD CONTEGGIO DI BATTERI COLIFORMI E DI ESCHERICHIA COLI CON MEMBRANA DI FILTRAZIONE W 2 Emesso da Standards Unit, Evaluations and Standards Laboratory Centre for Infections Regional Food, Water and Environmental Coordinators Forum Pagina 1 di 15

2 STATO DEI METODI NAZIONALI STANDARD I Metodi Nazionali Standard, che includono le procedure operative standard (POS) algoritmi e linee guida, promuovono l adozione di elevati livelli di qualità, contribuendo ad assicurare la possibilità di confronto delle informazioni diagnostiche ottenute in laboratori diversi. Ciò consente la standardizzazione della sorveglianza sostenuta dalla ricerca, sviluppo e verifica, promovendo nello stesso tempo la salute pubblica e la fiducia del paziente nelle proprie strutture sanitarie. I metodi sono ben referenziati e rappresentano un buon standard minimo per la microbiologia clinica e per la salute pubblica. Comunque, utilizzando i Metodi Nazionali Standard, i laboratori dovranno tenere in considerazione le esigenze locali e potranno intraprendere ricerche addizionali. I metodi forniscono inoltre un punto di riferimento per un loro ulteriore sviluppo. I Metodi Nazionali Standard sono stati sviluppati, revisionati ed aggiornati con una procedura aperta di consenso ove le opinioni di tutti i partecipanti sono state tenute in adeguata considerazione ed i documenti elaborati riflettono il consenso della maggior parte degli stessi. I rappresentanti di alcune organizzazioni professionali, incluse quelle il cui logo appare sulla prima pagina, sono membri dei gruppi di lavoro che sviluppano i Metodi Nazionali Standard. L inclusione del logo di una organizzazione nella prima pagina implica sostegno agli obiettivi ed al processo di preparazione dei metodi standard. I componenti di queste organizzazioni scientifiche hanno partecipato allo sviluppo dei Metodi Nazionali Standard ma le loro opinioni personali non rispecchiano necessariamente quelle dell organizzazione di cui sono membri. L elenco attuale delle organizzazioni professionali partecipanti può essere ottenuto tramite all indirizzo standards@hpa.org.uk. Le prestazioni dei metodi standard sono condizionate dalla qualità di reagenti, strumentazione, procedure commerciali o prove messe a punto in loco. I laboratori dovrebbero assicurare che queste siano state validate e dimostrate idonee allo scopo prefissato. Devono essere adottate procedure di controllo di qualità interno ed esterno. Nonostante siano state osservate le più scrupolose attenzioni nella preparazione di questa pubblicazione, la Health Protection Agency o qualsiasi organizzazione di sostegno non può essere ritenuta responsabile dell accuratezza o dell utilizzo o di qualsiasi conseguenza derivante dall uso o da modifiche delle informazioni contenute in questo documento. Queste procedure sono intese solamente come una risorsa generale per i professionisti che esercitano in questo settore, operanti nel Regno Unito, pertanto si dovrà ricorrere ad altri consulenti quando ritenuto necessario. Se si apportano modifiche a questa pubblicazione, si deve porre in evidenza dove sono state apportate modifiche al documento originale. La Health Protection Agency (HPA) dovrà essere informata in ogni circostanza. La HPA è una organizzazione indipendente che ha lo scopo di proteggere la salute della popolazione. Ad essa confluiscono esperienze professionali già appartenenti ad organizzazioni ufficiali. Maggiori informazioni riferibili alla HPA possono essere ottenute al sito La HPA è un organizzazione che mira ad essere completamente in accordo con le direttive Caldicott. Ciò significa prendere ogni possibile precauzione per prevenire la diffusione non autorizzata di informazioni sui pazienti e di garantire che le informazioni relative agli stessi siano mantenute in condizioni di sicurezza 1. Maggiori dettagli possono essere ottenuti dal sito web. Contributi allo sviluppo dei documenti possono essere forniti contattando l indirizzo standards@hpa.org.uk. Per cortesia prendere nota che la bibliografia è attualmente formattata con il software Reference Manager. Se si Per cortesia prendere nota che la bibliografia è attualmente formattata con il software Reference Manager. Se modifica o si cancella il testo senza avere installato nel computer il Reference Manager, la bibliografia non sarà aggiornata si modifica automaticamente. o si cancella il testo senza avere installato nel computer il Reference Manager, la bibliografia non sarà aggiornata automaticamente. Riferimento suggerito per questo documento: Health Protection Agency (2007). Enumeration of coliform bacteria and Escherichia coli by membrane filtration. National Standard Method W 2 Issue 4. Regional Food, Water and Environmental Coordinators Forum Pagina 2 di 15

3 INDICE STATO DEI METODI NAZIONALI STANDARD INDICE... 3 PROCEDURA DI MODIFICA... 4 SCOPO DEL DOCUMENTO... 5 INTRODUZIONE... 5 GENERALITA. 5 1 DEFINIZIONI PRINCIPIO CONSIDERAZIONI SULLA SICUREZZA TRASPORTO E CONSERVAZIONE DEL CAMPIONE PROCEDURA SUL CAMPIONE ATTREZZATURA TERRENI DI COLTURA E REAGENTI PROCEDURA SUL CAMPIONE PREPARAZIONE DEL CAMPIONE E DILUIZIONI FILTRAZIONE ED INCUBAZIONE CONTEGGIO COLONIE PROVE DI CONFERMA CALCOLO DEI RISULTATI REFERTO CONTROLLO DI QUALITA MEMBRANA DI FILTRAZIONE PROVE DI CONFERMA STRUTTURE DI RIFERIMENTO RINGRAZIAMENTI E CONTATTI DIAGRAMMA DI FLUSSO CHE ILLUSTRA LA PROCEDURA DI CONTEGGIO DI BATTERI COLIFORMI E DI ESCHERICHIA COLI CON MEMBRANA DI FILTRAZIONE BIBLIOGRAFIA Regional Food, Water and Environmental Coordinators Forum Pagina 3 di 15

4 PROCEDURA DI MODIFICA Documento di riferimento controllato Titolo del documento controllato W 2 Conteggio di batteri coliformi e di Escherichia coli con membrana di filtrazione Ciascun Metodo Nazionale Standard possiede una registrazione separata con le modifiche. Le modifiche di questa revisione sono riportate in questa pagina. Le precedenti modifiche sono disponibili presso la standards@hpa.org.uk. Qualora vi sia una revisione di pagine o vengano emesse pagine nuove il proprietario di ciascun documento controllato dovrebbe aggiornare la copia in laboratorio Modifica Numero/ Data 7/ Emissione no. Scartata Inserita Emissione no. Pagina Sessione(i) interessate Filtrazione ed incubazione Modifica Modificata la tolleranza della temperatura da 44 C ± 1 C a 44 C ± 0.5 C in accordo con le indicazioni del MDW Regional Food, Water and Environmental Coordinators Forum Pagina 4 di 15

5 CONTEGGIO DI BATTERI COLIFORMI E DI ESHERICHIA COLI CON MEMBRANA DI FILTRAZIONE SCOPO DEL DOCUMENTO Il presente metodo fornisce indicazioni per il conteggio con tecnica di filtrazione su membrana di batteri coliformi e di Escherichia coli in campioni idrici potabili per l uomo e nelle acque di pozza. Il metodo può essere utilizzato anche su campioni di acque ambientali e ricreazionali ma non per quelle destinate alla balneazione, soggette a specifiche regolamentazioni 2. Questi ultimi sono analizzati utilizzando metodi forniti dall Environment Agency. INTRODUZIONE Generalità I batteri coliformi sono concordemente ritenuti l indicatore microbiologico più affidabile della qualità dell acqua. Sono ospiti normali dell intestino dell uomo e degli animali e possono essere utilizzati come indicatori di potenziale contaminazione fecale e di origine ambientale. I Batteri coliformi fecali e le E. coli sono presenti solo nell intestino dell uomo e degli animali e sono richiesti accertamenti per confermare che la contaminazione è di questa origine. La definizione coliforme fecale non è precisa e pertanto non utilizzata in questo Metodo Standard Nazionale (MSN). Nel Regno Unito, nel contesto della microbiologia idrica, i batteri coliformi fecali sono considerati come E. coli. I batteri coliformi e le E. coli sono sensibili alle procedure di disinfezione utilizzate nel trattamento delle acque, nelle quali solitamente non si moltiplicano, soprattutto nelle aree temperate. Questi microrganismi non devono essere presenti in un campione di 250 ml di acque minerali o potabili imbottigliate ed in contenitori o in 100 ml di altri tipi di acque potabili Questo metodo è basato su quello descritto nel documento della Microbiology of Drinking Water Regional Food, Water and Environmental Coordinators Forum Pagina 5 di 15

6 1 DEFINIZIONI Nel contesto di questo metodo si applicano le seguenti definizioni: Sospetti batteri coliformi Microrganismi che su membrane inumidite con brodo membrana lauril solfato (BMLS), incubate a 30 C per 4 ore ed in seguito a 37 C per 14 ore, producono acido dal lattosio e formano colonie di tutte le dimensioni, di colore giallo in tutte le sue sfumature. Sospette E. coli Microrganismi che sulle membrane inumidite con BMLS incubate a 30 C per 4 ore, e poi a 44 C per 14 ore, producono acido dal lattosio e formano colonie di tutte le dimensioni, di colore giallo in tutte le sue sfumature. Batteri coliformi (coliformi totali) I sospetti batteri coliformi producono acido dal lattosio a 37 C entro 48 ore, sono ossidasi negativi e producono -galattosidasi.. E. coli Le sospette E. coli producono indolo dal triptofano dopo incubazione a 44 C per 24 ore. La maggior parte dei ceppi produce -glucuronidasi. 2 PRINCIPIO Filtrare con una membrana capace di trattenere i microrganismi un volume definito di campione, o una sua diluizione. Incubare la membrana su tampone assorbente imbevuto con brodo di terreno selettivo differenziale. Contare le colonie dei microrganismi ricercati, eseguire le prove di conferma e calcolare i risultati come conteggio colonie per 100 o 250 ml di campione. 3 CONSIDERAZIONI SULLA SICUREZZA Adottare le normali precauzioni del laboratorio di microbiologia. Porre attenzione nel caso di sollevamento manuale di grandi volumi di acqua. 3.1 TRASPORTO E CONSERVAZIONE DEL CAMPIONE E essenziale l adeguamento alle attuali regolamentazioni della posta e del trasporto come stabilito dall Advisory Committee on Dangerous Pathogens PROCEDURA SUL CAMPIONE Prestare attenzione quando si usa un bagno ad acqua bollente (Metodo Nazionale Standard: W1 Sezione 2) 20. Manipolare con attenzione l alcol amilico e l acido cloridrico concentrato utilizzati nella preparazione del reattivo di Kovacs Indossare guanti protettivi resistenti agli acidi quando si esegue la prova per l indolo Le linee guida precedentemente esplicitate devono essere supplementate con la COSHH locale e con la valutazione del rischio Regional Food, Water and Environmental Coordinators Forum Pagina 6 di 15

7 4 ATTREZZATURA Normale attrezzatura di laboratorio ed aggiungere: Membrane di filtrazione di tipo diverso Imbuti da filtro graduati da 50 e 100 ml Recipienti in pirex per il vuoto con rivestimento protettivo: ampia capacità come volumi di 5L Pompa a vuoto, con collettore di umidità o filtro protettivo, o sorgente alternativa di vuoto Forbici di acciaio inossidabile a punta piatta o equivalenti sterilizzabili Bagno ad acqua bollente (per disinfezione strumenti) Termostato a processo ciclico: 30 C 1.0 C e 37 C ± 1 C Termostato a processo ciclico: 30 C 1.0 C e 44 C ± 0.5 C Termostato: 37 C 1.0 C Bagno termostatico: 44 C ± 0.5 C Piastre di Petri Tamponi assorbenti sterili Membrane di filtrazione da 0.45 m di estere di cellulosa dotate di griglia Pipettatori automatici e relativi puntali sterili in grado di erogare volumi fino a 10mL e 1mL (opzionale) Pipette / (sterili a distribuzione totale) da 10 ml ed 1 ml graduate per volumi da 0.1 ml (opzionali) Pastette 5 TERRENI DI COLTURA E REAGENTI Utilizzare terreni con le seguenti formulazioni. Seguire le indicazioni della MDW per le preparazioni in laboratorio e le date di scadenza. Si possono usare terreni commerciali equivalenti; seguire le indicazioni del produttore. Diluente peptone salino (Diluente di maggior isolamento) Peptone Cloruro di sodio Acqua ph a 25 C 1.0 g 8.5 g 1 L Brodo membrana lauril solfato (BMLS) Peptone Estratto di lievito Lattosio Rosso fenolo Sodio lauril solfato Acqua ph a 25 C 40.0 g 6.0 g 30.0 g 0.2 g 1.0 g 1 L Acqua lattosio peptone (ALP) Peptone Cloruro di sodio Lattosio Indicatore di Andrade Acqua 10.0 g 5.0 g 10.0 g 10 ml 1 L Regional Food, Water and Environmental Coordinators Forum Pagina 7 di 15

8 ph a 25 C Acqua triptone 2% (AT) Triptone Cloruro di sodio Acqua ph a 25 C 20.0 g 5.0 g 1 L Agar MacConkey (AM) Sali biliari Peptone Lattosio Cloruro di sodio Rosso neutro Agar Acqua ph a 25 C 5.0 g 20.0 g 10.0 g 5.0 g 0.05 g 12.0 g 1 L Agar nutriente (AN) Estratto di carne Peptone Cloruro di sodio Agar Acqua ph a 25 C 10.0 g 10.0 g 5.0 g 15.0 g 1 L Reagente di Kovacs 21 p-dimetilaminobenzaldeide Alcol amilico (reagente di grado analitico, privo di basi organiche) Acido cloridrico (concentrato) 5.0 g 75 ml 25 ml Reagente ossidasi (preparazione recente o usare strisce commerciali pronte, ecc) Tetrametil p-fenilendiamina cloridrato Acqua 0.1 g 10 ml 6 PROCEDURA SUL CAMPIONE 6.1 PREPARAZIONE E DILUIZIONI DEL CAMPIONE Registrare all arrivo la tipologia della richiesta e la condizione del campione. I campioni idrici devono essere accettati e manipolati secondo le indicazioni del Metodo Nazionale Standard: W 1 Sezione Il campione deve essere conservato e trasportato a 2 C 8 C. I campioni devono essere analizzati il più presto possibile nel giorno del prelievo. In circostanze eccezionali, in caso di ritardo, la conservazione non deve protrarsi oltre le 24 ore prima dell inizio delle analisi e deve rispettare le condizioni specificate in precedenza. Seguire le procedure descritte nel Metodo Nazionale Standard: W 1 Sezione 6 20, selezionare volumi idonei per le analisi e preparare le diluizioni richieste. Regional Food, Water and Environmental Coordinators Forum Pagina 8 di 15

9 6.2 FILTRAZIONE ED INCUBAZIONE Posizionare un tampone assorbente in ogni piastra di Petri ed aggiungere, fino a saturazione, un volume sufficiente di BMLS (di solito 2,5 ml in funzione del tipo di tampone) e lasciare in ammollo per 5 minuti. Se necessario, prima di trasferire la membrana sul tampone, rimuovere da quest ultimo l eccesso di terreno usando, ad esempio, una pipetta/pastetta sterile. Per prevenire l essiccamento durante l incubazione è importante verificare la quantità di terreno ed il tempo richiesto per l ammollo di ciascun tipo di tampone. Seguire le procedure descritte nel Metodo Nazionale Standard: W 1 Sezione 6 20 : Filtrare su membrana un determinato volume di campione. Per acque minerali imbottigliate usare 250 ml, per altre acque potabili usare 100 ml. Per acque superficiali usare 100 ml, e se si sospetta una contaminazione di grado elevato, filtrare 10 ml e 1 ml. Utilizzare due filtri per campione, uno per batteri coliformi ed uno per E. coli. Se per le acque potabili di condotte e di pozza si attende un risultato negativo, è consentito l uso di una sola membrana, incubata poi a 37 C per il rilievo di batteri coliformi e delle E. coli. Posizionare la membrane su un cuscinetto tampone imbevuto di BMLS. Inserire le membrane ed i tamponi in un contenitore e trasferire in termostato seguendo le seguenti indicazioni: Batteri coliformi: 30 C ± 1 C per 4 ore ± 1 ora ed a 37 C ± 1 C per 14 ore ± 1 ora. E. coli: 30 C ± 1 C per 4 ore ± 1 ora ed a 44 C ± 0.5 C per 14 ore ± 1 ora. 6.3 CONTEGGIO COLONIE Al termine di un periodo complessivo di almeno 18 ore, contare i microrganismi sospetti per batteri coliformi e per E. coli registrando il numero di tutte le colonie di colore giallo, non considerando le caratteristiche delle loro dimensioni. Eseguire il conteggio nei primi quindici minuti dopo la rimozione dal termostato perché il colore delle colonie si può modificare con il raffreddamento ed il trascorrere del tempo 12. E importante valutare i fattori che possono modificare il risultato, ad esempio, la presenza di un elevato numero di colonie di colore rosa può interferire con lo sviluppo od il conteggio di quelle fermentanti il lattosio. 6.4 PROVE DI CONFERMA Selezionare le colonie per le prove di conferma come descritto nel Metodo Nazionale Standard: W 1 Sezione Eseguire sotto-colture dalle colonie sviluppate da membrane incubate a 37 C e 44 C per confermare i batteri coliformi e le E. coli. I batteri coliformi sospetti isolati a 37 C possono essere confermati come E. coli e le colonie sospette di E. coli isolate a 44 C possono essere confermate come coliformi ma non come E. coli. Inoltre, le colonie possono essere isolate su una sola delle due membrane. Se è stata usata una sola membrane incubata a 37 C, le colonie devono essere confermate sia per batteri coliformi che per E. coli. Se il conteggio confermato per E. coli della membrane filtrante incubata a 44 C è superiore a quello dei coliformi confermati su quella a 37 C, registrare il conteggio con valore superiore come batteri coliformi confermati, ignorando le colonie sviluppate sulla membrana incubata a 37 C. Ad esempio, assenza di batteri coliformi a 37 C ma due E. coli isolate a 44 C, i risultati devono essere refertati come due batteri coliformi e due E. coli 12. Batteri coliformi Eseguire sottocolture da colonie gialle selezionate in acqua lattosio peptone (ALP), agar MacConkey (AM) e agar nutriente (AN). Seminare l AM e L AN per ottenere colonie isolate. Inserire l ALP in termostato a 37 C. Verificare la produzione di acido dopo 20 ± 4 ore e se i risultati sono negativi esaminare dopo altre 20 ± 4 ore di incubazione. Inserire l AM e l AN in termostato a 37 C per 20 ± 4 ore. Su AM i batteri coliformi sviluppano colonie di aspetto solitamente circolare, convesse a Regional Food, Water and Environmental Coordinators Forum Pagina 9 di 15

10 superficie liscia e bordo regolare. Sono note varie sfumature di colore rosso. Se la crescita su AM/AN non è pura, ripetere la semina dell ALP con coltura pura ottenuta da AM/AN. Eseguire la prova dell ossidasi su colonie cresciute su piastra di AN. La purezza delle colture è indispensabili per questa prova e può essere richiesta una successiva sottocoltura delle colonie caratteristiche su AM da AN. Inumidire con 2 3 gocce di reagente per la prova dell ossidasi di recente preparazione o con prodotto equivalente un pezzo di carta da filtro posto in piastra di Petri. Trasferire sulla carta da filtro una colonia del microrganismo da saggiare usando un bastoncino di legno, ansa di vetro o di platino/plastica (non nichelcromo) e strofinare sull area inumidita. La reazione positiva è indicata dalla comparsa di colore porpora scuro entro dieci secondi. La comparsa immediata di colore porpora scuro nel punto di contatto evidenzia la positività della reazione, mentre l assenza di colore o lo sviluppo tardivo di colore porpora ne denotano la negatività. I batteri coliformi sono ossidasi negativi e producono acido dal lattosio. E. coli Eseguire sotto colture delle stesse colonie selezionate per la conferma dei batteri coliformi in ALP e AT. Porre in bagno termostatico a 44 C per 20 ore ± 4 ore. Eseguire la prova dell indolo sulle colture in AT come di seguito specificato: Aggiungere circa 0.2 ml di reagente di Kovacs e scuotere delicatamente. Lo sviluppo quasi immediato di un intensa colorazione rossa nello strato superiore indica reazione positiva (produzione di indolo). E. coli è indolo positiva, produce acido in ALP ed è ossidasi negativa. 7 CALCOLO DEI RISULTATI Calcolare il conteggio dei microrganismi sospetti nel modo seguente: Conteggio microrganismi sospetti / 100 ml = Numero delle colonie contate x Volume esaminato Seguendo le procedure descritte nel Metodo Nazionale Standard: W 1 Sezione 7 20, calcolare il numero di batteri coliformi e di E. coli confermati presenti in un volume definito di campione originale. 8 REFERTAZIONE Refertare i risultati secondo la procedura descritta nel Metodo Nazionale Standard: W 1 Sezione Interpretare i risultati seguendo le indicazioni della QSOP 57 Esame microbiologico di campioni idrici 22. Se i batteri coliformi e le E. coli are non sono rilevati, refertare: Non rilevati in 100 ml Se i microrganismi sono rilevati, refertare: a per 100 ml ove a è il conteggio confermato Se E. coli è confermata nella membrane a 37 C ed in quella a 44 C, refertare il conteggio più elevato. Se E. coli o altri batteri coliformi sono rilevati a 44 C in assenza di sviluppo di colonie a 37 C refertare quelle sviluppate a 44 C come batteri coliformi. Non è logico refertare per esempio: E. coli 2 per 100 ml e Batteri coliformi Non rilevati in 100 ml nello stesso campione Regional Food, Water and Environmental Coordinators Forum Pagina 10 di 15

11 Per acque minerali naturali, acque imbottigliate o acque in contenitori il risultato è refertato come conteggio in 250 ml. 9 CONTROLLO DI QUALITA 9.1 MEMBRANA DI FILTRAZIONE Quando si usa la tecnica di filtrazione con membrana, si devono eseguire le procedure del controllo di qualità almeno una volta al giorno in funzione del carico di lavoro del laboratorio. Se si usa più di un lotto di terreno è necessario ripetere la prova del controllo di qualità su ciascun lotto (consultare il Metodo Nazionale Standard W 1 Sezione 10) 20. I controlli di qualità quantitativi devono essere eseguiti su sospensioni di microrganismi noti come positivi e negativi con concentrazione inferiore a 100 unità formanti colonia nel volume filtrato. Controlli positivi Escherichia coli NCTC 9001 per incubazione a 37 C (battere coliforme positivo) o 44 C (E. coli positivo) Klebsiella aerogenes NCTC 9528 per incubazione a 37 C (battere coliforme positivo) Controlli negativi Klebsiella aerogenes NCTC 9528 per incubazione a 44 C Pseudomonas aeruginosa NCTC Bianco di controllo Filtrare 100 ml di acqua distillata sterile o di diluente peptone salino utilizzando lo stesso imbuto del controllo positivo dopo disinfezione. Incubare contemporaneamente le analisi di routine e tutti i controlli di qualità, eseguire le prove di conferma e determinare i conteggi. 9.2 PROVE DI CONFERMA Per ciascuna lotto di prove di conferma semiare controlli positivi e negativi noti come di seguito specificato: Acqua lattosio peptone Ceppi di prova 37 C 24 o 48 ore 44 C 24 ore E. coli NCTC 9001 Non necessario Acido Klebsiella aerogenes NCTC 9528 Acido Crescita assente Pseudomonas auruginosa NCTC Acido assente Acido assente Regional Food, Water and Environmental Coordinators Forum Pagina 11 di 15

12 Prova dell ossidasi Ceppi di prova Pseudomonas aeruginosa NCTC Positivo (porpora) E. coli NCTC 9001 Negativo (incolore) Produzione di indolo in acqua triptone 44 C/24 ore Ceppi di prova E. coli NCTC 9001 Positivo (rosso) Klebsiella aerogenes NCTC 9528 Negativo (incolore) Pseudomonas aeruginosa NCTC Negativo (incolore) 10 STRUTTURE DI RIFERIMENTO N/D 11 RINGRAZIAMENTI E CONTATTI Questi Metodi Nazionali Standard sono stati iniziati e sviluppati, riveduti e revisionati dal Water Working Group for Standard Method ( Si ringraziano le numerose persone appartenenti a laboratori di microbiologia Alimentare, Idrica ed Ambientale, laboratori di riferimento e le organizzazioni specialistiche che hanno fornito informazioni e commenti nel corso della preparazione di questo documento. I Metodi Nazionali Standard sono emessi dalla Standards Unit, Evaluations and Standards Laboratory, Centre for Infections, Health Protection Agency London. Per ulteriori informazioni contattare: Standards Unit Evaluations and Standards Laboratory Centre for Infections Health Protection Agency Colindale London NW9 5EQ standards@hpa.org.uk Regional Food, Water and Environmental Coordinators Forum Pagina 12 di 15

13 DIAGRAMMA DI FLUSSO CHE ILLUSTRA LA PROCEDURA DI CONTEGGIO DI BATTERI COLIFORMI E DI ESCHERICHIA COLI CON MEMBRANA DI FILTRAZIONE Trasportare in laboratorio a 2 C 8 C in assenza di luce solare diretta in contenitore idoneo Conservare al buio a 2 C 8 C ed analizzare il più presto possibile nel giorno del prelievo, altrimenti entro 24 ore dal prelievo Miscelare in modo opportuno ed approntare le diluizioni necessarie Filtrare Trasferire la membrana su cuscinetto tampone imbevuto con BMLS Incubare a 30 C ± 1 C per 4 ore ± 1 ora e a 37 C per 14 ore ± 1 ora Incubare a 30 C ± 1 C per 4 ore ± 1 ora ed a 44 C per 14 ore ± 1 ora Contare le colonie gialle entro 15 minuti dalla rimozione dal termostato Contare le colonie gialle entro 15 minuti dalla rimozione dal termostato Eseguire sotto-culture in ALP, AM, ed AN (prova ossiidasi) con incubazione a 37 C (batteri coliformi) ed in ALP e AT a 44 C (E. coli) Eseguire le prove biochimiche e calcolare i conteggi dei batteri coliformi e delle E. coli Refertare ed interpretare secondo la QSOP 57 Esame microbiologico dei campioni idrici 22 Revisione no: 4 Data di revisione Emesso da: Standard Unit, Evaluations and Standards Laboratory in collaborazione con il Regional Food, Water and Environmental Coordinators Forum Pagina 13 di 15 Riferimento no: W 2i4.1

14 BIBLIOGRAFIA 1. Department of Health NHS Executive: The Caldicott Committee. Report on the review of patientidentifiable information. London. December The Bathing Waters (Classification) Regulations 1991: Statutory Instrument No HMSO The Natural Mineral Water, Spring Water and Bottled Drinking Water Regulations (Statutory Instrument No. 666). London: HMSO; The Private Water Supplies Regulations (Statutory Instrument No. 2790). London: HMSO; The Water Supply (Water Quality) (Amendment) Regulations (Statutory Instrument No. 2885). London: HMSO; The Drinking Water in Containers Regulations (Statutory Instrument No. 743). London: HMSO; PHLS. Hygiene for Hydrotherapy Pools. 2 nd ed. London: PHLS; Health and Safety Executive, Health Protection Agency. Management of Spa Pools - Controlling the Risks of Infection Pool Water Treatment Advisory group, editor. Swimming Pool Water - Treatment and Quality Standards. Greenhouse Publishing; Industry Guide to Good Hygiene Practice: Vending and Dispensing Guide Supplement (to the Catering Guide). Chadwick House Group ; Council Directive 98/83/EC: Relating to the Quality of Water Intended for Human Consumption. Official Journal of the European Communities; p. L L330/ Standing Committee of Analysts. Environment Agency. The Microbiology of Drinking Water (2002). Methods for the Examination of Waters and Associated Materials - Part 4: Methods for the isolation and enumeration of coliform bacteria and Escherichia coli (including E. coli 0157:H7). London Public Health Laboratory Service Standing Advisory Committee on Laboratory Safety. Safety Precautions: Notes for Guidance. 4 th ed. London: Public Health Laboratory Service (PHLS); Control of Substances Hazardous to Health Regulations General COSHH. Approved Code of Practice and Guidance, L5. Suffolk: HSE Books; Health and Safety Executive. 5 steps to risk assessment: a step by step guide to a safer and healthier workplace, IND (G) 163 (REVL). Suffolk: HSE Books; Health and Safety Executive. A guide to risk assessment requirements: common provisions in health and safety law, IND (G) 218 (L). Suffolk: HSE Books; NHS Estates. Health Building Note 15. Facilities for pathology services. 2nd ed. London: The Stationary Office; Advisory Committee on Dangerous Pathogens. The management, design and operation of microbiological containment laboratories. Suffolk: HSE Books; Revisione no: 4 Data di revisione Emesso da: Standard Unit, Evaluations and Standards Laboratory in collaborazione con il Regional Food, Water and Environmental Coordinators Forum Pagina 14 di15 Riferimento no: W 2i4.1

15 19. Advisory Committee on Dangerous Pathogens. Biological agents: Managing the risks in laboratories and healthcare premises. HSE National Standard Method W 1 - General technique for the detection of bacteria by membrane filtration. London: Health Protection Agency; Barrow GI, Feltham R K A, editors. Cowan and Steel's Manual for the Identification of Medical Bacteria. 3rd ed. Cambridge: Cambridge University Press; National Standard Method QSOP 57 - The microbiological examination of water samples. London: Health Protection Agency; Revisione no: 4 Data di revisione Emesso da: Standard Unit, Evaluations and Standards Laboratory in collaborazione con il Regional Food, Water and Environmental Coordinators Forum Pagina 15 di 15 Riferimento no: W 2i4.1