REAL-TIME RT-PCR EUROPEA PER VIRUS INFLUENZALI A H5

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1 METODO NAZIONALE STANDARD REAL-TIME RT-PCR EUROPEA PER VIRUS INFLUENZALI A H5 VSOP 46 Emesso da Standards Unit, Department for Evaluations, Standards and Training Centre for Infections Revisione no: 2 Data di revisione Emesso da Standards Units, Department for Evaluations, Standards & Training Pagina 1 di 11 Questo MNS deve essere usato congiuntamente con gli altri MNS emessi dalla Health Protection

2 STATO DEI METODI NAZIONALI STANDARD I Metodi Nazionali Standard, che includono le procedure operative standard (POS) algoritmi e linee guida, promuovono l adozione di elevati livelli di qualità, contribuendo ad assicurare la possibilità di confronto delle informazioni diagnostiche ottenute in laboratori diversi. Ciò consente la standardizzazione della sorveglianza sostenuta dalla ricerca, sviluppo e verifica, promovendo nello stesso tempo la salute pubblica e la fiducia del paziente nelle proprie strutture sanitarie. I metodi sono ben referenziati e rappresentano un buon standard minimo per la microbiologia clinica e per la salute pubblica. Comunque, utilizzando i Metodi Nazionali Standard, i laboratori dovranno tenere in considerazione le esigenze locali e potranno intraprendere ricerche addizionali. I metodi forniscono inoltre un punto di riferimento per un loro ulteriore sviluppo. I Metodi Nazionali Standard sono stati sviluppati, revisionati ed aggiornati con una procedura aperta di consenso ove le opinioni di tutti i partecipanti sono state tenute in adeguata considerazione ed i documenti elaborati riflettono il consenso della maggior parte degli stessi. I rappresentanti di alcune organizzazioni professionali, incluse quelle il cui logo appare sulla prima pagina, sono membri dei gruppi di lavoro che sviluppano i Metodi Nazionali Standard. L inclusione del logo di una organizzazione nella prima pagina implica sostegno agli obiettivi ed al processo di preparazione dei metodi standard. I componenti di queste organizzazioni scientifiche hanno partecipato allo sviluppo dei Metodi Nazionali Standard ma le loro opinioni personali non rispecchiano necessariamente quelle dell organizzazione di cui sono membri. L elenco attuale delle organizzazioni professionali partecipanti può essere ottenuto tramite all indirizzo Le prestazioni dei metodi standard sono condizionate dalla qualità di reagenti, strumentazione, procedure commerciali o prove messe a punto in loco. I laboratori dovrebbero assicurare che queste siano state validate e dimostrate idonee allo scopo prefissato. Devono essere adottate procedure di controllo di qualità interno ed esterno. Nonostante siano state osservate le più scrupolose attenzioni nella preparazione di questa pubblicazione, la Health Protection Agency o qualsiasi organizzazione di sostegno non può essere ritenuta responsabile dell accuratezza o dell utilizzo o di qualsiasi conseguenza derivante dall uso o da modifiche delle informazioni contenute in questo documento. Queste procedure sono intese solamente come una risorsa generale per i professionisti che esercitano in questo settore, operanti nel Regno Unito, pertanto si dovrà ricorrere ad altri consulenti quando ritenuto necessario. Se si apportano modifiche a questa pubblicazione, si deve porre in evidenza dove sono state apportate modifiche al documento originale. La Health Protection Agency (HPA) dovrà essere informata in ogni circostanza. La HPA è una organizzazione indipendente che ha lo scopo di proteggere la salute della popolazione. Ad essa confluiscono esperienze professionali già appartenenti ad organizzazioni ufficiali. Maggiori informazioni riferibili alla HPA possono essere ottenute al sito La HPA è un organizzazione che mira ad essere completamente in accordo con le direttive Caldicott. Ciò significa prendere ogni possibile precauzione per prevenire la diffusione non autorizzata di informazioni sui pazienti e di garantire che le informazioni relative agli stessi siano mantenute in condizioni di sicurezza 1. Maggiori dettagli possono essere ottenuti dal sito web. Contributi allo sviluppo dei documenti possono essere forniti contattando l indirizzo Si informa il lettore che la tassonomia completa di questo documento è aggiornata al momento della pubblicazione. Per cortesia prendere nota che la bibliografia è attualmente formattata con il software Reference Manager. Se si modifica o si cancella il testo senza avere installato nel computer il Reference Manager; la bibliografia non sarà aggiornata automaticamente. Riferimento suggerito per questo documento: Health Protection Agency (2009). European Real-Time RT-PCR for Influenza A H5 viruses. National Standard Method VSOP 46 Emissione 2 pdf_sops.asp Revisione no: 2 Data di revisione Emesso da Standards Units, Department for Evaluations, Standards & Training Pagina 2 di 11

3 INDICE STATO DEI METODI NAZIONALI STANDARD... 2 INDICE... 3 PROCEDURA DI MODIFICA... 4 INTRODUZIONE CONSIDERAZIONI SULLA SICUREZZA RACCOLTA DEL CAMPIONE TRASPORTO E CONSERVAZIONE DEL CAMPIONE PROCEDURA ANALITICA SUL CAMPIONE PRELIEVO DEL CAMPIONE TEMPO FRA PRELIEVO DEL CAMPIONE E PROCEDURA STRUMENTAZIONE REAGENTI PROCEDURA LABORATORIO DDI RIFERIMENTO SEGNALAZIONE ALLA HPA (LOCALE E SERVIZI NAZIONALI E CENTRE FOR INFECTIONS) CONTATTI.. 8 APPENDICE 1. ESTRAZIONE ACIDO NUCLEICO PER PCR APPENDICE 2. RICERCA DI EMAGGLUTININA H5 DI INFLUENZA A CON SAGGIO EUROPEO DI REAL-TIME RT-PCR (TAQMAN) BIBLIOGRAFIA Revisione no: 2 Data di revisione Emesso da Standards Units, Department for Evaluations, Standards & Training Pagina 3 di 11

4 PROCEDURA DI MODIFICA Documento di riferimento controllato Titolo del documento controllato VSOP 46 Real-Time RT-PCR Europea per virus influenzali A H5 Ciascun Metodo Nazionale Standard possiede una registrazione separata con le modifiche. Le modifiche di questa revisione sono riportate in questa pagina. Le precedenti modifiche sono disponibili presso la Qualora vi sia una revisione di pagine o vengano emesse pagine nuove il proprietario di ciascun documento controllato dovrebbe aggiornare la copia in laboratorio. Modifica Numero/ Data Emissione no. Scartata Inserita Emissione no. Pagina Sessione(i) interessate Modifica 2/ Tutte Tutte Modificato nome Dipartimento da ESL a DEST 2 Stato dei MNS Inserita informazione per la tassonomia 5 Introduzione Aggiornata valutazione informativa 7 Procedura ERNVL aggiornato a Cfi 8 Contatti Aggiornati Revisione no: 2 Data di revisione Emesso da Standards Units, Department for Evaluations, Standards & Training Pagina 4 di 11

5 REAL-TIME RT-PCR EUROPEA PER VIRUS INFLUENZALI A H5 Questi protocolli non devono essere divulgati ed i risultati ottenuti con questi saggi non possono essere pubblicati o presentati in riunioni pubbliche senza l esplicito consenso del Respiratory Virus Unit, Centre for Infections. Tipo di campione: Campioni respiratori Tamponi Nasali e Faringei Aspirati Naso-faringei Lavaggio Broncoalveolare Aspirato Endotracheale Espettorato INTRODUZIONE Scopo Questo Metodo Nazionale Standard descrive un saggio real-time one-step RT-PCR utilizzato per la ricerca dei virus influenzali A H5 in campioni clinici (secrezioni respiratorie). Le sequenze dei primer e dei probe sono state dapprima descritte da Yves Thomas (National Centre for Influenza, Central Laboratory of Virology, University Hospital of Geneva, Switzerland); la sequenza del probe è stata successivamente modificata da Terry Collins (NHS Greater Glasgow. North Glasgow University Hospitals Division, West of Scotland Specialist Virology Centre) 2-4. Il saggio più sensibile per la diagnosi differenziale dei virus influenzali A H5 nei campioni clinici è la ricerca specifica con RT-PCR per il rilievo dell RNA virale. Questo saggio utilizza primer ed un probe specifici solo per i virus influenzali A H5, differenziandoli dagli altri patogeni respiratori. I Primer ed il probe, descritti in modo dettagliato in questo MNS, sono stati saggiati con un ampia selezione di virus influenzali A H5 umani ed aviari, includendo ceppi di virus influenzali A H5 recenti, isolati dal 2004 al Nel corso della valutazione si è notato che il saggio ha presentato ridotta sensibilità per i virus Influenza H5N3 isolati recentemente in Europa, e pertanto questo metodo non è considerato ottimale per la ricerca di questi virus. Il documento descrive le procedure per l esecuzione one-step di una RT-PCR (reverse transcription and amplification trascrizione inversa ed amplificazione, eseguita in una sola provetta) con primer specifici ed un probe per i virus influenzali A H5 (i primer ed il probe sono specifici per il gene emoagglutinina dei virus influenzali A H5). Il rilievo dell amplificazione è ottenuto monitorando l incremento della fluorescenza durante la reazione di PCR. Abbreviazioni: RT = Reverse Transcription PCR = Polymerase Chain Reaction Revisione no: 2 Data di revisione Emesso da Standards Units, Department for Evaluations, Standards & Training Pagina 5 di 11

6 1 CONSIDERAZIONI SULLA SICUREZZA Raccolta del campione Appropriato contrassegno per identificazione del rischio secondo le procedure locali. 1.2 Trasporto e Conservazione del campione E essenziale il rispetto delle regolamentazioni di spedizione postale e di trasporto. Usare un sistema di trasporto per virus idoneo (ove richiesto) ed inserire il campione in contenitore o sacchetto di plastica chiuso. Appropriato contrassegno per identificazione del rischio secondo le procedure locali. 1.3 PROCEDURA SUL CAMPIONE Tutte le manipolazioni su materiale clinico proveniente da un paziente con sospetta influenza aviaria devono essere eseguite in ambiente con livello di contenimento 3 (CL3) all interno di cabine di sicurezza di classe I/classe III. Dopo avere aggiunto il materiale clinico al tampone di lisi utilizzato per la procedura di estrazione, la successiva estrazione dell acido nucleico può essere eseguita in CL2. *Consultare - Informazioni utili per la scelta del metodo di estrazione. Buona pratica di laboratorio Le linee guida precedentemente esplicitate devono essere supplementate con la COSHH locale e la valutazione del rischio PPE (personal protective equipment abbigliamento di protezione personale) deve essere sempre indossato 2 PRELIEVO DEL CAMPIONE 2.1 TEMPO FRA PRELIEVO DEL CAMPIONE E PROCEDURA Il campione deve essere processato il più presto possibile. In teoria, i sistemi di trasporto devono garantire l arrivo del campione in laboratorio entro 24 ore. 3 STRUMENTAZIONE ABI Prism Real-time thermal cycler/sequence Detection System (Applied Biosystems) Microcentrifuga picofuge Strisce di provette da 0.2 ml con tappo o piastre sigillate a 96 pozzetti (Applied Biosystems) Pipette con puntali monouso con filtro 4 REAGENTI SuperScript III Platinum One-Step Quantitative RT-PCR System (Cat No ; ) contenente; SuperScript III One-Step RT/Platinum Taq mix, 2x Reaction mix (tampone contenente 0.4mM di dntp e 6mM MgSO 4 ), ROX Reference Dye. Forward e reverse PCR primers (10pmol/µL working stock) (MWG): H5VietFor: 5 - GGA TGG CAG GGA ATG GTA GA 3 H5VietRev: 5 - TCT ATT GCC TTT TGA GTG GAT TCT T 3 TaqMan minor groove binder probe (5µM working stock): H5VietProbe: 5 FAM-TGG GTA CCA CCA TAG CAA YGA GCA GG- MGBNFQ 3 (Applied Biosystems) *Consultare informazioni utili. Water (DNase- and RNase-free) (Promega) Revisione no: 2 Data di revisione Emesso da Standards Units, Department for Evaluations, Standards & Training Pagina 6 di 11

7 5 PROCEDURA 5.1 Estrarre 150µL di campione con metodo Boom (Appendice 1) o con robot per estrazione MagNAPure (consultare la VSOP 36 Operation of the Roche MagNA Pure LC automated nucleic acid extraction robot). *Consultare - Informazioni utili. Virus di controllo = Influenza A H5N3 A/Duck/Singapore/3/97 virus. Disponibile presso il CfI; consultare Sezione 8 Contatti. Il materiale di controllo è stato preparato in aliquote da 600µL di virus in 200µL di tampone di lisi. Un aliquota di 200µL di questa miscela di controllo inattivata virus/tampone di lisi deve essere estratta come specificato al punto 5.1. Il controllo dell RNA virale è eluito in 100µL di acqua. *Consultare - Informazioni utili. 5.2 Preparare una master mix su ghiaccio con tutti i componenti della reazione, ad eccezione del templato di RNA virale: RT- PCR mastermix, ad esempio per 10 reazioni: 5uL SuperScript III RT/Platinum Taq Mix 125µL 2x Reaction Mix 5µL H5VietFor primer 5µL H5VietRev primer 5µL H5VietProbe 5µL ROX Reference dye 5.3 Aliquotare 15µL per provetta o in pozzetto di piastra. 5.4 Aggiungere 10µL di templato RNA preparato al punto 5.1 a ciascuna provetta / pozzetto in piastra, chiudere con tappo o sigillare. 5.5 Inserire in ABI Prism real-time thermal cycler, selezionare come rilevatore FAM No Quencher, deselezionare il 9600 emulation checkbox (se questo è inserito in modo predefinito come inserito / selezionato), ed usare il seguente protocollo di ciclo; Incubare a 50 C per 15 minuti (trascrizione inversa) Incubare a 95 C per 2 minuti Incubare a 95 C per 15 sec Incubare a 60 C per 30 sec (a questo punto prelevare i dati) Ripetere i punti e altre 39 volte 5.6 Al termine della corsa controllare che siano corretti i setting di default ciclo d inizio e di fine e resettare, se richiesto. Se necessario, regolare il valore della soglia spostandola sopra il valore di fluorescenza rilevato nei controlli negativi. Selezionare l analisi per calcolare i valori dei Ct (ciclo soglia) per campioni e controlli positivi. (Consultare Allegato 2). *INFORMAZIONI UTILI In funzione del materiale disponibile, eseguire le reazioni dei campioni e dei controlli in duplicato o triplicato. Ogni laboratorio deve elaborare una valutazione del rischio sul campione(i) da analizzare che si ritiene possa contenere virus Influenza A H5 prima della suddivisione in aliquote per l estrazione con tampone di lisi. Il rapporto tampone di lisi e campione è minore nell estrazione eseguita con MagNAPure rispetto a quella manuale di Boom. Un rapporto più ridotto fra tampone di lisi e campione può non essere sufficiente ad inattivare i virus influenzali A H5. Dopo la rimozione dell RNA templato per il saggio one-spep, il rimanente è utilizzato per formare cdna da utilizzare nel saggio RT-PCR two-step. Revisione no: 2 Data di revisione Emesso da Standards Units, Department for Evaluations, Standards & Training Pagina 7 di 11

8 Può essere utilizzato il 6FAM-BHQ probe (Operon Biotechnologies) in sostituzione del probe 6FAM-MGB. Se si utilizza il probe 6FAM-BHQ, selezionare come detector 6FAM-BHQ al posto del 6FAM-MGB. 6 LABORATORIO DI RIFERIMENTO Inviare i campioni positivi per Influenza A al Respiratory Virus Unit, CfI, Colindale. 7 SEGNALAZIONE ALLA HPA 11 (LOCALE ED AI SERVIZI NAZIONALI ED AL CENTRO PER LE INFEZIONI) Ogni risultato positivo per infezione causata da questo microrganismo deve essere immediatamente segnalata per garantire che sia intrapreso un appropriato intervento per la tutela della salute pubblica. La linea guida sulla procedura attuale di refertazione di questa infezione è disponibile sul sito web dell HPA Qualsiasi richiesta sulla procedura di refertazione, o di qualsiasi altra condizione inerente problemi di salute pubblica, deve essere discusso in prima istanza con la locale Health Protection Unit (HPU). 8 CONTATTI Dr Joanna Ellis Clinical Scientist, Respiratory Virus Unit, Virus Reference Department, HPA, Centre for Infections, Colindale, London NW9 5HT. Tel: Dr Alison Bermingham Clinical Scientist, Respiratory Virus Unit, Virus Reference Department, HPA, Centre for Infections, Colindale, London NW9 5HT. Tel: Revisione no: 2 Data di revisione Emesso da Standards Units, Department for Evaluations, Standards & Training Pagina 8 di 11

9 APPENDICE 1. ESTRAZIONE ACIDO NUCLEICO PER PCR A1.1 REAGENTI Tampone L6 Tampone L2 Sospensione di silice Etanolo (70%) Acetone RNase-free water RNasin (40,000U/mL) A1.2 PROCEDURA A1.2.1 Aggiungere 150µL di campione a 840µL di tampone L6, in una provetta da 1.5mL *Consultare - Informazioni utili. A1.2.2 Aggiungere 10µL di sospensione di silice. A1.2.3 Passare su Vortex per 5 secondi, mettere poi su agitatore a temperature ambiente per 10 minuti A1.2.4 Centrifugare per 15 secondi, scartare il sopranatante A1.2.5 Aggiungere 1mL di tampone L2, passare su vortex, centrifugare per 15 secondi e scartare il sopranatante A1.2.6 Ripetere A1.2.5 A1.2.7 Ripetere A1.2.5 con etanolo 70% al posto di tampone L2, due volte A1.2.8 Ripetere A1.2.5 con acetone al posto di etanolo, una volta A1.2.9 Asciugare i campioni per 10 minuti a 56 C, con coperchi aperti A Aggiungere 30µL di RNase-free water contenente 1µL di RNasin e passare su vortex per 5 secondi. A Eluire l acido nucleico a 56 C per 10 minuti A Passare su vortex e centrifugare per 5 minuti A Raccogliere l eluato con attenzione, non contaminare con silice NOTA TECNICA I residui di silice trasferiti alla fase successiva possono inibire l attività della trascrittasi inversa. Revisione no: 2 Data di revisione Emesso da Standards Units, Department for Evaluations, Standards & Training Pagina 9 di 11

10 8.0 ALLEGATO 2. RICERCA DI EMAGGLUTININA H5 DI INFLUENZA A CON SAGGIO EUROPEO REAL-TIME PCR-RT (TAQMAN) A/Duck/Singapore/3/97 Diluizioni scalari in base 10 Virus influenzali A H5 A/Duck/Singapore/3/97 A/Vietnam/1203/2004 A/Indonesia/6/2005 A/Turkey/Turkey/1194/2005 A/QAV/2005 Revisione no: 2 Data di revisione Emesso da Standards Units, Department for Evaluations, Standards & Training Pagina 10 di 11

11 BIBLIOGRAFIA 1. Department of Health NHS Executive: The Caldicott Committee. Report on the review of patientidentifiable information. London. December Thomas YKLWW. Real-time H5 Protocol. (ELP ) EISS Laboratory Protocol Library Real-time detection of H5 influenza virus RNA. (SOP MID 101/01) NHS Greater Glasgow North Glasgow University Hospitals Division, West of Scotland Specalist Virology Centre VSOP 41 - Real-time RT-PCR (TaqMan) for Influenza A H5 Viruses. Health Protection Agency Advisory Committee on Dangerous Pathogens 2004 Approved List of Biological Agents. p Public Health Laboratory Service Standing Advisory Committee on Laboratory Safety. Safety Precautions: Notes for Guidance. 4 th ed. London: Public Health Laboratory Service (PHLS); Control of Substances Hazardous to Health Regulations General COSHH. Approved Code of Practice and Guidance, L5. Suffolk: HSE Books; Health and Safety Executive. 5 steps to risk assessment: a step by step guide to a safer and healthier workplace, IND (G) 163 (REVL). Suffolk: HSE Books; Health and Safety Executive. A guide to risk assessment requirements: common provisions in health and safety law, IND (G) 218 (L). Suffolk: HSE Books; Health Services Advisory Committee. Safety in Health Service laboratories. Safe working and the prevention of infection in clinical laboratories and similar facilities. 2 nd ed. Suffolk: HSE Books; Health Protection Agency. Laboratory reporting to the Health Protection Agency. Guide for diagnostic laboratories Revisione no: 2 Data di revisione Emesso da Standards Units, Department for Evaluations, Standards & Training Pagina 11 di 11

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