REAL-TIME RT-PCR (TAQ MAN) PER VIRUS INFLUENZALI A H5

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1 METODO NAZIONALE STANDARD REAL-TIME RT-PCR (TAQ MAN) PER VIRUS INFLUENZALI A H5 VSOP 41 Emesso da Standards Unit, Department for Evaluations, Standards and Training Centre for Infections Revisione no: 5 Data di revisione Emesso da Standards Unit, Department for Evaluations, Standards & Traing Pagina 1 di 14

2 STATO DEI METODI NAZIONALI STANDARD I Metodi Nazionali Standard, che includono le procedure operative standard (POS) algoritmi e linee guida, promuovono l adozione di elevati livelli di qualità, contribuendo ad assicurare la possibilità di confronto delle informazioni diagnostiche ottenute in laboratori diversi. Ciò consente la standardizzazione della sorveglianza sostenuta dalla ricerca, sviluppo e verifica, promovendo nello stesso tempo la salute pubblica e la fiducia del paziente nelle proprie strutture sanitarie. I metodi sono ben referenziati e rappresentano un buon standard minimo per la microbiologia clinica e per la salute pubblica. Comunque, utilizzando i Metodi Nazionali Standard, i laboratori dovranno tenere in considerazione le esigenze locali e potranno intraprendere ricerche addizionali. I metodi forniscono inoltre un punto di riferimento per un loro ulteriore sviluppo. I Metodi Nazionali Standard sono stati sviluppati, revisionati ed aggiornati con una procedura aperta di consenso ove le opinioni di tutti i partecipanti sono state tenute in adeguata considerazione ed i documenti elaborati riflettono il consenso della maggior parte degli stessi. I rappresentanti di alcune organizzazioni professionali, incluse quelle il cui logo appare sulla prima pagina, sono membri dei gruppi di lavoro che sviluppano i Metodi Nazionali Standard. L inclusione del logo di una organizzazione nella prima pagina implica sostegno agli obiettivi ed al processo di preparazione dei metodi standard. I componenti di queste organizzazioni scientifiche hanno partecipato allo sviluppo dei Metodi Nazionali Standard ma le loro opinioni personali non rispecchiano necessariamente quelle dell organizzazione di cui sono membri. L elenco attuale delle organizzazioni professionali partecipanti può essere ottenuto tramite all indirizzo standards@hpa.org.uk. Le prestazioni dei metodi standard sono condizionate dalla qualità di reagenti, strumentazione, procedure commerciali o prove messe a punto in loco. I laboratori dovrebbero assicurare che queste siano state validate e dimostrate idonee allo scopo prefissato. Devono essere adottate procedure di controllo di qualità interno ed esterno. Nonostante siano state osservate le più scrupolose attenzioni nella preparazione di questa pubblicazione, la Health Protection Agency o qualsiasi organizzazione di sostegno non può essere ritenuta responsabile dell accuratezza o dell utilizzo o di qualsiasi conseguenza derivante dall uso o da modifiche delle informazioni contenute in questo documento. Queste procedure sono intese solamente come una risorsa generale per i professionisti che esercitano in questo settore, operanti nel Regno Unito, pertanto si dovrà ricorrere ad altri consulenti quando ritenuto necessario. Se si apportano modifiche a questa pubblicazione, si deve porre in evidenza dove sono state apportate modifiche al documento originale. La Health Protection Agency (HPA) dovrà essere informata in ogni circostanza. La HPA è una organizzazione indipendente che ha lo scopo di proteggere la salute della popolazione. Ad essa confluiscono esperienze professionali già appartenenti ad organizzazioni ufficiali. Maggiori informazioni riferibili alla HPA possono essere ottenute al sito La HPA è un organizzazione che mira ad essere completamente in accordo con le direttive Caldicott. Ciò significa prendere ogni possibile precauzione per prevenire la diffusione non autorizzata di informazioni sui pazienti e di garantire che le informazioni relative agli stessi siano mantenute in condizioni di sicurezza 1. Maggiori dettagli possono essere ottenuti dal sito web. Contributi allo sviluppo dei documenti possono essere forniti contattando l indirizzo standards@hpa.org.uk. Si informa il lettore che la tassonomia completa di questo documento è aggiornata al momento della pubblicazione. Per cortesia prendere nota che la bibliografia è attualmente formattata con il software Reference Manager. Se si modifica o si cancella il testo senza avere installato nel computer il Reference Manager; la bibliografia non sarà aggiornata automaticamente. Riferimento suggerito per questo documento: Health Protection Agency (2009). Real-time RT-PCR (Taq Man) for influenza A H5 viruses. National Standard Method VSOP 41 Emissione 5. Revisione no: 5 Data di revisione Emesso da Standards Unit, Department for Evaluations, Standards & Traing Pagina 2 di 14

3 INDICE STATO DEI METODI NAZIONALI STANDARD... 2 INDICE... 3 PROCEDURA DI MODIFICA... 4 INTRODUZIONE CONSIDERAZIONI SULLLA SICUREZZA RACCOLTA DEL CAMPIONE TRASPORTO E CONSERVAZIONE DEL CAMPIONE PROCEDURA ANALITICA SUL CAMPIONE PRELIEVO DEL CAMPIONE TEMPO FRA PRELIEVO DEL CAMPIONE E PROCEDURA STRUMENTAZIONE REAGENTI PROCEDURA LABORATORIO DI RIFERIMENTO SEGNALAZIONE ALLA HPA (LOCALE E SERVIZI REGIONALI E CENTRE FOR INFECTIONS) CONTATTI.. 10 APPENDICE 1. ESTRAZIONE ACIDO NUCLEICO PER PCR APPEDICE 2. RICERCA DI VIRUS INFLUENZALE A H5 (EMOAGGLUTININA) CON SAGGIO REAL- TIME PCR (TAQMAN).. 12 APPENDICE 3. PROFILI DI DIGESTIONE CON ENZIMA DI RESTRIZIONE DEGLI AMPLIFICATI REAL-TIME DI INFLUENZA H5 TIPO SELVAGGIO E DI QUELLI DEL CONTROLLO POSITIVO 13 BIBLIOGRAFIA Revisione no: 5 Data di revisione Emesso da Standards Unit, Department for Evaluations, Standards & Traing Pagina 3 di 14

4 PROCEDURA DI MODIFICA Documento di riferimento VSOP 41 controllato Titolo del documento controllato Real-time RT-PCR (Taq Man) per virus influenzali A H5. Ciascun Metodo Nazionale Standard possiede una registrazione separata con le modifiche. Le modifiche di questa revisione sono riportate in questa pagina. Le precedenti modifiche sono disponibili presso la standards@hpa.org.uk. Qualora vi sia una revisione di pagine o vengano emesse pagine nuove il proprietario di ciascun documento controllato dovrebbe aggiornare la copia in laboratorio. Modifica Numero/ Data 6/ Emissione no. Scartata Inserita Emissione no. Pagina Tutte Sessione(i) interessate Tutte Modifica Nome del Dipartimento modificato da ESL a DEST 2 Stato dei MNS Inserita informazione per la tassonomia 5 Introduzione Aggiornata valutazione informativa 7 Procedura ERNVL aggiornato a Cfi 10 Contatti Aggiornati Revisione no: 5 Data di revisione Emesso da Standards Unit, Department for Evaluations, Standards & Traing Pagina 4 di 14

5 REAL-TIME RT-PCR (TAQ MAN) PER I VIRUS INFLUENZALI A H5 Questi protocolli non devono essere divulgati ed i risultati ottenuti con questi saggi non possono essere pubblicati o presentati in riunioni pubbliche senza l esplicito consenso del Respiratory Virus Unit, Centre for Infections. Tipo di campioni Campioni respiratori Tamponi Nasali e Faringei Aspirati naso-faringei Lavaggio broncoalveolare Aspirato endotracheale Espettorato INTRODUZIONE Scopo Questo Metodo Nazionale Standard descrive un saggio real-time (TaqMan) RT-PCR one-step utilizzato per la ricerca dei virus influenzali A H5 in campioni clinici (secrezioni respiratorie). Il saggio più sensibile per la diagnosi differenziale dei virus Influenza A H5 nei campioni clinici è la ricerca dell RNA virale con specifica RT-PCR. Questo saggio utilizza primer specifici per i virus Influenzali A H5, differenziandoli dagli altri patogeni respiratori. Questi primer ed il probe, descritti in modo dettagliato in questo MNS, sono stati ottimizzati in modo accurato e saggiati con un ampia selezione di virus influenzali A H5, inclusi i ceppi di virus Influenza A H5 isolati fra il Per verificare la specificità di questo saggio per i virus influenzali A H5 è stato valutato un pannello di virus influenzali A (sottotipi H1-H15). Questo documento descrive le procedure per l esecuzione in unica fase della RT-PCR (trascrizione inversa ed amplificazione) eseguita nella stessa provetta) usando i primer ed un probe specifici per i virus influenzali A H5 (primer ed un probe specifici per il gene emoagglutinina dei virus Influenzali A H5). Il rilievo dell amplificazione è ottenuto con il monitoraggio dell incremento della fluorescenza nel corso della reazione. La conferma di positività per virus influenzali A H5 è ottenuta dopo digestione dell amplificato con due enzimi di restrizione di tipo diverso. Il profilo di restrizione dei prodotti derivati dall amplificato della PCR del virus di tipo-selvaggio può essere differenziato da quello del controllo positivo con l elettroforesi su gel di agarosio e colorazione con bromuro di etidio. Abbreviazioni: RT = Reverse Transcription PCR = Polymerase Chain Reaction Revisione no: 5 Data di revisione Emesso da Standards Unit, Department for Evaluations, Standards & Traing Pagina 5 di 14

6 1 CONSIDERAZIONI SULLA SICUREZZA RACCOLTA DEL CAMPIONE Appropriato contrassegno per identificazione del rischio secondo le procedure locali. 1.2 TRASPORTO E CONSERVAZIONE DEL CAMPIONE E essenziale il rispetto delle regolamentazioni di spedizione postale e di trasporto. Usare un sistema di trasporto per virus idoneo (ove richiesto) ed inserire il campione in contenitore o sacchetto di plastica chiuso. Appropriato contrassegno per identificazione del rischio secondo le procedure locali. 1.3 PROCEDURA SUL CAMPIONE Tutte le manipolazioni su materiale clinico di pazienti con sospetta infezione di influenza aviaria devono essere eseguite in ambiente di contenimento di livello 3 (CL3) all interno di cabine di sicurezza biologica di classe I/classe III. Dopo avere aggiunto il materiale clinico al tampone di lisi utilizzato per la procedura di estrazione, la successiva estrazione dell acido nucleico può essere eseguita in CL2. *Consultare - Informazioni utili per la scelta del metodo di estrazione. Buona pratica di laboratorio Le linee guida precedentemente esplicitate devono essere supplementate con la COSHH locale e la valutazione del rischio Deve essere sempre indossato il PPE (personal protective equipment abbigliamento di protezione personale) 2 PRELIEVO DEL CAMPIONE 2.1 TEMPO FRA PRELIEVO DEL CAMPIONE E PROCEDURA Il campione deve essere processato il più presto possibile. In teoria, i sistemi di trasporto devono garantire l arrivo del campione in laboratorio entro 24 ore. 3 STRUMENTAZIONE ABI Prism 7000 Real-time thermal cycler (Applaied Biosystems) Microcentrifuga picofuge Strisce di provette da 0.2 ml con tappo o piastre sigillate a 96 pozzetti (Applaied Biosystems) Pipette con puntali monouso con filtro 4 REAGENTI QuantiTect Probe RT-PCR kit (cat ) [2x QuantiTect probe RT-PCR Mastermix contente: HotStarTaq DNA polymerase, QuantiTect probe RT-PCR buffer (Tris-HCl, KCL, (NH 4 ) 2 SO 4, 8mM MgCl 2, ph 8.7), dntp mix, ROX passive reference dye; QuantiTect RT mix (Omniscript, Sensiscript reverse transcriptases); RNase-free water]. *Consultare Informazioni utili per scegliere la confezione one-step RT-PCR. Forward and reverse PCR primers (10pmol/µl working stock) (MWG): PCR7ModMMForward: 5 GCC GAA TGA TGC MAT MAA YT 3 PCR7Reverse: 5 CGC ACC CAT TGG AGT TTG AC 3 TaqMan minor groove binder probe (5µM working stock): PCR7degen 5 FAM CAT TGC TCC AGA AWA T MGBNFQ 3 (Applied Biosystems) Water (DNase- and RNase-free) (Promega) MS agarose (Roche) 10X Blue Juice Loading Buffer (Invitrogen) DNA Molecular weight markers; 50bp ladder (New England Biolabs), 10bp ladder (Invitrogen) Running buffer (1x TBE) (Invitrogen) Revisione no: 5 Data di revisione Emesso da Standards Unit, Department for Evaluations, Standards & Traing Pagina 6 di 14

7 Ethidium bromide solution (5mg/L) (Invitrogen) 10X NEBuffer 2 restriction digestion buffer (500mM NaCl, 100mM Tris-HCl, 100mM MgCl 2, 10mM dithiothreitol ph7.9). (New England Biolabs) 10X NEBuffer 3 restriction digestion buffer (1000mM NaCl, 500mM Tris-HCl, 100mM MgCl 2, 10mM dithiothreitol ph7.9). (New England Biolabs) 100X Bovine serum albumin (BSA) (New England Biolabs) Taq á I (recombinant) e Mse I (recombinant) restriction enzymes (New England Biolabs) 5 PROCEDURA 5.1 Estrarre 150µL di campione con metodo Boom (Allegato 1) o con robot per estrazione MagNAPure. *Consultare - Informazioni utili. Virus di controllo = Influenza A H5N3 A/Duck/Singapore/3/97 virus. Disponibile presso CfI; consultare Sezione 8.0 Contatti. Il materiale di controllo è stato preparato in aliquote da 600µL di virus in 200µL di tampone di lisi. Una aliquota di 200µL di questa miscela di controllo inattivata di virus/tampone di lisi deve essere estratta secondo quanto specificato al punto 5.1. Il controllo dell RNA virale è eluito in 100µL di acqua posta su ghiaccio. *Consultare - Informazioni utili. 5.2 Scongelare 2x Quantitect Probe RT-PCR Master Mix (se conservata a 20 o C), soluzioni primer e probe, e RNase-free water. Miscelare le singole soluzioni e collocarle su ghiaccio. Il QuantiTect RT mix deve essere prelevata da -20 o C immediatamente prima dell uso, mantenuta sempre su ghiaccio e riposta a 20 o C subito dopo l utilizzo. *Consultare Informazioni utili. 5.3 Preparare una RT- PCR mastermix, ad esempio per 10 reazioni: 250 L 2x RT-PCR Master Mix 45 L PCR7 ModMMforward primer 45 L PCR7 reverse primer 20 L PCR7 degenprobe (5 M working stock) 5 ul QuantiTect RT Mix 115 L RNase-free water 5.4 Distribuire 48µL per provetta o pozzetto in piastra. 5.5 Aggiungere a ciascuna reazione 2µL template RNA preparato al punto Utilizzare un ABI Prism 7000 real-time thermal cycler, selezionare come rilevatore FAM No Quencher, deselezionare il 9600 emulation checkbox (se è checked/selected come default), e usare il seguente protocollo ciclico; Incubare a 50 C per 30 minuti (trascrizione inversa) Incubare a 95 C per 15 minuti Incubare a 94 C per 15 sec Incubare a 60 C per 60 sec Ripetere i punti e altre 39 volte 5.7 Al termine della corsa controllare che siano corretti i setting di default ciclo d inizio e di fine e resettare se richiesto. Se necessario, regolare il valore della soglia spostandola al di sopra della fluorescenza rilevata dai controlli negativi. Selezionare l analisi per calcolare i valori dei Ct (ciclo soglia) per campioni e controlli positivi. (Consultare Allegato 2). 5.8 Per confermare i campioni positivi di influenza A H5, eseguire la digestione con enzima di restrizione, usando due differenti enzimi (Taq I e Mse I) nel seguente modo; Revisione no: 5 Data di revisione Emesso da Standards Unit, Department for Evaluations, Standards & Traing Pagina 7 di 14

8 5.9.1 Unire gli amplificati di duplicati di campioni con reazioni H5 positive in una provetta da 0.5mL (volume totale 100µL). Unire gli amplificati di duplicati di controlli H5 positivi in una nuova provetta da 0.5mL (volume totale 100µL) Digestione con enzima di restrizione Taq I; aliquotare 15µL di campione amplificato di virus influenzale A H5 in provette duplicate da 0.5mL Aliquotare 15µL di controllo amplificato block-based H5 positivo in provette duplicate da 0.5mL Aggiungere a ciascuna provetta: 2.5µL di buffer dell enzima di restrizione NEB3, 1.8µL acqua e 0.2µL di BSA Aggiungere 0.5µL di enzima di restrizione Taq I a ciascuna provetta contenete duplicati (a ciascuna provetta contenente il campione prodotto dalla PCR ed a ciascuna provetta contenente l amplificato del controllo positivo). Per preparare le reazioni dei controlli non digeriti privi di enzima, aggiungere in sua sostituzione 0.5µL di acqua alle altre provette contenenti amplificati ed a quella dell amplificato del controllo positivo H Incubare tutte le provette a 65 C per almeno un ora Digestione con Mse I restriction enzyme; aliquotare in duplicato 15µL di amplificato di virus influenzale A H5 in provette da 0.5mL Distribuire in duplicato 15µL di amplificato di controllo positivo H5 PCR block-based in provette da 0.5mL Aggiungere a ciascuna provetta 2.5µL di buffer dell enzima di restrizione NEB2, e poi 1.8µL di acqua e 0.2µL BSA Aggiungere 0.5µL di enzima di restrizione Mse I ad una delle due provette di ciascun gruppo dei duplicati (a quella che contiene l amplificato, ed alla provetta con l amplificato del controllo positivo). Per preparare le reazioni dei controlli non digeriti privi di enzima, aggiungere in sostituzione dell enzima, 0.5µL di acqua alle altre provette contenenti amplificati ed a quella dell amplificato del controllo positivo H Incubare tutte le provette a 37 C per almeno un ora Se le analisi sono eseguite immediatamente, porre le provette di reazione su ghiaccio. (Se non lo sono, inattivare le reazioni con calore a 65 C per 20 minuti) Analizzare i prodotti della digestione sottoponendo 20µL di campione a migrazione su 3% MS agarose gel TBE con un marcatore molecolare di peso del DNA. Al termine dell elettroforesi, colorare i gel con bromuro di etidio e visualizzare con esposizione a luce UV. L immagine attesa della digestione enzimatica degli amplificati del tipo-selvaggio e del controllo H5 sono riportati nell Appendice 3. La digestione con Taq I dell amplificato di H5 di tipo selvaggio deve produrre frammenti di DNA di 20 & 131bp, mentre quello del controllo positivo H5 non è digerito da Taq I per assenza del sito di restrizione (la dimensione dell amplificato non digerito è di 151bp). Si deve comunque rilevare che un sottogruppo del virus clade 2 H5N1 ha perso il sito di restrizione per Taq I e non sarà pertanto digerito da questo enzima. Gli amplificati H5 dei virus di questo sottogruppo possono essere differenziati dal controllo positivo dell amplificato real-time H5 tramite digestione con Mse I. L amplificato di tipo selvaggio H5 real-time non è digerito da Mse I in quanto nel DNA è assente la sequenza specifica per questo enzima di restrizione (dimensione dell amplificato non digerito di 151bp), mentre sono presenti frammenti di DNA di 69 e 82bp dopo digestione dell amplificato real-time del controllo positivo H5 con Mse I. Revisione no: 5 Data di revisione Emesso da Standards Unit, Department for Evaluations, Standards & Traing Pagina 8 di 14

9 *INFORMAZIONI UTILI Può essere utilizzato SuperScript III Platinum One-Step Quantitative RT-PCR system (Invitrogen; Cat. No o ) al posto della confezione QuantiTect Probe RT-PCR. Se si utilizza la confezione SuperScript III, preparare su ghiaccio una RT-PCR mastermix per 10 reazioni nel modo seguente; 250µL 2x Reaction Mix 45µL PCR7 ModMMforward primer 45µL PCR7 reverse primer 20µL PCR7 degenprobe (5µM working stock) 8µL SuperScript III RT/Platinum Taq mix 10µL ROX Reference Dye 102µL RNase-free water Procedere come al precedente Punto 5.4. L uso di SuperScript III Platinum One-Step Quantitative RT-PCR system consente l aumento della sensibilità del saggio di un logaritmo per un sottoinsieme di cladi umani ed aviari di virus 2 H5N1. In funzione del materiale disponibile, eseguire le reazioni dei campioni e dei controlli in duplicato o triplicato. Ogni laboratorio deve elaborare una valutazione del rischio sul campione(i) da analizzare che si ritiene possa contenere virus influenzali A H5 prima della suddivisione in aliquote per l estrazione con tampone di lisi. Il rapporto tampone di lisi e campione è minore nell estrazione eseguita con MagNAPure rispetto a quella manuale di Boom. Il rapporto più ridotto fra tampone di lisi e campione può non essere sufficiente ad inattivare elevati titoli di virus Influenzali A H5. L RNA virale restante dopo l RNA templato è rimosso al termine di questo saggio one-step e può essere utilizzato per generare cdna da utilizzare con un saggio RT-PCR two-step. 6 LABORATORIO DI RIFERIMENTO Inviare i campioni positivi per virus influenzali A H5 al Respiratory Virus Unit, CfI, Colindale. 7 SEGNALAZIONE ALLA HPA (LOCALE ED AI SERVIZI NAZIONALI ED AL CENTRO PER LE INFEZIONI) 8 Ogni risultato positivo per infezione causata da questo microrganismo deve essere immediatamente segnalo per garantire che sia intrapreso un appropriato intervento per la tutela della salute pubblica. La linea guida sulla procedura attuale per la refertazione di questa infezione è disponibile sul sito web dell HPA Qualsiasi richiesta sulla procedura di refertazione, o di qualsiasi altra condizione inerente problemi di salute pubblica deve essere discusso in prima istanza con la locale Health Protection Unit (HPU). Revisione no: 5 Data di revisione Emesso da Standards Unit, Department for Evaluations, Standards & Traing Pagina 9 di 14

10 8 CONTATTI Dr Joanna Ellis Clinical Scientist, Respiratory Virus Unit, Virus Reference Department, HPA, Centre for Infections, Colindale, London NW9 5HT. Tel: Joanna.Ellis@hpa.org.uk Dr Alison Bermingham Clinical Scientist, Respiratory Virus Unit, Virus Reference Department, HPA, Centre for Infections, Colindale, London NW9 5HT. Tel: Alison.Bermingham@hpa.org.uk Revisione no: 5 Data di revisione Emesso da Standards Unit, Department for Evaluations, Standards & Traing Pagina 10 di 14

11 APPENDICE 1. ESTRAZIONE ACIDO NUCLEICO PER PCR A1.1 REAGENTI Tampone L6 Tampone L2 Sospensione di silice Etanolo (70%) Acetone Acqua priva di RNasi RNasin (40,000U/mL) A1.2 PROCEDURA A1.2.1 Aggiungere 150µL di campione a 840µL di tampone L6, in una provetta da 1.5mL *Consultare Informazioni utili. A1.2.2 Aggiungere 10µL di sospensione di silice. A1.2.3 Passare su Vortex per 5 secondi, mettere poi su agitatore a temperatura ambiente per 10 minuti A1.2.4 Centrifugare per 15 secondi, scartare il sopranatante A1.2.5 Aggiungere 1mL di tampone L2, passare su vortex, centrifugare per 15 secondi e scartare il sopranatante A1.2.6 Ripetere A1.2.5 A1.2.7 Ripetere A1.2.5 con etanolo 70% al posto del tampone L2, due volte A1.2.8 Ripetere A1.2.5 con acetone al posto di etanolo, una volta A1.2.9 Asciugare i campioni per 10 minuti a 56 C, con coperchio aperto A Aggiungere 30µL di acqua priva di RNasi contenente 1µL di RNasin e passare su vortex per 5 secondi. A Eluire l acido nucleico a 56 C per 10 minuti A Passare su vortex e centrifugare per 5 minuti A Raccogliere l eluato con attenzione, non contaminare con silice NOTA TECNICA I residui di silice trasferiti alla fase successiva possono inibire l attività della transcrittasi inversa. Revisione no: 5 Data di revisione Emesso da Standards Unit, Department for Evaluations, Standards & Traing Pagina 11 di 14

12 APPENDICE 2. RICERCA DI VIRUS INFLUENZALI H5 (EMOAGGLUTININA) CON SAGGIO REAL-TIME PCR (TAQMAN) 1. Diagramma di amplificazione dati non elaborati 2. Diagramma di amplificazione dati elaborati Revisione no: 5 Data di revisione Emesso da Standadrds Units, Department for Evaluations, Standards & Traiing Pagina 12 di 14

13 APPENDICE 3. PROFILI DI DIGESTIONE CON ENZIMA DI RESTRIZIONE DEGLI AMPLIFICATI REAL-TIME DI INFLUENZA H5 TIPO SELVAGGIO E DI QUELLI DEL CONTROLLO POSITIVO bp 50bp Linea 1 e 24: 10bp marcatori peso molecolare DNA Linea 2 e 23: 50bp marcatori peso molecolare DNA Linea 3 e 13: Amplificato real-time controllo H5 positivo non digerito (151bp) Linea 8 e 18: Amplificato PCR real-time ceppo controllo positivo selvaggio influenza H5 (151bp) Linea 4 7: Amplificato PCR real-time controllo H5 positivo Taq I digest (Taq I site absent podotto 151bp). Linea 9 12: Amplificato PCR real-time tipo selvaggio H5 digerito conamplicon Taq I frammenti di 20 e 131bp) Linea 14 17: Amplificato PCR real-time controllo H5 positivo digerito con Mse I (frammeni di 69 e 82bp) Lane 19 22: Amplificato PCR real-time controllo H5 positivo ceppo selvaggio digerito con Mse I (sito Mse I assente, 151bp) Revisione no: 5 Data di revisione Emesso da Standadrds Units, Department for Evaluations, Standards & Traiing Pagina 13 di 14

14 BIBLIOGRAFIA 1. Department of Health NHS Executive: The Caldicott Committee. Report on the review of patientidentifiable information. London. December Advisory Committee on Dangerous Pathogens 2004 Approved List of Biological Agents. p Public Health Laboratory Service Standing Advisory Committee on Laboratory Safety. Safety Precautions: Notes for Guidance. 4 th ed. London: Public Health Laboratory Service (PHLS); Control of Substances Hazardous to Health Regulations General COSHH. Approved Code of Practice and Guidance, L5. Suffolk: HSE Books; Health and Safety Executive. 5 steps to risk assessment: a step by step guide to a safer and healthier workplace, IND (G) 163 (REVL). Suffolk: HSE Books; Health and Safety Executive. A guide to risk assessment requirements: common provisions in health and safety law, IND (G) 218 (L). Suffolk: HSE Books; Health Services Advisory Committee. Safety in Health Service laboratories. Safe working and the prevention of infection in clinical laboratories and similar facilities. 2 nd ed. Suffolk: HSE Books; Health Protection Agency. Laboratory reporting to the Health Protection Agency. Guide for diagnostic laboratories Revisione no: 5 Data di revisione Emesso da Standadrds Units, Department for Evaluations, Standards & Traiing Pagina 14 di 14