RICERCA SU CAMPIONI PER SPECIE BORDETELLA

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1 METODO STANDARD NAZIONALE RICERCA SU CAMPIONI PER SPECIE BORDETELLA BSOP 6 Emesso dalla Standards Unit, Evaluations and Standards Laboratory Specialist and Reference Microbiology Division Riferimento no: 6.1 Data di emissione: Emesso da: Standards Unit, Evaluations and Standards Laboratory Pagina 1 di 11

2 STATO DEI METODI STANDARD NAZIONALI I Metodi Standard Nazionali, che includono le standard operating procedures (SOPs), algoritmi e linee guida, promuovono l adozione di elevati livelli di qualità, contribuendo ad assicurare la possibilità di confronto delle informazioni diagnostiche ottenute in laboratori diversi Ciò consente la standardizzazione della sorveglianza sostenuta dalla ricerca, sviluppo e verifica, promovendo nello stesso tempo la salute pubblica e la fiducia del paziente nelle proprie strutture sanitarie. I metodi sono ben referenziati e rappresentano un buon standard minimo per la microbiologia clinica e per la salute pubblica. Comunque, utilizzando i Metodi Standard Nazionali, i laboratori dovranno tenere in considerazione le esigenze locali e potranno intraprendere ricerche addizionali. I metodi forniscono inoltre un punto di riferimento per un loro ulteriore sviluppo. I Metodi Standard Nazionali sono stati sviluppati, revisionati ed aggiornati con una procedura aperta di consenso ove le opinioni di tutti i partecipanti sono state tenute in adeguata considerazione ed i documenti elaborati riflettono il consenso della maggior parte degli stessi. I rappresentanti di alcune organizzazioni professionali, incluse quelle il cui logo appare sulla prima pagina, sono membri dei gruppi di lavoro che sviluppano i Metodi Nazionali Standard. L inclusione del logo di una organizzazione nella prima pagina implica sostegno agli obiettivi ed al processo di preparazione dei metodi standard. I componenti di queste organizzazioni scientifiche hanno partecipato allo sviluppo dei Metodi Nazionali Standard ma le loro opinioni personali non rispecchiano necessariamente quelle dell organizzazione di cui sono membri. L elenco attuale delle organizzazioni professionali partecipanti può essere ottenuto tramite all indirizzo standards@hpa.org.uk. Le prestazioni dei metodi standard sono condizionate dalla qualità di reagenti, strumentazione, procedure commerciali o prove messe a punto in loco. I laboratori dovrebbero assicurare che queste siano state validate e dimostrate idonee allo scopo prefissato. Devono essere adottate procedure di controllo di qualità interno ed esterno. Nonostante siano state osservate le più scrupolose attenzioni nella preparazione di questa pubblicazione, la Health Protection Agency o qualsiasi organizzazione di sostegno non può essere ritenuta responsabile dell accuratezza o dell utilizzo o di qualsiasi conseguenza derivante dall uso o da modifiche delle informazioni contenute in questo documento. Queste procedure sono intese solamente come una risorsa generale per i professionisti che esercitano in questo settore, operanti nel Regno Unito, pertanto si dovrà ricorrere ad altri consulenti quando ritenuto necessario. Se si apportano modifiche a questa pubblicazione, si deve porre in evidenza dove sono state apportate modifiche al documento originale. La Health Protection Agency (HPA) dovrà essere menzionata in ogni circostanza. La Health Protection Agency è una organizzazione indipendente che ha lo scopo di proteggere la salute della popolazione. Ad essa confluiscono esperienze professionali già appartenenti ad organizzazioni ufficiali. Maggiori informazioni riferibili alla HPA possono essere ottenute al sito La Health Protection Agency è un organizzazione che mira ad essere completamente in accordo con le direttive Caldicott. Ciò significa prendere ogni possibile precauzione per prevenire la diffusione non autorizzata di informazioni sui pazienti e di garantire che le informazioni relative agli stessi siano mantenute in condizioni di sicurezza 1. Maggiori dettagli possono essere ottenuti dal sito web. Contributi allo sviluppo dei documenti possono essere forniti contattando l indirizzo standards@hpa.org.uk. Per cortesia prendere nota che la bibliografia è attualmente formattata con il software Reference Manager. Se si modifica o si cancella il testo senza avere installato nel computer il Reference Manager, la bibliografia non sarà aggiornata automaticamente. Riferimento suggerito per questo documento: Health Protection Agency (2004). Investigation of specimens for Bordetella species. National Standard Method BSOP 6 Emissione 6. Riferimento no: 6.1 Data di emissione: Emesso da: Standards Unit, Evaluations and Standards Laboratory Pagina 2 di 11

3 INDICE STATO DEI METODI NAZIONALI STANDARD INDICE PROCEDURA DI MODIFICA SCOPO DEL DOCUMENTO INTRODUZIONE INFORMAZIONI TECNICHE LIMITI CONSIDERAZIONI SULLA SICUREZZA RACCOLTA DEL CAMPIONE TRASPORTO E CONSERVAZIONE DEL CAMPIONE PROCEDURA ANALITICA SUL CAMPIONE PRELIEVO DEL CAMPIONE TEMPO OTTIMALE PER IL PRELIEVO DEL CAMPIONE TIPO DI CAMPIONE APPROPRIATO E METODO DI PRELIEVO QUANTITA E NUMERO APPROPRIATO DI CAMPIONI TRASPORTO E CONSERVAZIONE DEL CAMPIONE TEMPO FRA PRELIEVO DEL CAMPIONE E PROCEDURA ANALITICA ACCORGIMENTI PARTICOLARI PER RIDURRE IL DETERIORAMENTO PROCEDURA SUL CAMPIONE SELEZIONE DELLA PROVA ASPETTO MICROSCOPIA COLTURA E MODALITA DI RICERCA IDENTIFICAZIONE PROVE DI SENSIBILITA AGLI ANTIBIOTICI PROCEDURA DI REFERTAZIONE MICROSCOPIA COLTURA PROVE DI SENSIBILITA' SEGNALAZIONI ALLA HPA (LOCALE ED AI SERVIZI NAZIONALI ED AL CENTRO CDSC PER LE INFEZIONI) BIBLIOGRAFIA Riferimento no: 6.1 Data di emissione: Emesso da: Standards Unit, Evaluations and Standards Laboratory Pagina 3 di 11

4 PROCEDURA DI MODIFICA Documento di riferimento controllato BSOP 6 Titolo del documento controllato Procedura Operativa Standard per la ricerca su campioni per specie Bordetella Ciascun documento controllato possiede una registrazione separata con le correzioni specificate in modo dettagliato in questa Procedura di Modifica. Le precedenti modifiche sono disponibili presso la standards@hpa.org.uk. Sull emissione di pagine nuove o rivedute ciascun documento controllato deve essere aggiornato dal proprietario del Laboratorio Modifica Numero/ Data 7/ Emissione no. Scartata Inserita Emissione no Pagina Sessione(i) interessate Modifica 2 Prima pagina Stato del Documento Ridisegnata Revisionato 4 Pagina della procedura di modifica Ridisegnata Riferimento no: 6.1 Data di emissione: Emesso da: Standards Unit, Evaluations and Standards Laboratory Pagina 4 di 11

5 PROCEDURE OPERATIVE STANDARD PER LA RICERCA DI SPECIE DI BORDETELLA NEI CAMPIONI BIOLOGICI Tipo di campione: Tampone transnasale, Aspirato nasofaringeo e Tampone nasofaringeo SCOPO DEL DOCUMENTO Questo documento descrive le procedure e la ricerca batteriologica sui campioni per l isolamento di specie Bordetella. INTRODUZIONE La sindrome completamente sviluppata della tosse abbaiante (pertosse, tosse violenta ) non è difficile da diagnosticare, ma possono manifestarsi forme fruste (abortive o di malattia atipica, di malattia risolta per incompleta evoluzione, che possono far insorgere difficoltà diagnostiche. La sindrome da tosse abbaiante è determinata dalla Bordetella pertussis, ma può essere causata anche da Mycoplasma pneumoniae e da virus quali gli adenovirus ed enterovirus 2. Si devono fare alcune considerazioni per una valutazione appropriata dei pazienti con la sindrome della pertosse nei quali l infezione da B. pertussis non può essere dimostrata. Si consiglia di eseguire due tamponi transnasali, uno per la ricerca colturale delle specie di Bordetella e l altro per le colture virali. La ricerca della B. pertussis nei campioni respiratori è possibile anche con la PCR che può risultare più sensibile dell esame colturale 3. La B. pertussis infetta di solito bambini in tenera età nei quali determina una malattia respiratoria severa, anche se può causare malattia anche negli adulti 4-5. Rappresenta un problema particolare nei pazienti con sindrome da immunodeficienza acquisita (AIDS) 6. I sintomi possono essere più simili ad una malattia di tipo virale negli adulti e nei bambini di età maggiore. La malattia è severa nei bambini piccoli causando soffocamento e cianosi. Il trattamento nelle fasi precoci riduce la gravità della malattia e la sua diffusione successiva. La diagnosi precoce di laboratorio è essenziale per il controllo e la prevenzione della pertosse. L isolamento e la tipizzazione del microrganismo è molto importante per il continuo monitoraggio del programma di vaccinazione. La Bordetella parapertussis causa una forma attenuata di infezione 7-9. Causa infezioni gravi nei pazienti immunodepressi 10. Informazioni tecniche I terreni possono consentire la crescita della B. pertussis, sopprimere la flora nasofaringea ed essere stabili durante la loro conservazione. Sono disponibili diversi tipi di terreno contenenti sangue o carbone o entrambi, con supplemento di antibiotici selettivi quali penicillina, cefalexina o meticillina La meticillina è la meno inibitoria verso la B. pertussis ed è anche meno inibitoria verso la flora nasofaringea. La cefalexina è la più inibitoria per la flora nasofaringea ed è superiore alla penicillina. Per questi motivi questo è l antibiotico di scelta da utilizzare nei terreni selettivi proposto da questa SOP Le piastre di primo isolamento sono incubate a C, in atmosfera umida aerobica 17, conservate per 7 giorni. E richiesta una piastra di spessore consistente. Tipologia del campione le attuali raccomandazione per il prelievo dei campioni consigliano l utilizzo dell aspirato nasofaringeo 14. Comunque, quando questo tipo di campione non può essere ottenuto, o non rientra nella pratica usuale, possono essere utilizzati i tamponi transnasali e nasofaringei 18. Si consiglia l utilizzo di due tamponi transnasali: uno per la ricerca colturale delle specie di Bordetella e l altro per le colture virali E attualmente controverso se gli aspirati nasofaringei od i tamponi transnasali rappresentino i campioni da preferirsi per raggiungere una precisa diagnosi Tamponi transnasali - l unica fibra raccomandata per la diagnosi di pertosse è il Dracon TM. La B. pertussis ha una maggiore affinità per il Dacron TM rispetto al cotone idrofilo o cotone idrofilo trattato ed il suo utilizzo pertanto migliora il riscontro del microrganismo 22. Questo materiale presenta un minor livello inibitorio anche per le tecniche PCR 23. LIMITI Sebbene questa SOP non raccomandi l utilizzo delle piastre esposte a colpi di tosse, queste sono utilizzate da alcuni pediatri. Riferimento no: 6.1 Data di emissione: Emesso da: Standards Unit, Evaluations and Standards Laboratory Pagina 5 di 11

6 1.0 CONSIDERAZIONI SULLA SICUREZZA RACCOLTA DEL CAMPIONE La raccolta delle secrezioni nasofaringee nei pazienti con pertosse può fare insorgere un eccesso parossistico di tosse e determinare l ostruzione delle vie aeree. Se si sospetta un caso di pertosse deve essere disponibile la strumentazione per la rianimazione. Il sanitario che raccoglie il prelievo deve evitare di esporsi direttamente ai colpi di tosse del paziente 1.2 TRASPORTO E CONSERVAZIONE DELCAMPIONE Tamponi transnasali e nasofaringei Contenitori di plastica chiusi Aspirati nasofaringei Contenitore impermeabile sterile in sacchetto di plastica chiuso 1.3 PROCEDURA ANALITICA SUL CAMPIONE Livello di contenimento 2 Tutte le manipolazioni che si ritiene possano generare aerosol infettivi devono essere eseguite in cabina microbiologica di sicurezza Fare riferimento alle vigenti linee guida sulla sicurezza per la manipolazione di tutti i microrganismi riportati in questa SOP Le linee guida precedentemente esplicitate devono essere supplementate con la COSHH locale e con la valutazione del rischio E essenziale l adeguamento alle regolamentazioni della posta e del trasporto 2.0 PRELIEVO DEL CAMPIONE 2.1 TEMPO OTTIMALE DI PRELIEVO DEL CAMPIONE All insorgenza dei sintomi. Prima della terapia antimicrobica se possibile 2.2 TIPO DI CAMPIONE E METODO DI PRELIEVO APPROPRIATI Un tampone transnasale (Dacron TM con filo di supporto flessibile) è inserito attraverso la narice e fatto penetrare lungo la base del naso fino a raggiungere il nasofaringe. E stato consigliato di mantenere il tampone contro la parete posteriore del nasofaringe per almeno 30 secondi o fino a quando il paziente tossisce. E più verosimile, nella pratica, che il paziente sia in grado di tollerare questa condizione per pochi secondi 14. L essudato nasofaringeo può essere raccolto utilizzando un catetere da suzione (French No. 8) inserito attraverso il naso. L essudato è raccolto in un contenitore sterile di plastica tramite nel quale il campione è trasportato al laboratorio oppure in un contenitore sterile di plastica trasparente di tipo comune (da 30 o 60 ml, vedi BS 5213) Nota: Non sono raccomandate le piastre esposte a colpi di tosse 2.3 QUANTITA ADEGUATA E NUMERO APPROPRIATO DI CAMPIONI Riferimento no: 6.1 Data di emissione: Emesso da: Standards Unit, Evaluations and Standards Laboratory Pagina 6 di 11

7 3.0 TRASPORTO E CONSERVAZIONE DEL CAMPIONE 3.1 TEMPO FRA PRELIEVO DEL CAMPIONE E PROCEDURA ANALITICA I campioni devono essere trasportati e processati il più presto possibile 35, 36 Le piastre devono essere inoculate al letto del paziente 3.2 ACCORGIMENTI SPECIALI PER RIDURRE IL DETERIORAMENTO I tamponi devono essere inviati in terreno di trasporto con carbone quale quello di Regan-Lowe 4.0 PROCEDURA SUL CAMPIONE 4.1 SELEZIONE DELLA PROVA 4.2 ASPETTO 4.3 MICROSCOPIA 4.4 COLTURA E RICERCHE Pretrattamento Procedura sul campione Tamponi transnasali e nasofaringei Inoculare col tampone ogni piastra di agar (consultare BSOP 54) Diffondere l inoculo con un ansa sterile per ottenere la crescita di colonie isolate Aspirato nasofaringeo Utilizzando un ansa sterile selezionare una parte rappresentativa del campione ed inoculare un ansata per ogni piastra di agar (consultare BSOP 54) Diffondere l inoculo con un ansa sterile per ottenere la crescita di colonie isolate Riferimento no: 6.1 Data di emissione: Emesso da: Standards Unit, Evaluations and Standards Laboratory Pagina 7 di 11

8 4.4.3 Terreni di coltura, condizioni e microrganismi17, 35 Per tutti i campioni Aspetti clinici/ condizioni Terreni standard Incubazione Temp C Atmosfera Tempo Lettura colture Microrganismo (i) Ricercati? pertosse o tosse ululante Agar sangue carbone con cefalexina aria, camera umida 7 giorni al 4 e 7 giorno B. pertussis B. parapertussis 4.5 IDENTIFICAZIONE Livello minimo in laboratorio Bordetella a livello di specie Inviare al Laboratorio di Riferimento Specie Bordetella per conferma e sierotipizzazione Tutti gli isolati devono essere inviati al Laboratorio di Riferimento facente parte del programma di sorveglianza nazionale condotto dalla Health Protection Agency Il Laboratorio di Riferimento fornisce servizi addizionali quando si rispettano alcune condizioni: E data la possibilità di avere la PCR (senza alcuna spesa) per bambini di meno di 6 mesi ricoverati in ospedale per possibile B. pertussis E disponibile un accertamento sierologico per soggetti con tosse persistente ove sono disponibili due campioni di siero od anche uno solo, prelevati più di tre settimane dopo l esordio Inviare a: Respiratory and Systemic Infection Laboratory Health Protection Agency Specialist and Reference Microbiology Division 61 Colindale Avenue London NW9 5HT 4.6 PROVE DI SENSIBILITA AGLI ANTIBIOTICI 5.0 PROCEDURE DI REFERTAZIONE 5.1 MICROSCOPIA Tempo di risposta dell esame microscopico 5.2 COLTURE Negative Bordetella pertussis NON isolata Riferimento no: 6.1 Data di emissione: Emesso da: Standards Unit, Evaluations and Standards Laboratory Pagina 8 di 11

9 Positive Bordetella pertussis isolata o Bordetella parapertussis isolata Tempo di refertazione delle colture I risultati clinicamente urgenti delle colture devono essere comunicati per telefono od inviati per via elettronica Referto scritto fino a 7 giorni 5.3 PROVE DI SENSIBILITA 6.0 SEGNALAZIONI ALLA HPA 37 (LOCALE ED AI SERVIZI NAZIONALI ED AL CENTRO CDSC PER LE INFEZIONI) Tutti gli isolati di Bordetella devono essere segnalati al CRD, CDSC e al CCDC Riferimento no: 6.1 Data di emissione: Emesso da: Standards Unit, Evaluations and Standards Laboratory Pagina 9 di 11

10 BIBLIOGRAFIA 1. The Caldicott Committee. Report on the review of patient-identifiable information London, Department of Health NHS Executive. 2. Read RC, Finch RG. Bacterial infections of the respiratory tract. In: Husler WJ Jr, Sussman M, editors. Topley and Wilson's Microbiology and Microbial Infections. London: Arnold; p Schmidt-Schlapfer G, Liese JG, Porter F, Stojanov S, Just M, Belohradsky BH. Polymerase chain reaction (PCR) compared with conventional identification in culture for detection of Bordetella pertussis in 7153 children. Clin Microbiol Infect 1997;3: Halperin SA, Marrie TJ. Pertussis encephalopathy in an adult: case report and review. Rev Infect Dis 1991;13: Aoyama T, Takeuchi Y, Goto A, Iwai H, Murase Y, Iwata T. Pertussis in adults. Am J Dis Child 1992;146: Ng VL, York M, Hadley WK. Unexpected isolation of Bordetella pertussis from patients with acquired immunodeficiency syndrome. J Clin Microbiol 1989;27: Thong ML. Parapertussis: report of a case and a review of the literature. Pathology 1991;23:S Wirsing von Konig CH, Finger H. Role of pertussis toxin in causing symptoms of Bordetella parapertussis infection. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 1994;13: Heininger U, Stehr K, Schmitt-Grohe S, Lorenz C, Rost R, Christenson PD, et al. Clinical characteristics of illness caused by Bordetella parapertussis compared with illness caused by Bordetella pertussis. Pediatr Infect Dis J 1994;13: Nordmann P, Francois B, Menozzi FD, Commare MC, Barois A. Whooping cough associated with Bordetella parapertussis in a human immunodeficiency virus-infected child. Pediatr Infect Dis J 1992;11: Ruijs GJ, Groenendijk TW, Biever M. Shelf life of prepared Bordet-Gengou and Regan-Lowe agar plates for isolation of Bordetella pertussis. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 1991;10: Jones GL, Kendrick PL. Study of a blood-free medium for transport and growth of Bordetella pertussis. Health Lab Sci 1969;6: Stauffer LR, Brown DR, Sandstrom RE. Cephalexin-supplemented Jones-Kendrick charcoal agar for selective isolation of Bordetella pertussis: comparison with previously described media. J Clin Microbiol 1983;17: Ahmad F, Calder MA. Isolation of Bordetella pertussis: benefits of using both Bordet-Gengou and charcoal agar media. J Clin Pathol 1984;37: Hoppe JE, Vogl R. Comparison of three media for culture of Bordetella pertussis. Eur J Clin Microbiol 1986;5: Regan J, Lowe F. Enrichment medium for the isolation of Bordetella. J Clin Microbiol 1977;6: Hoppe JE, Schlagenhauf M. Comparison of three kinds of blood and two incubation atmospheres for cultivation of Bordetella pertussis on charcoal agar. J Clin Microbiol 1989;27: Hoppe JE. Methods for isolation of Bordetella pertussis from patients with whooping cough. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 1988;7: Darling WM. Bacteriological diagnosis of pertussis. Lancet 1983;1: Riferimento no: 6.1 Data di emissione: Emesso da: Standards Unit, Evaluations and Standards Laboratory Pagina 10 di 11

11 20. Gilligan PH. Laboratory diagnosis of Bordetella pertussis. Clin Microbiol Newslett 1983;27: Halperin SA, Bortolussi R, Wort AJ. Evaluation of culture, immunofluorescence, and serology for the diagnosis of pertussis. J Clin Microbiol 1989;27: Hoppe JE, Weiss A. Recovery of Bordetella pertussis from four kinds of swabs. Eur J Clin Microbiol 1987;6: Wadowsky RM, Laus S, Libert T, States SJ, Ehrlich GD. Inhibition of PCR-based assay for Bordetella pertussis by using calcium alginate fiber and aluminum shaft components of a nasopharyngeal swab. J Clin Microbiol 1994;32: Advisory Committee on Dangerous Pathogens. Categorisation of biological agents according to hazard and categories of containment. 4th ed. Suffolk: HSE Books; Supplements 1, 1998 and 2, Public Health Laboratory Service Standing Advisory Committee on Laboratory Safety. Safety Precautions: Notes for Guidance. 4th ed. London: Public Health Laboratory Service (PHLS); Control of Substances Hazardous to Health Regulations General COSHH Approved Code of Practice and Guidance, L5. Suffolk: HSE Books; Health and Safety Executive. 5 steps to risk assessment: a step by step guide to a safer and healthier workplace, IND (G) 163 (REVL). Suffolk: HSE Books; Health and Safety Executive. A guide to risk assessment requirements: common provisions in health and safety law, IND (G) 218 (L). Suffolk: HSE Books; Health Services Advisory Committee. Safety in Health Service laboratories. Safe working and the prevention of infection in clinical laboratories and similar facilities. 2nd ed. Suffolk: HSE Books; NHS Estates. Health Building Note 15. Accommodation for pathology services. 1st ed. London: Her Majesty's Stationary Office (HMSO); (Out of print - 2nd edition in press). 31. BS EN 12469: Biotechnology - performance criteria for microbiological safety cabinets. London: British Standards Institution (BSI); BS 5726: Microbiological safety cabinets. Part 2. Recommendations for information to be exchanged between purchaser, vendor and installer and recommendations for installation. London: British Standards Institution (BSI); BS 5726: Microbiological safety cabinets. Part 4. Recommendations for selection, use and maintenance. London: British Standards Institution (BSI); Advisory Committee on Dangerous Pathogens. The management, design and operation of microbiological containment laboratories. Suffolk: HSE Books; Sneed JO. Processing and interpretation of upper respiratory tract specimens. In: Isenberg HD, editor. Clinical Microbiology Procedures Handbook. Washington D.C.: American Society for Microbiology; p Preston NW. Technical problems in the laboratory diagnosis and prevention of whooping-cough. Lab Pract 1970;19: PHLS CDSC. Reporting to the PHLS Communicable Disease Surveillance Centre: a reference for laboratories. May Riferimento no: 6.1 Data di emissione: Emesso da: Standards Unit, Evaluations and Standards Laboratory Pagina 11 di 11