RICERCA E CONTEGGIO DI SPECIE LEGIONELLA CON FILTRAZIONE E CENTRIFUGAZIONE

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1 METODO NAZIONALE STANDARD RICERCA E CONTEGGIO DI SPECIE LEGIONELLA CON FILTRAZIONE E CENTRIFUGAZIONE W 12 Emesso da Standards Unit, Evaluations and Standards Laboratory Centre for Infections Regional Food, Water and Environmental Coordinators Forum Pagina 1 di 17

2 STATO DEI METODI NAZIONALI STANDARD I Metodi Nazionali Standard, che includono le procedure operative standard (POS) algoritmi e linee guida, promuovono l adozione di elevati livelli di qualità, contribuendo ad assicurare la possibilità di confronto delle informazioni diagnostiche ottenute in laboratori diversi. Ciò consente la standardizzazione della sorveglianza sostenuta dalla ricerca, sviluppo e verifica, promovendo nello stesso tempo la salute pubblica e la fiducia del paziente nelle proprie strutture sanitarie. I metodi sono ben referenziati e rappresentano un buon standard minimo per la microbiologia clinica e per la salute pubblica. Comunque, utilizzando i Metodi Nazionali Standard, i laboratori dovranno tenere in considerazione le esigenze locali e potranno intraprendere ricerche addizionali. I metodi forniscono inoltre un punto di riferimento per un loro ulteriore sviluppo. I Metodi Nazionali Standard sono stati sviluppati, revisionati ed aggiornati con una procedura aperta di consenso ove le opinioni di tutti i partecipanti sono state tenute in adeguata considerazione ed i documenti elaborati riflettono il consenso della maggior parte degli stessi. I rappresentanti di alcune organizzazioni professionali, incluse quelle il cui logo appare sulla prima pagina, sono membri dei gruppi di lavoro che sviluppano i Metodi Nazionali Standard. L inclusione del logo di una organizzazione nella prima pagina implica sostegno agli obiettivi ed al processo di preparazione dei metodi standard. I componenti di queste organizzazioni scientifiche hanno partecipato allo sviluppo dei Metodi Nazionali Standard ma le loro opinioni personali non rispecchiano necessariamente quelle dell organizzazione di cui sono membri. L elenco attuale delle organizzazioni professionali partecipanti può essere ottenuto tramite all indirizzo standards@hpa.org.uk. Le prestazioni dei metodi standard sono condizionate dalla qualità di reagenti, strumentazione, procedure commerciali o prove messe a punto in loco. I laboratori dovrebbero assicurare che queste siano state validate e dimostrate idonee allo scopo prefissato. Devono essere adottate procedure di controllo di qualità interno ed esterno. Nonostante siano state osservate le più scrupolose attenzioni nella preparazione di questa pubblicazione, la Health Protection Agency o qualsiasi organizzazione di sostegno non può essere ritenuta responsabile dell accuratezza o dell utilizzo o di qualsiasi conseguenza derivante dall uso o da modifiche delle informazioni contenute in questo documento. Queste procedure sono intese solamente come una risorsa generale per i professionisti che esercitano in questo settore, operanti nel Regno Unito, pertanto si dovrà ricorrere ad altri consulenti quando ritenuto necessario. Se si apportano modifiche a questa pubblicazione, si deve porre in evidenza dove sono state apportate modifiche al documento originale. La Health Protection Agency (HPA) dovrà essere informata in ogni circostanza. La HPA è una organizzazione indipendente che ha lo scopo di proteggere la salute della popolazione. Ad essa confluiscono esperienze professionali già appartenenti ad organizzazioni ufficiali. Maggiori informazioni riferibili alla HPA possono essere ottenute al sito La HPA è un organizzazione che mira ad essere completamente in accordo con le direttive Caldicott. Ciò significa prendere ogni possibile precauzione per prevenire la diffusione non autorizzata di informazioni sui pazienti e di garantire che le informazioni relative agli stessi siano mantenute in condizioni di sicurezza 1. Maggiori dettagli possono essere ottenuti dal sito web. Contributi allo sviluppo dei documenti possono essere forniti contattando l indirizzo standards@hpa.org.uk. Per cortesia prendere nota che la bibliografia è attualmente formattata con il software Reference Manager. Se si modifica o si cancella il testo senza avere installato nel computer il Reference Manager; la bibliografia non sarà aggiornata automaticamente. Riferimento suggerito per questo documento: Health Protection Agency (2006). Detection and enumeration of Legionella species by filtration and centrifugation. National Standard Method W 12 Emissione 1. Regional Food, Water and Environmental Coordinators Forum Pagina 2 di 17

3 INDICE STATO DEI METODI NAZIONALI STANDARD INDICE... 3 PROCEDURA DI MODIFICA... 4 SCOPO DEL DOCUMENTO... 5 INTRODUZIONE DEFINIZIONI PRINCIPIO CONSIDERAZIONI SULLA SICUREZZA PRELIEVO DEL CAMPIONE TRASPORTO E CONSERVAZIONE DEL CAMPIONE PROCEDURA SUL CAMPIONE ATTREZZATURA TERRENI DI COLTURA E REAGENTI PROCEDURA SUL CAMPIONE PREPARAZIONE DEL CAMPIONE FILTRAZIONE PREPARAZIONE DEL CAMPIONE CONCENTRATO CENTIFUGAZIONE PRE-TRATTAMENTO E SEMINA SU PIASTRE DI AGAR SELETTIVO ICUBAZIONE E LETTURA DELLE PIASTRE DEGLI AGAR SELETTIVI CONTEGGIO DELLE COLONIE IDENTIFICAZIONE E TIPIZZAAZIONE CALCOLO DEI RISULTATI LIMITE DI RILEVAZIONE 12 8 REFERTO CONTROLLO DI QUALITA TERRENO MEMBRANA DI FILTRAZIONE PIROVE DI CONFERMA STRUTTURE DI RIFERIMENTO RINGRAZIAMENTI E CONTATTI ALLEGATO: DIAGRAMMA DI FLUSSO CHE ILLUSTRA LA PROCEDURA DI CONTEGGIO DI LEGIONELLA CON MEMBRANA DI FILTRAZIONE BIBLIOGRAFIA Regional Food, Water and Environmental Coordinators Forum Pagina 3 di 17

4 PROCEDURA DI MODIFICA Documento di riferimento controllato Titolo del documento controllato W 12 Ricerca e conteggio di specie Legionella con filtrazione e centrifugazione Ciascun Metodo Nazionale Standard possiede una registrazione separata con le modifiche. Le modifiche di questa revisione sono riportate in questa pagina. Le precedenti modifiche sono disponibili presso la standards@hpa.org.uk. Qualora vi sia una revisione di pagine o vengano emesse pagine nuove il proprietario di ciascun documento controllato dovrebbe aggiornare la copia in laboratorio Modifica Numero/ Data 2/ Emissione no. Scartata Inserita Emissione no Pagina Sessione(i) interessate Generalità Modifica Aggiornate per includere anche la ISO mentre è in revisione Conferma di specie Legionella Titolo modificato in presunta Legionella e sezione aggiornata per evitare l uso di agar sangue Terreno Aggiunta un indicazione quantitativa Prova di conferma Aggiunto controllo negativo Regional Food, Water and Environmental Coordinators Forum Pagina 4 di 17

5 RICERCA ED IL CONTEGGIO DI SPECIE LEGIONELLA CON FILTRAZIONE E CENTRIFUGAZIONE SCOPO DEL DOCUMENTO Il presente metodo è applicabile a campioni idrici relativamente limpidi, in modo particolare a quelli dei sistemi di acqua calda e fredda di grandi complessi. Il metodo è indicato per volumi fino ad 1 litro. INTRODUZIONE Generalità Le specie Legionella sono agenti causali della legionellosi; si tratta di batteri che vivono nell acqua, presenti ovunque in natura e che sono riscontrati nell ambiente idrico in un ampio intervallo di temperature, ma che si sviluppano meglio a quelle elevate, comprese fra 30 C e 40 C 2. La tolleranza a temperature relativamente elevate probabilmente le aiuta a colonizzare alcuni sistemi idrici artificiali che spesso sono a temperature superiori a quelle ambientali. Le Legionelle sono prevalenti nei sistemi idrici artificiali, e la legionellosi si trasmette da questi mediante aerosol ed occasionalmente per aspirazione. Le torri di raffreddamento sono spesso coinvolte in epidemie acquisite nella comunità e, sebbene i sistemi di acqua calda siano comunemente coinvolti nelle epidemie nosocomiali, sono state descritte numerose altre sorgenti. I campioni idrici possono essere indagati per le specie Legionella in corso di ricerche epidemiologiche come sorveglianza dell autorità locale, industriale, di un programma di controllo ospedaliero, per la validazione di un nuovo trattamento battericida o per altri metodi di controllo. Se le condizioni di temperatura specificate non sono state controllate, o sono state disattese, o se la condizione del rischio locale ne suggerisce la necessità, anche la HSE 3 raccomanda di routine, almeno trimestralmente, il campionamento dalle torri di raffreddamento e di quello dei sistemi idrici di acqua fredda e calda. Anche negli ambienti ospedalieri i conteggi delle specie di Legionella sono spesso ridotti, raramente superano l 1% del totale della popolazione batterica. Pertanto è di solito necessario concentrare la flora batterica dall acqua prima di adottare tecniche colturali selettive per l isolamento di Legionella. In ogni caso, in corso di epidemia, quando le potenziali sorgenti possono contenere elevate concentrazioni di legionelle ed essere contaminate in modo grossolano da altri batteri, le ricerche sui campioni devono essere eseguite con e senza procedura di concentrazione. I campioni non concentrati spesso presentano legionella, mentre non sono rilevabili nei campioni concentrati a causa dell eccessiva sovra-crescita di altri microrganismi. La concentrazione può essere ottenuta da una combinazione costituita da pressione di filtrazione negativa, con utilizzo di filtri a membrana del diametro di 47 mm e centrifugazione, come di seguito descritto. Le procedure descritte si avvalgono della BS 6068 (ISO 11731) 4 e di altra bibliografia 5. Note: La ISO è ora suddivisa in due parti. L ultima, la Parte 2 (BS - ISO :2004 BS :2004 Water quality - Detection and enumeration of Legionella Part 2: Direct membrane filtration method for waters with low bacterial counts. London: British Standards Institution; 1998) è solo applicabile ad acque disinfettate con conteggio di fondo ridotto ed utilizza la filtrazione seguita dalla deposizione diretta della membrana su un terreno selettivo. La ISO originale è ancora valida ed ora è in revisione. A termine delle revisione sarà definita ISO Part 1. La HPA non ha adottato la ISO Parte 2 come metodo standard proprio, ma continuerà a seguire la ISO Parte 1. Regional Food, Water and Environmental Coordinators Forum Pagina 5 di 17

6 1 DEFINIZIONI Per gli obiettivi di questo metodo la Legionella è definita come un genere di microrganismi Gramnegativi normalmente in grado di crescere in non meno di 2 giorni sull agar tamponato di carbone estratto di lievito (BCYE, buffered charcoal yeast extract) contenente L-cisteina ed una sorgente di ferro. I microrganismi formano colonie spesso bianche, dal porpora al blu, o di colore verde vischio, che possono divenire fluorescenti sotto luce ultravioletta. Le colonie assumono aspetto di vetro smerigliato od opalescente se osservate con microscopio a bassa risoluzione. La crescita non si manifesta in assenza di cisteina. 2 PRINCIPIO La microflora presente in un campione di acqua è dapprima concentrata con pressione negativa per filtrazione su una membrana di nailon del diametro di 47 mm (dimensione dei pori 0.2 µm). La microflora trattenuta dal filtro è eluita in un liquido appropriato o in acqua distillata sterile ed in seguito concentrata con centrifugazione. Una quota della sospensione risultante è sottoposta a trattamento con acido ed un'altra a trattamento termico. Le quote trattate e non sono seminate su piastre di agar selettivi per le specie Legionella e poste ad incubare. Al termine dell incubazione, le colonie che assumono aspetti caratteristici sui terreni selettivi sono considerate sospette per specie Legionella e contate. Le colonie sospette per Legionella sono poste in sottocoltura per verificare la loro richiesta di L-cisteina per la crescita, ed il numero dei microrganismi confermati è calcolato per 1 litro di campione. 3 CONSIDERAZIONI SULLA SICUREZZA 6-15 Adottare le normali precauzioni del laboratorio di microbiologia. 3.1 PRELIEVO DEL CAMPIONE N/D 3.2 TRASPORTO E CONSERVAZIONE DEL CAMPONE E essenziale l adeguamento alle attuali regolamentazioni della posta e del trasporto. 3.3 PROCEDURA SUL CAMPIONE Sebbene la Legionella appartenga ai microrganismi del Gruppo di Rischio 2, l agitazione e la miscelazione con vortex dei materiali concentrati deve essere eseguita in una cabina microbiologica di sicurezza in conformità alla EN 12469:2000 Biotecnologia Criteri di prestazione per cabina microbiologica di sicurezza I contenitori della centrifuga devono essere aperti all interno di una cabina di sicurezza. Se non si sono manifestate perdite, le provette devono essere rimosse con attenzione per non modificare il deposito. Se si sono verificate perdite, ci si deve cautelare secondo le normali procedure di sicurezza del laboratorio Le seguenti indicazioni devono essere supplementate con le indicazioni del COSHH locale e con la valutazione del rischio 4 ATTREZZATURA Normale attrezzatura di laboratorio ed aggiungere: Membrane di filtrazione di tipo diverso Imbuti da filtro (graduati) Regional Food, Water and Environmental Coordinators Forum Pagina 6 di 17

7 Raccordi pre-filtro (opzionali) Recipienti di pirex per il vuoto (capacità >5 L) con rivestimento protettivo o equivalenti Pompa a vuoto, con raccoglitore di umidità o filtro protettivo Pinze di acciaio inossidabile a punta piatta o equivalenti Forbici Bagno per bollitura (strumento di sterilizzazione) Centrifuga dotata di dispositivo di sicurezza ed in grado di raggiungere almeno 3000 x g ± 100 x g Bagno ad acqua a 50 C ± 1 C Cabina microbiologica di sicurezza Termostato: 36 C ± 1 C (con umidificatore e preferibilmente 2.5% di CO 2 ) Microscopio stereoscopio per piastre con illuminazione incidente obliqua Lampada ultravioletta (lunghezza d onda UV 366 nm) Membrane filtranti - 47 mm di diametro, porosità 0.2µm, poliamide (nailon) Sacchetti per stomacher Pipettatori automatici e punte di pipette sterili in grado di distribuire volumi da ml (opzionale) Pipette (sterili a svuotamento totale) da 10 ml ed 1 ml graduate a volume di 0.1 ml (opzionale) Spatole (sterili) 5 TERRENI DI COLTURA E REAGENTI Soluzione salina di Page (opzionale) Cloruro di sodio Solfato di magnesio pentaidrato Cloruro di calcio diidrato Sodio fosfato monoacido Potassio fosfato biacido Acqua ph 6.8 ± 0.2 a 25 C 120 mg 4 mg 4 mg 142 mg 136 mg 1 L Soluzione di Ringer 1/40 (opzionale) Cloruro di sodio Cloruro di potassio Calcio cloruro, anidro Bicarbonato di sodio Acqua 225 mg 11 mg 12 mg 5 mg 1 L Acqua distillata o deionizzata (opzionale) Tampone acido a doppia concentrazione ph 2.2 Miscelare 39 ml di HCl 0.4 mol/l con 250 ml di soluzione di cloruro di potassio 0.4 mol/l. Aggiustare a ph 2.2 ± 0.2 aggiungendo una soluzione di idrossido di potassio (KOH) 1 mol/l. Conservare al buio in un contenitore di vetro chiuso, a temperatura ambiente, per non più di 1 mese. Acido cloridrico 0.4 mol/l Aggiungere ad 1 litro di acqua 34.8 ml di HCl concentrato (peso specifico 1.18, concentrazione minima 34.8%, circa 10 molare). L esatto volume di acido può richiedere degli aggiustamenti secondo il grado di purezza. Cloruro di potassio (0.4 mol/l) Regional Food, Water and Environmental Coordinators Forum Pagina 7 di 17

8 Aggiungere 29.8 g di cloruro di potassio ad 1 L di acqua Agar glicina vancomicina polimixina cicloexamide (GVPC) Carbone attivato Estratto di lievito Idrossido di potassio Tampone ACES (N-2-acetamino-2- aminoetano acido sulfonico) Pirofosfato ferrino L-cisteina cloridrato monoidrato α-chetoglutarato, sale monopotassico Glicina (priva di azoto) Polimixina B solfato Vancomicina idrocloruro Cicloesamide Agar Acqua ph 6.8 ± 0.2 a 25 C 2.0 g 10.0 g 2.8 g 10.0 g 0.25 g 0.4 g 1.0 g 3.0 g UI 1 mg 80 mg 13.0 g 1 L Nota: Può essere utilizzato come alternativa I agar GVPN contenente 50mg/L di natamicina al posto della cicloesamide Agar carbone tamponato estratto di lievito con cisteina (BCYE+, buffered charcoal yeast extract agar with cysteine) Carbone attivato Estratto di lievito Idrossido di potassio Tampone ACES (N-2-acetamino-2-aminoetano acido sulfonico) Pirofosfato ferrico L-cisteina cloridrato monoidrato αchetoglutarato, sale monopotassico Agar Acqua ph 6.8 ± 0.2 a 25 C 2.0 g 10.0 g 2.8 g 10.0 g 0.25 g 0.4 g 1.0 g 13.0 g 1 L Agar carbone tamponato estratto di lievito senza cisterna (BCYE-) Carbone attivato Estratto di lievito Idrossido di potassio Tampone ACES (N-2-acetamino-2-aminoetano acido sulfonico) αchetoglutarato, sale monopotassico Pirofosfato ferrico Agar Acqua ph 6.8 ± 0.2 a 25 C 2.0 g 10.0 g 2.8 g 10.0 g 1.0 g 0.25 g 13.0 g 1 L Soluzione fisiologica con formalina al 2% (opzionale) Tampone fosfato salino (phosphate buffered saline) (PBS) (Opzionale) Regional Food, Water and Environmental Coordinators Forum Pagina 8 di 17

9 Cloruro di sodio Cloruro di potassio Sodio fosfato monoacido Potassio fosfato biacido Acqua ph 7.3 ± 0.2 a 25 C 8.0 g 0.2 g 1.15 g 0.2 g 1 L Reagenti per colorazione per immunofluorescenza (opzionale) Confezioni commerciali per agglutinazione al lattice (opzionale) 6 PROCEDURA SUL CAMPIONE 6.1 PREPARAZIONE DEL CAMPIONE E DILUIZIONI I campioni devono essere trasportati da personale adeguatamente addestrato 16. Aggiungere ai campioni che contengono sostanze biocide un composto inattivante in eccesso (se disponibile). I campioni idrici devono essere ricevuti e manipolati come descritto nel National Standard Method W 1: Sezione I campioni devono essere trasportati a temperatura ambiente (compresa fra 6 e 18 C) e protetti dalla luce solare. Non miscelare campioni ancora caldi con altri freddi per evitare il loro riscaldamento. Registrare se il campione originale conteneva sostanze biocide, ed in questo caso, specificare le caratteristiche del composto neutralizzante utilizzato. Agenti biocidi ossidanti come ipoclorito, derivati del bromo, diossido di ipoclorito, sono facilmente neutralizzati dal tiosolfato di sodio o di potassio. Per la maggior parte delle richieste saranno sufficienti 180 mg di sodio tiosolfato in un litro d acqua per neutralizzare 50 mg di ipoclorito. Registrare inoltre il volume del campione processato ed ogni dettaglio che possa influenzare l isolamento delle legionelle dai campioni (per esempio, la presenza di gocce d olio). I campioni, specialmente quelli noti per contenere sostanze biocide, devono essere analizzati il più presto possibile dopo il loro ricevimento, preferibilmente durante il giorno del campionamento. I campioni devono essere analizzati, se possibile, il più presto possibile nel giorno del loro prelievo. In circostanze eccezionali, se si verifica un ritardo, la conservazione non deve prolungarsi oltre le 24 ore prima dell inizio delle analisi, nelle condizioni precedentemente indicate. I campioni devono essere conservati a temperatura ambiente e protetti dalla luce fino quando sono processati. 6.2 FILTRAZIONE Miscelare il campione e sospendere di nuovo qualsiasi deposito. Filtrare 1 L di acqua con membrane di poliamide, secondo le procedure descritte nel National Standard Method W1 17. Se il campione è torbido o difficile da filtrare, deve essere filtrato più di una volta. Se il campione è particolarmente sporco o oleoso, può essere appropriato centrifugare, come specificato nel National Standard Method W PREPARAZIONE DEL CAMPIONE CONCENTRATO Trasferire con pipetta 10 ml di eluente (soluzione salina di Page o soluzione 1/40 di Ringer) in un sacchetto stomacher di plastica di tipo alimentare. Utilizzando pinze sterili, rimuovere il filtro dal dispositivo filtrante ed inserirlo in un angolo del fondo all interno del sacchetto da stomacher. Sorreggerlo in modo che il liquido eluente e la membrana si posizionino nello stesso angolo e strofinare la membrana fra le dita ed il pollice per almeno 30 secondi 16. Contrassegnare un contenitore sterile disponibile per la centrifugazione con il numero del campione e rimuovere dal sacchetto il maggior volume possibile di eluente. Misurare il volume realmente rimosso con la pipetta e registrare sul contenitore prima di dispensare in esso il diluente. Regional Food, Water and Environmental Coordinators Forum Pagina 9 di 17

10 6.4 CENTRIFUGAZIONE Centrifugare a 3000 x g ± 100 x g per 30 minuti ± 1 minuto, o a 6000 x g ± 100 g per 10 minuti ± 1 minuto. Utilizzare una pipetta graduata sterile, rimuovere con attenzione, in modo asettico, tutto il sopranatante tranne 1 ml. Ad esempio, se sono stati distribuiti 10 ml di eluente nel sacchetto contenente il filtro, 9,8 ml di questi sono stati rimossi con la pipetta e registrati sul contenitore. Dopo la centrifugazione, rimuovere 8.8 ml dal contenitore, pertanto rimane solo 1 ml. Sospendere di nuovo il deposito utilizzando un vortex. Questo materiale rappresenta il concentrato finale. 6.5 PRE-TRATTAMENTO E SEMINA SU PIASTRE DI AGAR SELETTIVO ll concentrato è posto in coltura in tre modi: diretto senza ulteriori trattamenti; dopo pre-trattamento termico; e dopo pre-trattamento acido. Sono di seguito descritti il trattamento e le procedure dell esame colturale. Nota: Nelle ricerche in corso di epidemia il campione originale non concentrato deve esser posto in coltura secondo le stesse procedure. Ciò è riferito in modo particolare a campioni provenienti da torri di raffreddamento e da altre acque non potabili TRATTAMENTO TERMICO Distribuire 0.2 ml del concentrato finale in un contenitore dotato di tappo a vite ed inserire in un bagno ad acqua a 50 ± 1 C per 30 ± 2 minuti. Miscelare in modo opportuno il campione riscaldato, e diffondere 0.1 ml sull intera superficie di un agar GVPC o GVPN utilizzando un diffusore sterile. Se si prevede un ritardo delle semine, per esempio durante la manipolazione di numerosi campioni, raffreddare rapidamente il campione dopo il riscaldamento TRATTAMENTO ACIDO Distribuire 0.2 ml della sospensione di prova in un contenitore dotato di tappo a vite. Aggiungere un uguale volume di tampone acido a ph 2.2 e lasciare agire per 5 minuti ± 30 secondi. Seminare immediatamente dopo 0.2 ml di campione trattato su tutta la superficie di un piastra GVPC o GVPN. Quando deve essere trattato più di un campione, processare in lotti non superiori a 5 aggiungendo tampone acido ad intervalli di 1 minuto NON TRATTATO Preparare diluizioni se richieste. Seminare 0.1 ml di sospensione sulla superficie di piastre GVPC e diffondere l inoculo con un diffusore sterile CONSERVAZIONE CONCENTRATI Conservare in contenitori dotati di tappo a vite a 6 ± 2 C al buio fino a 12 mesi. Nota: Nelle ricerche di epidemie da malattia dei Legionari, la ripetizione della prova sui concentrati conservati può essere importante. 6.6 INCUBAZIONE E LETTURA DELLE PIASTRE DEGLI AGAR SELETTIVI Regional Food, Water and Environmental Coordinators Forum Pagina 10 di 17

11 Lasciare i terreni seminati fino a quando l inoculo è stato completamente assorbito, inserire in camera umida ed incubare a 36 ± 1 C. L incubazione in atmosfera d aria con 2.5% di CO 2 (v/v) può favorire la crescita di alcune specie di Legionella. Incubare la piastre per 10 giorni e durante questo periodo controllare almeno 3 volte ad intervalli di 2 4 giorni. Se sulle piastre si manifesta un rigoglioso sviluppo di colonie diverse dalla Legionella, queste possono inibire lo sviluppo di qualsiasi specie di Legionella presente. Se si osserva un abbondante crescita concomitante dopo 2 4 giorni di incubazione, diluire 100 volte una quota del concentrato conservato e riseminare. 6.7 CONTEGGIO DELLE COLONIE Al termine dell incubazione, esaminare le colonie con microscopio per la lettura delle piastre con luce ad incidenza obliqua. Le colonie delle specie Legionella assumono un tipico aspetto a vetro smerigliato con riflessi perlacei iridescenti. Le colonie caratteristiche sono lisce con bordo continuo e assumono spesso un colore bianco o grigio-blu-porpora, ma possono essere di colore scuro, rosa, verde vischio o rosso scuro. Contare tutte colonie presunte di Legionella su piastre contenenti fino a 150 colonie. La presenza di autofluorescenza può aiutare l identificazione quando un campione contiene alcune specie di Legionella. Pertanto, esaminare le piastre anche con luce ultravioletta (366 nm). Le colonie di Legionella bozemanii, Legionella gormanii, Legionella dumoffii, Legionella anisa, Legionella cherrii, Legionella steigerwaltii, Legionella gratiana, Legionella tucsonensis e Legionella parisiensis assumono fluorescenza bianco brillante, Legionella rubrilucens e Legionella erythra appaiono rosse. Le ultime specie possono mostrare fluorescenza solo quando crescono a temperature più basse o se sono lasciate a temperatura ambiente per 48 ore. La Legionella pneumophila non possiede autofluorescenza ed appare di colore verde opaco o gialla. Per ogni metodo di pre-trattamento calcolare e registrare le colonie sospette di ciascun tipo di crescita, ed assoggettare alle prove di conferma una loro selezione CONFERMA DELLE PRESUNTE SPECIE LEGIONELLA Selezionare tre colonie caratteristiche per Legionella da ciascuna delle piastre di agar GVPC. Eseguire sottocolture da quelle di agar BCYE+ e BCYE-. Inserire in termostato a 36 ± 1 C per almeno 2 giorni. Colonie che crescono sul BCYE+ ma che non si sviluppano sul BCYE-, sono presunte specie Legionella. Calcolare e registrare il conteggio confermato di ciascun tipo di colonia di Legionella. 6.8 IDENTIFICAZIONE E TIPIZZAZIONE Le specie Legionella possono essere identificate con numerosi metodi diversi, inclusa l immunofluorescenza o l agglutinazione col lattice. Per le richieste di routine è sufficiente identificare i ceppi a livello L. pneumophila sierogruppo 1, L. pneumophila sierogruppi 2-14 o specie Legionella diversa da L. pneumophila. In corso di ricerche epidemiologiche, gli isolati devono essere conservati e le sottocolture inviate al laboratorio di riferimento per una completa identificazione e sierotipizzazione. Può essere necessario conservare fino a 30 colonie per piastra IMMUNOFLUORESCENZA Accertarsi che la crescita delle specie Legionella da coltura di 2 4 giorni sia pura, valutando l aspetto della colonia (eseguire sottocoltura su BCYE se necessario). Preparare una sospensione leggermente torbida con 3 colonie di Legionella in 1 o 2 ml di soluzione fisiologica con formalina al 2% (se ciò non è appropriato per il reagente a disposizione, seguire le indicazioni del produttore del metodo). Diluire, se necessario, in tampone fosfato salino. Preparare nello stesso modo una sospensione di controllo positiva utilizzando L. pneumophila NCTC come controllo del Regional Food, Water and Environmental Coordinators Forum Pagina 11 di 17

12 sierogruppo 1, L. pneumophila sierogruppo 6 NCTC come controllo dei sierogruppi 2 14, L. micdadei NCTC come controllo delle specie Legionella, ed un controllo negativo utilizzando la sospensione fornita di controllo negativo. Contrassegnare i vetrini multi-pozzetto di PTFE (poli tetra fluoro etilene) utilizzando un vetrino separato per ciascun controllo e per ciascun ceppo da identificare. Seguire le indicazioni del produttore per la fissazione e la colorazione della sospensione antigene di prova e dei controlli. Allestire i vetrini aggiungendo sufficiente quantità di liquido montante in modo da farlo diffondere sotto un coprioggetto pulito di larghezza sufficiente a ricoprire tutti i pozzetti (di solito 2 3 gocce). Assicurarsi che non sono presenti bolle d aria fra il vetrino ed il coprioggetto. Esaminare i vetrini col microscopio ad epifluorescenza a 50x con obiettivo ad immersione ad acqua. Considerare positive le cellule microbiche che assumono aspetto fluorescente verde brillante con l anticorpo speciespecifico. Se ritenuto appropriato, i ceppi che manifestano reattività crociata possono essere inviati al laboratorio di riferimento dopo accordo con gli specialisti addetti CONFEZIONI PER AGGLUTINAZIONE CON LATTICE Seguire le istruzioni del produttore. 7 CALCOLO DEI RISULTATI Utilizzare la seguente formula per calcolare il numero di unità formanti colonia (ufc) per le specie Legionella per litro presenti nel campione originale non concentrato: Ove: C = n x v x 1 i s C = ufc/litro nel campione originale n = numero di colonie sulla piastra v = volume (ml) del concentrato i = volume (ml) seminato sulla piastra s = volume (litri) di acqua dalla quale la microflora è stata concentrata Le piastre che presentano il maggior numero di colonie confermate devono essere utilizzate per stimare il numero di specie Legionella nel campione originale. Non è ritenuto appropriato calcolare la media dalle tre piastre in quanto ciascuna ha ricevuto un diverso pre-trattamento e, pertanto, esse non rappresentano dei replicati. 7.1 LIMITE DI RILEVAZIONE Nel metodo precedentemente descritto il concentrato finale di 1 litro di campione è 1 ml e 0.1 ml di questo materiale è seminato su terreno selettivo. Se tutte le Legionella presenti nel campione originale fossero state rilevate con questa tecnica, mediamente, il limite di rilevamento dovrebbe essere di 10 ufc/l. Invece, nella pratica, si perdono microrganismi in tutte le fasi della procedura, ad esempio, per eluizione incompleta dalle membrane. Nota: il volume finale messo in coltura su ciascuna piastra è equivalente a solo 100 ml del campione originale. Deve essere possibile contare fino a 150 colonie per ciascuna piastra ed in questo caso, il limite superiore è di 1,5 x 10 3 ufc per litro. Preparando, diluizioni decimali dal concentrato non trattato conservato possono incrementare il valore del limite superiore. 8 REFERTO Refertare i risultati secondo le procedure descritte nella SOP 1 W 1 Sezione Esprimere i risultati Regional Food, Water and Environmental Coordinators Forum Pagina 12 di 17

13 come numero di ufc delle specie Legionella in 1 litro di acqua specificando i limiti numerici del rilevamento, il volume di campione processato, ed il volume equivalente posto in coltura. Se le specie Legionella non sono state rilevate refertarenel modo seguente: Legionella non rilevata (limite di rilevazione = 10 /L) Se le specie Legionella sono state rilevate refertare nel modo seguente: a per litro Ove a è il numero confermato I risultati dovrebbero riportare le specifiche dell identificazione sierologica come L. pneumophila sierogruppo 1, L. pneumophila sierogruppi 2 14, o specie Legionella diverse da L. pneumophila. Qualsiasi interferenza che può aver influenzato il risultato finale, come elevate concentrazioni di pseudomonadi, deve essere inclusa nel giudizio interpretativo del referto. 9 CONTROLLO DI QUALITA 9.1 TERRENO E essenziale che ciascuna beuta di BCYE o GVPC preparata sia considerata come un lotto di terreno separato. Ciascun lotto di terreno deve essere saggiato per verificare la capacità di sviluppo di L. pneumophila e di L. bozemanii e confrontato quantitativamente al precedente lotto di terreno noto per soddisfare la crescita di L. pneumophila e di L. bozemanii. I conteggi da aliquote della stessa sospensione di prova devono cadere all interno dell intervallo di confidenza stabilito a 95% (Tabella 8.1 nella Microbiology of Drinking Water 2002) 19. Poiché alcuni ceppi di pseudomonas sono in grado di inibire la crescita delle legionella su GVPC, deve essere definita la capacità del terreno di impedire la crescita dei microrganismi concomitanti. Ciò può essere ottenuto preparando diluizioni decimali di Pseudomonas aeruginosa NCTC ed inoculando ciascuna di loro sugli agar GVPC e BCYE per ottenere conteggi compresi fra 10 e 50 colonie. Il terreno è considerato idoneo se su GVPC è in grado di ridurre il numero di microrganismi di almeno una concentrazione logaritmica. Queste condizioni di verifica sono richieste solo per terreni prodotti in laboratorio o confezionati commercialmente ove la certificazione delle prestazioni non specifica il grado di inibizione nei confronti delle pseudomonadi. 9.2 MEMBRANA DI FILTRAZIONE Filtrare 1 L di acqua distillata sterile utilizzando lo stesso imbuto usato per il controllo positivo dopo la sua sterilizzazione. 9.3 PROVE DI CONFERMA Controllo positivo: Seminare una piastra di agar GVPC con L. pneumophila sierogruppo 1 NCTC per ottenere una crescita di colonie isolate o con 0.1 ml di un concentrato conservato, precedentemente riscontrato positivo per specie Legionella. Controllo negativo Seminare una piastra di agar GVPC con Pseudomonas aeruginosa NCTC Processare tutti i controlli in parallelo con le prove di routine. Regional Food, Water and Environmental Coordinators Forum Pagina 13 di 17

14 10 STRUTTURE DI RIFERIMENTO In alcune circostanze, come durante un epidemia, gli isolati possono essere inviati alla Health Protection Agency Atypical Pneumonia Unit per la completa identificazione sierologica e sottotipizzazione della L. pneumophila sierogruppo 1, dopo colloquio con gli esperti, se ciò è considerato appropriato. 11 RINGRAZIAMENTI E CONTATTI Questi Standard Method sono stati iniziati e sviluppati, riveduti e revisionati dal Water Working Group for Standard Method ( Si ringraziano le numerose persone appartenenti a laboratori clinici di microbiologia ed alle organizzazioni specialistiche che hanno fornito informazioni e commenti nel corso della preparazione di questo documento, ed il Redattore Medico per la revisione finale. I Metodi Nazionali Standard sono emessi dalla Standards Unit, Evaluations and Standards Laboratory, Centre for Infections, Health Protection Agency London. Per ulteriori informazioni contattare: Standards Unit Evaluations and Standards Laboratory Centre for Infections Health Protection Agency Colindale, London NW9 5EQ standards@hpa.org.uk Regional Food, Water and Environmental Coordinators Forum Pagina 14 di 17

15 ALLEGATO: DIAGRAMMA DI FLUSSO CHE ILLUSTRA LA PROCEDURA PER RICERCA E CONTEGGIO DI SPECIE LEGIONELLA CON FILTRAZIONE E CENTRIFUGAZIONE Trasportare in laboratorio in contenitore idoneo a temperatura ambiente senza esporre alla luce solare diretta Conservare al buio ed analizzare entro 24 ore Miscelare in modo adeguato (NB in corso di ricerche per epidemia conservare alcuni campioni non concentrati per la coltura Filtrare Inserire il filtro in un sacchetto per stomacher e sospendere in 10 ml di eluente Rimuovere il liquido e centrifugare Rimuovere il sopranatante e lasciare 1 ml di sospensione Dividere in 3 aliquote: - non trattata, trattata al calore, trattata con acido Pretrattare in modo apprpriato e seminare in piastra da 0.1 a 0.2 ml (in funzione del trattamento) su piastra di agar GVPC Incubare a 36 C ed aumentare l'umidità (preferibilmente con CO 2 ) per 2-10 giorni Eseguire sottocolture su BCYE+ agar e BCYE- per le prove di conferma Calcolare i conteggi di Legionella confermati Inviare al laboratorio di riferimento per le prove sierologiche e l'identificazione delle specie, se ritenuto necessario Regional Food, Water and Environmental Coordinators Forum Pagina 15 di 17 Questa POS deve essere usata congiuntamente con le altrepos emesse dalla Health Protection

16 BIBLIOGRAFIA 1. Department of Health NHS Executive: The Caldicott Committee. Report on the review of patientidentifiable information. London. December Lee JV, West AA. Survival and growth of Legionella species in the environment. J Appl Bacteriol Symp Sup 1991;70:121S-9S. 3. HSC Approved Code of Practice & Guidance L8 Legionnaires' disease : The control of legionella bacteria in water systems. 3rd ed. Norwich: HMSO; BS 6068-ISO Water quality - Part 4: Microbiological methods - Section 4.12:1998 Detection and enumeration of Legionella. London: British Standards Institution; Donovan TJ, Manger PA. Isolating legionellae from 1 litre of water - A modified filtration method. PHLS Microbiol Dig 1989;6: Advisory Committee on Dangerous Pathogens 2004 Approved List of Biological Agents. p Public Health Laboratory Service Standing Advisory Committee on Laboratory Safety. Safety Precautions: Notes for Guidance. 4 th ed. London: Public Health Laboratory Service (PHLS); Control of Substances Hazardous to Health Regulations General COSHH. Approved Code of Practice and Guidance, L5. Suffolk: HSE Books; Health and Safety Executive. 5 steps to risk assessment: a step by step guide to a safer and healthier workplace, IND (G) 163 (REVL). Suffolk: HSE Books; Health and Safety Executive. A guide to risk assessment requirements: common provisions in health and safety law, IND (G) 218 (L). Suffolk: HSE Books; NHS Estates. Health Building Note 15. Accommodation for pathology services. 1 st ed. London: Her Majesty's Stationary Office (HMSO); (Out of print - 2nd edition in press). 12. BS EN 12469: Biotechnology - performance criteria for microbiological safety cabinets. London: British Standards Institution (BSI); BS 5726: Microbiological safety cabinets. Part 2. Recommendations for information to be exchanged between purchaser, vendor and installer and recommendations for installation. London: British Standards Institution (BSI); BS 5726: Microbiological safety cabinets. Part 4. Recommendations for selection, use and maintenance. London: British Standards Institution (BSI); Advisory Committee on Dangerous Pathogens. The management, design and operation of microbiological containment laboratories. Suffolk: HSE Books; British Standard BS 7592:1992. Methods for sampling for Legionella organisms in water and related materials Health Protection Agency. National Standard Method: General technique for the detection of bacteria by membrane filtration W1. London: Health Protection Agency; Health Protection Agency. National Standard Method: Detection and enumeration of Legionella species by centrifugation W13. London: Health Protection Agency; Regional Food, Water and Environmental Coordinators Forum Pagina 16 di 17 Questa POS deve essere usata congiuntamente con le altrepos emesse dalla Health Protection

17 19. Standing Committee of Analysts. The Microbiology of Drinking Water (2002) - Part 1 - Water Quality and Public Health. Methods for the examination of waters and associated materials. Environment Agency. Regional Food, Water and Environmental Coordinators Forum Pagina 17 di 17 Questa POS deve essere usata congiuntamente con le altrepos emesse dalla Health Protection