IDENTIFICAZIONE DI SPECIE ACTINOMYCES ANAEROBIE

Transcript

1 q METODO NAZIONALE STANDARD IDENTIFICAZIONE DI SPECIE ACTINOMYCES ANAEROBIE BSOP ID 15 Emesso da Standards Unit, Department for Evaluations, Standards and Training Centre for Infections Revisione no: 1 Data di revisione: Emesso da: Standards Unit, Department for Evaluations, Standards and Training Pagina 1 di 13. BSOP ID 15i1. Questo MNS deve essere usato congiuntamente con gli altri MNS emessi dalla Health Protection Agency

2 STATO DEI METODI NAZIONALI STANDARD I Metodi Nazionali Standard, che includono le procedure operative standard (POS), algoritmi e linee guida, promuovono l adozione di elevati livelli di qualità, contribuendo ad assicurare la possibilità di confronto delle informazioni diagnostiche ottenute in laboratori diversi. Ciò consente la standardizzazione della sorveglianza sostenuta dalla ricerca, sviluppo e verifica, promovendo nello stesso tempo la salute pubblica e la fiducia del paziente nelle proprie strutture sanitarie. I metodi sono ben referenziati e rappresentano un buon standard minimo per la microbiologia clinica e per la salute pubblica. Comunque, utilizzando i Metodi Nazionali Standard, i laboratori dovranno tenere in considerazione le esigenze locali e potranno intraprendere ricerche addizionali. I metodi forniscono inoltre un punto di riferimento per un loro ulteriore sviluppo. I Metodi Nazionali Standard sono stati sviluppati, revisionati ed aggiornati con una procedura aperta di consenso ove le opinioni di tutti i partecipanti sono state tenute in adeguata considerazione ed i documenti elaborati riflettono il consenso della maggior parte degli stessi. I rappresentanti di alcune organizzazioni professionali, incluse quelle il cui logo appare sulla prima pagina, sono membri dei gruppi di lavoro che sviluppano i Metodi Nazionali Standard. L inclusione del logo di una organizzazione nella prima pagina implica sostegno agli obiettivi ed al processo di preparazione dei metodi standard. I componenti di queste organizzazioni scientifiche hanno partecipato allo sviluppo dei Metodi Nazionali Standard ma le loro opinioni personali non rispecchiano necessariamente quelle dell organizzazione di cui sono membri. L elenco attuale delle organizzazioni professionali partecipanti può essere ottenuto tramite all indirizzo standards@hpa.org.uk. Le prestazioni dei metodi standard sono condizionate dalla qualità di reagenti, strumentazione, procedure commerciali o prove messe a punto in loco. I laboratori dovrebbero assicurare che queste siano state validate e dimostrate idonee allo scopo prefissato. Devono essere adottate procedure di controllo di qualità interno ed esterno. Nonostante siano state osservate le più scrupolose attenzioni nella preparazione di questa pubblicazione, la Health Protection Agency o qualsiasi organizzazione di sostegno non può essere ritenuta responsabile dell accuratezza o dell utilizzo o di qualsiasi conseguenza derivante dall uso o da modifiche delle informazioni contenute in questo documento. Queste procedure sono intese solamente come una risorsa generale per i professionisti che esercitano in questo settore, operanti nel Regno Unito, pertanto si dovrà ricorrere ad altri consulenti quando ritenuto necessario. Se si apportano modifiche a questa pubblicazione, si deve porre in evidenza dove sono state apportate modifiche al documento originale. La Health Protection Agency (HPA) dovrà essere informata in ogni circostanza. La HPA è una organizzazione indipendente che ha lo scopo di proteggere la salute della popolazione. Ad essa confluiscono esperienze professionali già appartenenti ad organizzazioni ufficiali. Maggiori informazioni riferibili alla HPA possono essere ottenute al sito La HPA è un organizzazione che mira ad essere completamente in accordo con le direttive Caldicott. Ciò significa prendere ogni possibile precauzione per prevenire la diffusione non autorizzata di informazioni sui pazienti e di garantire che le informazioni relative agli stessi siano mantenute in condizioni di sicurezza 1. Maggiori dettagli possono essere ottenuti dal sito web. Contributi allo sviluppo dei documenti possono essere forniti contattando l indirizzo standards@hpa.org.uk. Si informa il lettore che la tassonomia completa di questo documento è aggiornata al momento della pubblicazione. Per cortesia prendere nota che la bibliografia è attualmente formattata con il software Reference Manager. Se si modifica o si cancella il testo senza avere installato nel computer il Reference Manager; la bibliografia non sarà aggiornata automaticamente. Riferimento suggerito per questo documento: Health Protection Agency (2009). Identification of Actinomyces species National Standard Method BSOP ID 15 Emissione 1. Revisione no: 1 Data di revisione: Emesso da: Standards Unit, Department for Evaluations, Standards and Training Pagina 2 di 13. BSOP ID 15i1. Questo MNS deve essere usato congiuntamente con gli altri MNS emessi dalla Health Protection Agency

3 INDICE INDICE... 3 PROCEDURA DI MODIFICA SCOPO DEL DOCUMENTO.. 5 INTRODUZIONE... 5 TASSONOMIA... 5 CARATTERISTICHE... 5 PRINCIPI DI IDENTIFICAZIONE... 6 INFORMAZIONE TECNICA/LIMITI CONSIDERAZIONI SULLA SICUREZZA MICRORGANISMI BERSAGLIO SPECIE ACTINOMYCES SEGNALATE COME AGENTI INFETTIVI PER L UOMO 7 3 IDENTIFICAZIONE ASPETTO MICROSCOPICO TERRENI DI ISOLAMENTO PRIMARIO ASPETTO DELLE COLONIE PROCEDURE DI PROVA CONFERMA CONSERVAZIONE ED INVIO. 9 4 DIAGRAMMA DI FLUSSO PER IDENTIFICAZIONE RISULTATI E REFERTAZIONE IDENTIFICAZIONE PRESUNTIVA CONFERMA IDENTIFICAZIONE MEDICO MICROBIOLOGO CCDC CENTRO PER INFEZIONI GRUPPO CONTROLLO INFEZIONE RIFERIMENTI LABORATORIO DI RIFERIMENTO 10 7 RINGRAZIAMENTI E CONTATTI BIBLIOGRAFIA Revisione no: 1 Data di revisione: Emesso da: Standards Unit, Department for Evaluations, Standards and Training Pagina 3 di 13

4 PROCEDURA DI MODIFICA Documento di riferimento controllato Titolo del documento controllato BSOP ID 15 Identificazione di specie anaerobie di Actinomyces Ciascun documento controllato possiede una registrazione separata con le correzioni specificate in modo dettagliato in questa Procedura di Modifica. Le precedenti modifiche sono disponibili presso la Sull emissione di pagine nuove o rivedute ciascun documento controllato deve essere aggiornato dal proprietario del Laboratorio. Modifica Numero/ Data Emissione no. Scartata Inserita Emissione no. Pagina Sessione(i) interessate Modifica Revisione no: 1 Data di revisione: Emesso da: Standards Unit, Department for Evaluations, Standards and Training Pagina 4 di 13

5 IDENTIFICAZIONE DI SPECIE ANAEROBIE DI ACTINOMYCES SCOPO DEL DOCUMENTO Questo Metodo Nazionale Standard (MNS) descrive l identificazione di specie Actinomyces anaerobie. Le colonie possono essere isolate su agar sangue o terreni contenenti uovo. Per gli Actinomycetes aerobi consultare BSOPID 10 Identification of aerobic Actinomycetes species. INTRODUZIONE Tassonomia La definizione del gruppo comprendente le specie Actinomyces è complessa. Differenze morfologiche consistenti non si osservano solo all interno dei generi, ma anche fra ceppi con la stessa tassonomia 2,3. Caratteristiche 4 Le specie Actinomyces richiedono terreni di coltura arricchiti (quali terreni con infuso di cuore cervello) e lo sviluppo è favorito da un atmosfera con aggiunta di 6-10% di anidride carbonica. La temperatura ottimale di crescita è di 37 C. Le colonie si sviluppano dopo 3 7 giorni ma il loro rilievo può richiedere giorni d incubazione. Le colonie sull agar sono descritte spesso somiglianti ad un dente molare e nei terreni liquidi si formano colonie in sospensione simili a mollica di pane. Si presentano come bacili Gram positivi. Alla colorazione Gram le specie Nocardia non sono morfologicamente distinguibili dagli Actinomyces ed pure le loro manifestazioni cliniche causano infezioni polmonari croniche e del SNC. Le specie Nocardia sono aerobiche ed alcuni ceppi sono parzialmente acido resistenti. Le specie Actinomyces sono spesso isolate dai campioni clinici in coltura mista associate a Actinobacillus actinomycetemcomitans, Eikenella corrodens e specie Fusobacterium, Bacteroides, Capnocytophaga, Staphylococcus, Streptococcus and Enterococcus. Le specie patogene di Actinomyces non esistono libere in natura (ad esempio, nel suolo), ma sono di solito commensali in corso di infezioni miste in sede orale o cervico-facciale, toracica, pelvica ed addominale. Alcune specie (A. viscosus ed A. naeslundii) sono coinvolte nella patologia periodontale e nella carie dentale. Non si realizza la trasmissione interumana. Propionibacterium propionicum può produrre una malattia simile all actinomicosi. Le specie Actinobaculum, Arcanobacterium e Varibaculum cambriense sono strettamente correlate alle specie Actinomyces e possono essere coinvolte nelle infezioni umane. Actinomyces israelii Le cellule appaiono sottili, filamentose, si ramificano in bastoncini granulati. Le colonie sono bianche, simili ad un molare o a mollica di pane, penetranti/aderenti all agar, possono essere di aspetto molto granulare. La loro crescita è lenta. Crescono con difficoltà e non tutti in presenza di aria e CO 2. Sono di solito isolati in corso actionomicosi specifica, canaliculite, da dispositivi anticoncezionali e da altre formazioni ascessuali dei tessuti molli e da infezioni a sede ossea. Actinomyces gerencseriae In precedenza A. israelii serotipo II. Cellule, colonie, crescita e sedi d isolamento sono simili a quelle di A. israelii, ma le colonie sono spiccatamente bianche e meno granulari. Actinomyces meyeri Le cellule presentano forma di piccoli microrganismi difteroidi. Le colonie hanno dimensione <1 mm, colore bianco, convesse. lisce con margine continuo. Non si sviluppano in aria o aria e CO 2. Sono isolate dal liquido pleurico, ascesso cerebrale e da altri ascessi dei tessuti molli. Actinomyces georgiae Revisione no: 1 Data di revisione: Emesso da: Standards Unit, Department for Evaluations, Standards and Training Pagina 5 di 13

6 Simile all Actinomyces odontolyticus, non pigmentato (bianco). Cresce con difficoltà o non si sviluppa in aria e CO 2. Fa parte della flora orale. Non è isolato frequentemente dai campioni clinici. Actinomyces turicensis Cellule di piccole dimensioni, cocco-bacilari. Colonie di dimensione <1 mm grigie/translucide, rilucenti/lisce,. Si sviluppano in aria e CO 2,, in modo scarso o per nulla in aria. Actinomyces radingae Le cellule crescono in modo simile ad A. turicensis. Principi di identificazione Isolamento anaerobio delle colonie su agar sangue con successive identificazione biochimica usando le più recenti tabelle tassonomiche 5 ed i metodi molecolari. INFORMAZIONE TECNICA/LIMITI Le confezioni commerciali, anche se forniscono l informazione biochimica di base, non sono in grado di definire un identificazione accurata perché i risultati ottenuti con questi patogeni sono riferiti ad archivi non aggiornati 6,7. Ciò è particolarmente vero perché le tecniche molecolari consentono d identificare un numero di specie maggiore rispetto a quanto possibile in precedenza. Revisione no: 1 Data di revisione: Emesso da: Standards Unit, Department for Evaluations, Standards and Training Pagina 6 di 13

7 1 CONSIDERAZIONI SULLLA SICUREZZA 8-20 Fare riferimento alle linee guida attuali per la sicurezza durante la manipolazione di tutti i microrganismi presentati in questo MNS. Le manipolazioni di laboratorio che si ritiene possano generare aerosol infettivi devono essere eseguite in cabina microbiologica di sicurezza. Le linee guida precedentemente esplicitate devono essere implementate con il COSHH locale e con la valutazione del rischio. E essenziale l adeguamento alle regolamentazioni della posta e del trasporto. 2 MICRORGANISMI BERSAGLIO 2.1 SPECIE ACTINOMYCES SEGALATE COME AGENTI INFETTIVI PER L UOMO 21,22 Actinomyces israelii (anaerobio facoltativo) Actinomyces naeslundii Actinomyces funkei Actinomyces europaeus Actinomyces graevenitizii Actinomyces urogenitalis Actinomyces odontolyticus Actinomyces viscosus Actinomyces meyeri (rarely isolated) Actinomyces gerencseriae Actinomyces neuii (in precedenza CDC corineiforme gruppo 1) Actinomyces radingae (in precedenza CDC corineiforme gruppo E) Actinomyces turicensis (in precedenza CDC corineiforme gruppo E) Altre specie possono essere associate alla patologia umana 21,23 Actinomyces radicidentis Actinomyces cardiffensis Actinomyces oricola Actinomyces nasicola 3 IDENTIFICAZIONE 3.1 ASPETTO MICROSCOPICO Colorazione Gram (BSOP TP 39 - Staining Procedures) Forme ramificate e granulate, filamentose o di aspetto difteroide o coccobacillare o bacilli Gram positivi. N.B. Le specie Propionibacterium sono pleiomorfe di tipo bacillare che possono apparire ramificate T ERRENI DI PRIMO ISOLAMENTO 1) Agar per anaerobi esigenti o equivalenti senza neomicina - molte specie Actinomyces possono essere inibite dalla neomicina. Incubazione anaerobica a C per 5-10 giorni. 2) Agar selettivo per Actinomyces con metronidazolo10 mg/l ed acido nalidixico 30 mg/l. Incubazione anaerobica a C per 5-10 giorni. Crescita variabile in aria e 5-10% CO 2. Arricchimento in brodo raramente utile. N.B: Alcune specie possono richiedere Incubazione prolungata. Revisione no: 1 Data di revisione: Emesso da: Standards Unit, Department for Evaluations, Standards and Training Pagina 7 di 13

8 3.3 Aspetto della colonia 4 Specie Colonie Commenti A. israelii Da bianche a crema, mollica di pane o dente molare, granulari, bucherellate colore rosa A. gerensceriae Bianche brillanti, mollica di pane o dente molare, granulari bucherellate e più soffici di A. israelii A. naeslundii Bianche, crema, rosate, lisce, A. odontolyticus Da crema a rossa, lisce, A. meyeri Piccole, bianche, lisce, A. deticolens simile Da bianche a rosa, ammassate o a dente molare, bucherellate A. georgiae Bianche o crema, lisce, A. neuii sub sp. neuii ed Bianche o crema, lisce, anitratius A. radingae Da grigie a bianche, semi traslucide, lisce, lievemente A. turicensis Grigie, semi traslucide, lisce, margine continuo A. europaeus Biancastre, semi traslucide, lievemente convesse, margine continuo A. graevenitzii Bianche di aspetto simile a dente molare o lisce, convessa A. radicidentis Da crema a rosa, lisce, A. urogenitalis Da crema a rosa, margini scuri, lisce A. funkei Grigie, semi-traslucide, centro opaco semi-translucide, centro opaco (uovo fritto), lievemente A. cardiffensis Da crema a rosa, lisce, A. nasicola Bianche o grigie, lisce, A. oricola Bianche, mollica di pane, bucherellate P. propionicum Da bianche a color camoscio, mollica di pane, bucherellate o lisce, convesse, margine continuo Crescita lenta Colonie vecchie assumono Crescita lenta Occasionalmente colonie rugosa Colonie vecchie assumono colore marrone scuro Crescita lenta Rosso fluorescente. Sono presenti contemporaneamente forme rugose e lisce. Le colonie vecchie possono assumere colore marrone scuro Le colonie vecchie possono diventare rosse Le colonie vecchie possono diventare rosse Fluorescenza rossa. Sono presenti contemporaneamente forme rugose e lisce Revisione no: 1 Data di revisione: Emesso da: Standards Unit, Department for Evaluations, Standards and Training Pagina 8 di 13

9 3.4 PROCEDURE DI PROVA PROVE PRELIMINARI Le specie Actinomyces sono costituzionalmente resistenti al metronidazolo ed indolo negative. N.B. Propionibacterium acnes (commensale cutaneo comune) è indolo positivo. Le colonie di A. graevenitzii e di Propionibacterium propionicum cresciute su terreni contenenti sangue emanano luce fluorescente rossa se illuminati con raggi ultravioletti (366 nm). Confezione d identificazione commerciale I risultati devono essere interpretati con cautela e valutati congiuntamente alle altre prove. Per ottenere risultati accurati con le prove biochimiche si consiglia di usare chiavi tassonomiche e di non affidarsi all identificazione derivante dal codice numerico. 3.5 CONFERMA ANALISI DI RESTRIZIONE SU RDNA AMPLIFICATO 24 PCR 16S rdna e sequenziamento Altre prove più specialistiche: Gas cromatografia liquida 3.6 CONSERVAZIONE ED INVIO Se appropriato, conservare l isolato puro su becco di clarino di agar sangue incubato, in brodocoltura in anaerobiosi o/e inviato con tampone di trasporto al Laboratorio di Riferimento. 4 DIAGRAMMA DI FLUSSO PER IDENTIFICAZIONE N/D Revisione no: 1 Data di revisione: Emesso da: Standards Unit, Department for Evaluations, Standards and Training Pagina 9 di 13

10 5 RESULTATI E REFERTAZIONE 5.1 IDENTIFICAZIONE PRESUNTIVA Se si manifestano appropriate caratteristiche di crescita, della colorazione Gram della coltura e l isolato non è sensibile al metronidazolo. 5.2 CONFERMA IDENTIFICAZIONE Risultati ottenuti con confezione commerciale e/o Referto del Laboratorio di Riferimento. 5.3 MEDICO MICROBIOLOGO Informare il medico microbiologo dell identificazione presunta o confermata di anaerobi quando il modulo di richiesta segnala informazioni importanti 5.4 CCDC Fare riferimento al Memorandum locale d Informazione 5.5 CENTRO PER INFEZIONI Fare riferimento alle linee guida attuali del CDSC ed alle informazioni del COSURV. 5.6 GRUPPO CONTROLLO INFEZIONE N/D 6 RIFERIMENTI 6.1 LABORATORIO DI RIFERIMENTO Anaerobe Reference Unit NPHS Microbiology Cardiff University Hospital of Wales Heath Park Cardiff CF14 4XW Telefono +44 (0) or Revisione no: 1 Data di revisione: Emesso da: Standards Unit, Department for Evaluations, Standards and Training Pagina 10 di 13

11 7 RINGRAZIAMENTI E CONTATTI I Metodi Nazionali Standard sono stati sviluppati, revisionati e controllati dal National Standard Methods Working Group for Clinical Bacteriology ( bacteriology.asp). Si ringraziano per il contributo le numerose persone appartenenti a laboratori clinici di microbiologia ed alle organizzazioni specialistiche che hanno fornito informazioni e commenti nel corso della preparazione di questo documento, ed infine il Redattore Medico. I Metodi Nazionali Standard sono emessi dalla Standards Unit, Department for Evaluations, Standards and Training, Centre for Infections, Health Protection Agency London. Per ulteriori informazioni contattateci a: Standards Unit Department for Evaluations, Standards and Training Centre for Infections Health Protection Agency Colindale, London NW9 5EQ standards@hpa.org.uk Revisione no: 1 Data di revisione: Emesso da: Standards Unit, Department for Evaluations, Standards and Training Pagina 11 di 13

12 BIBLIOGRAFIA 1. Department of Health NHS Executive and The Caldicott Committee. Report on the Review of Patient-Identifiable Information. Department of Health. London Jousimies-Somer H, Summanen P. Recent taxonomic changes and terminology update of clinically significant anaerobic gram-negative bacteria (excluding spirochetes). Clin Infect Dis 2002;35:S17-S Jousimies-Somer H. Recently described clinically important anaerobic bacteria: taxonomic aspects and update. Clin Infect Dis 1997;25 Suppl 2:S78-S Hall V. Anaerobic Actinomycetes and Related Organisms. In: Hawkey PM, Gillespie SH, editors. Principles and Practice of Clinical Bacteriology. 2 ed. John Wiley and Sons; p Sarkonen N, Kononen E, Summanen P, Kononen M, Jousimies-Somer H. Phenotypic identification of Actinomyces and related species isolated from human sources. J Clin Microbiol 2001;39: Kerttula AM, Carlson P, Sarkonen N, Hall V, Kononen E. Enzymatic/biochemical analysis of Actinomyces with commercial test kits with an emphasis on newly described species. Anaerobe 2005;11: Santala AM, Sarkonen N, Hall V, Carlson P, Jousimies-Somer H, Kononen E. Evaluation of four commercial test systems for identification of actinomyces and some closely related species. J Clin Microbiol 2004;24: Advisory Committee on Dangerous Pathogens. The Approved List of Biological Agents. Her Majesty's Stationery Office. Norwich p Health and Safety executive, editor. Biological agents: Managing the risks in laboratories and healthcare premises 5A.D Public Health Laboratory Service Standing Advisory Committee on Laboratory Safety. Safety Precautions: Notes for Guidance. Public Health Laboratory Services (PHLS). London HSE L5 Control of Substances Hazardous to Health Regulations. Approved Code of Practice and Guidance. 5th ed. HSE Books; Health and Safety Executive. 5 Steps to Risk Assessment: A Step by Step Guide to a Safer and Healthier Workplace. HSE Books Health and Safety Executive. A guide to risk assessment requirements: common provisions in health and safety law. HSE Books. Suffolk HSE.Health Services Advisory Committee. Safety in Health Service Laboratories. Safe working and the prevention of infection in clinical laboratories and similar facilities. 2. HSE Books Health Building Note 15. Accommodation for pathology services. 1st ed. London: Her Majesty's Stationary Office (HMSO); Hopes R. Solid phase immune electron microscopy for the detection of parvovirus B19. BSc Project, Data di Revisione: Emesso da: Standards Unit, Department for Evaluations, Standards and Training Pagina 12 di 13 BSOP ID 15i1

13 17. British Standards Institution (BSI). Microbiological safety cabinets. Part 2: Recommendations for information to be exchanged between purchaser, vendor and installer and recommendations for installation. BS 5726:2005. British Standards Institution (BSI). London British Standards Institution (BSI). Microbiological safety cabinets. Part 4: Recommendations for selection, use and maintenance. BS London Advisory Committee on Dangerous Pathogens. The management, design and operation of microbiological containment laboratories. HSE Books Health Protection Agency. Laboratory Reporting to the Health Protection Agency: Guide for Diagnostic Laboratories Hall V. Actinomyces-gathering evidence of human colonization and infection. Anaerobe 2008;14: Schaal KP, Lee HJ. Actinomycete infections in humans-a review. Gene 1992;115: Sabbe LJ, Van De MD, Schouls L, Bergmans A, Vaneechoutte M, Vandamme P. Clinical spectrum of infections due to the newly described Actinomyces Species A. Turicensis, A. radingae, and A. europaeus. J Clin Microbiol 1999;37: Hall V, O'Neill WA, Magee JT, Duerden B. Development of amplified 16S ribosomal DNA restriction analysis for identification of Actinomyces species and comparison with pyrolysis mass spectrometry and conventional biochemical tests. J Clin Microbiol 1999;37: Data di Revisione: Emesso da: Standards Unit, Department for Evaluations, Standards and Training Pagina 13 di 13 BSOP ID 15i1