CONTEGGIO DI ESCHERICHIA COLI IN MOLLUSCHI CRUDI CON TECNICA DELLE PROVETTE MULTIPLE

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1 METODO NAZIONALE STANDARD CONTEGGIO DI ESCHERICHIA COLI IN MOLLUSCHI CRUDI CON TECNICA DELLE PROVETTE MULTIPLE F 16 Emesso da Standards Unit, Evaluations and Standards Laboratory Specialist and Reference Microbiology Division W & E Co-ordinators Forum and the Environmental Surveillance Unit, CDSC. Pagina 1 di 20

2 STATO DEI METODI NAZIONALI STANDARD I Metodi Nazionali Standard, che includono le procedure operative standard (POS) algoritmi e linee guida, promuovono l adozione di elevati livelli di qualità, contribuendo ad assicurare la possibilità di confronto delle informazioni diagnostiche ottenute in laboratori diversi. Ciò consente la standardizzazione della sorveglianza sostenuta dalla ricerca, sviluppo e verifica, promovendo nello stesso tempo la salute pubblica e la fiducia del paziente nelle proprie strutture sanitarie. I metodi sono ben referenziati e rappresentano un buon standard minimo per la microbiologia clinica e per la salute pubblica. Comunque, utilizzando i Metodi Nazionali Standard, i laboratori dovranno tenere in considerazione le esigenze locali e potranno intraprendere ricerche addizionali. I metodi forniscono inoltre un punto di riferimento per un loro ulteriore sviluppo. I Metodi Nazionali Standard sono stati sviluppati, revisionati ed aggiornati con una procedura aperta di consenso ove le opinioni di tutti i partecipanti sono state tenute in adeguata considerazione ed i documenti elaborati riflettono il consenso della maggior parte degli stessi. I rappresentanti di alcune organizzazioni professionali, incluse quelle il cui logo appare sulla prima pagina, sono membri dei gruppi di lavoro che sviluppano i Metodi Nazionali Standard. L inclusione del logo di una organizzazione nella prima pagina implica sostegno agli obiettivi ed al processo di preparazione dei metodi standard. I componenti di queste organizzazioni scientifiche hanno partecipato allo sviluppo dei Metodi Nazionali Standard ma le loro opinioni personali non rispecchiano necessariamente quelle dell organizzazione di cui sono membri. L elenco attuale delle organizzazioni professionali partecipanti può essere ottenuto tramite all indirizzo standards@hpa.org.uk. Le prestazioni dei metodi standard sono condizionate dalla qualità di reagenti, strumentazione, procedure commerciali o prove messe a punto in loco. I laboratori dovrebbero assicurare che queste siano state validate e dimostrate idonee allo scopo prefissato. Devono essere adottate procedure di controllo di qualità interno ed esterno. Nonostante siano state osservate le più scrupolose attenzioni nella preparazione di questa pubblicazione, la Health Protection Agency o qualsiasi organizzazione di sostegno non può essere ritenuta responsabile dell accuratezza o dell utilizzo o di qualsiasi conseguenza derivante dall uso o da modifiche delle informazioni contenute in questo documento. Queste procedure sono intese solamente come una risorsa generale per i professionisti che esercitano in questo settore, operanti nel Regno Unito, pertanto si dovrà ricorrere ad altri consulenti quando ritenuto necessario. Se si apportano modifiche a questa pubblicazione, si deve porre in evidenza dove sono state apportate modifiche al documento originale. La Health Protection Agency (HPA) dovrà essere informata in ogni circostanza. La HPA è una organizzazione indipendente che ha lo scopo di proteggere la salute della popolazione. Ad essa confluiscono esperienze professionali già appartenenti ad organizzazioni ufficiali. Maggiori informazioni riferibili alla HPA possono essere ottenute al sito La HPA è un organizzazione che mira ad essere completamente in accordo con le direttive Caldicott. Ciò significa prendere ogni possibile precauzione per prevenire la diffusione non autorizzata di informazioni sui pazienti e di garantire che le informazioni relative agli stessi siano mantenute in condizioni di sicurezza 1. Maggiori dettagli possono essere ottenuti dal sito web. Contributi allo sviluppo dei documenti possono essere forniti contattando l indirizzo standards@hpa.org.uk. Per cortesia prendere nota che la bibliografia è attualmente formattata con il software Reference Manager. Se si modifica o si cancella il testo senza avere installato nel computer il Reference Manager, la bibliografia non sarà aggiornata automaticamente. Riferimento suggerito per questo documento: Health Protection Agency (2004). Enumeration of Escherichia coli in raw molluscs by the multiple tube technique. Metodo Nazionale Standard F 16 Emissione 4. W & E Co-ordinators Forum and the Environmental Surveillance Unit, CDSC. Pagina 2 di 20

3 INDICE STATO DEI METODI NAZIONALI STANDARD INDICE PROCEDURA DI MODIFICA INTRODUZIONE.. 5 SCOPO.. 5 INFORMAZIONE DI BASE PRINCIPIO DEFINIZIONI CONSIDERAZIONI SULLA SICUREZZA ATTREZZATURA TERRENI DI COLTURA PROCEDIMENTO CONSERVAZIONE DEL CAMPIONE PREPARAZIONE DEL CAMPIONE PREPARAZIONE DELL OMOGENEIZZATO PREPARAZIONE DELLE DILUIZIONI SEMINA ED INCUBAZIONE RICONOSCIMENTO E CONTEGGIO CONFERMA DI E. COLI COLTURE DI CONTROLLO CALCOLO DEI RISULTA TI REFERTAZIONE DEI RISULTATI. 11 ALLEGATO 1: DIAAGRAMMA DI FLUSSO CHE ILLUSTRA LA PROCEDURA PER IL CONTEGGIO DI E. COLI NEI MOLLUSCHI CRUDI CON LA TECNICA DELLE PROVETTE MULTIPLE.. 12 ALLEGATO 2: TABELLA CHE ILLUSTRA I NUMERI PROBABILI DI MICRORGANISMI (ADATTATA DA TILLETT ) BIBLIOGRAFIA W & E Co-ordinators Forum and the Environmental Surveillance Unit, CDSC. Pagina 3 di 20

4 PROCEDURA DI MODIFICA Documento di riferimento controllato Titolo del documento controllato F 16 Procedura Operativa Standard per il Conteggio di Escherichia coli in molluschi crudi con tecnica di provette multiple Ciascun Metodo Nazionale Standard possiede una registrazione separata con le modifiche. Le modifiche di questa revisione sono riportate in questa pagina. Le precedenti modifiche sono disponibili presso la standards@hpa.org.uk. Qualora vi sia una revisione di pagine o vengano emesse pagine nuove il proprietario di ciascun documento controllato dovrebbe aggiornare la copia in laboratorio Modifica Numero/ Data Emissione no. Scartata Inserita Emissione no. Pagina Sessione(i) interessate Modifica 5/ Prima pagina Stato del Documento Ridisegnata Revisionato 4 Pagina della procedura di modifica Ridisegnata W & E Co-ordinators Forum and the Environmental Surveillance Unit, CDSC. Pagina 4 di 20

5 PROCEDURA OPERATIVA STANDARD PER IL CONTEGGIO DI ESCHERICHIA COLI IN MOLLUSCHI CRUDI CON LA TECNICA A PROVETTE MULTIPLE INTRODUZIONE Scopo Il presente metodo per il conteggio di Escherichia coli nei molluschi bivalvi e nei gasteropodi può essere utilizzato sia per la classificazione delle aree di raccolta che per il loro consumo senza cottura. Informazioni di base I molluschi sono animali dotati di conchiglia che vivono negli estuari e sono soggetti a consistenti contaminazioni fecali da parte delle acque di scarico inquinate nelle quali sono raccolti. I molluschi bivalvi, che includono ostriche, cozze e vongole e altre specie, si nutrono e respirano tramite meccanismi filtranti. Ciò può dar luogo ad accumulo nei loro tessuti corporei di microrganismi patogeni provenienti dalle acque di scarico. La Direttiva EC 91/492 1 definisce le condizioni per la produzione e la commercializzazione dei molluschi bivalvi vivi. Essa specifica uno standard per il prodotto finale e la classificazione in categorie delle aree di raccolta, in base al grado di contaminazione da batteri fecali della polpa dei molluschi. Escherichia coli è attualmente utilizzata nel Regno Unito come un indicatore della contaminazione fecale. Sono stati definiti i criteri microbiologici per la classificazione dei molluschi presenti nelle aree di raccolta e per i molluschi bivalvi vivi pronti al consumo immediato 2. Questo metodo è modificato rispetto a quello fornito dal Ministry of Agriculture, Fisheries and Food, Department of Health, and Public Health Laboratory Service Working Group 3 descritto nella Practical Food Microbiology 4. Per l identificazione di E.coli 5 il metodo modificato utilizza un substrato cromogeno. Fornisce inoltre linee guida generali per la preparazione del campione ed il conteggio delle E. coli nei molluschi bivalvi con la tecnica del numero più probabile. Nel Regno Unito rappresenta il metodo standard per le prove sui molluschi. W & E Co-ordinators Forum and the Environmental Surveillance Unit, CDSC. Pagina 5 di 20

6 1.0 PRINCIPIO Si aggiungono definiti volumi di diluizioni omogeneizzate di molluschi ad una serie di provette contenenti un terreno liquido differenziale. Dopo incubazione, le provette che presentano le caratteristiche variazioni prodotte da una reazione positiva (produzione di acido dal lattosio) sono poste in subcoltura in un terreno contenente 5-bromo- 4-chloro-3indolil- -D-glucuronide (BCIG), poi incubato a 44 C per confermare l identificazione come E. coli. Il numero più probabile (MPN, most probable number) di E. coli in un campione di 100 grammi di molluschi è determinato dal numero di provette positive a ciascun livello di diluizione ed è ottenuto con le tabelle di probabilità DEFINIZIONI Nel contesto di questo metodo si applica la seguente definizione: Escherichia coli Le E. coli fanno parte della famiglia delle Enterobacteriaceae e soddisfano entrambe i seguenti criteri nelle condizioni di prova specificate in questo metodo: produzione di acido dal lattosio a 37 C- 1 C e produzione di - glucuronidasi a 44 C ± 1 C. 3.0 CONSIDERAZIONI SULLA SICUREZZA Applicare le normali precauzioni del laboratorio di microbiologia. Inoltre, l apertura dei molluschi richiede l uso di un affilato coltello per ostriche. Assicurasi che siano seguite appropriate procedure di sicurezza. Indossare un grembiule protettivo, un nuovo paio di guanti per ciascun campione esaminato, ed occhiali di protezione. 4.0 ATTREZZATURA Normale attrezzatura di laboratorio ed aggiungere: Confezione Clic huitre* (ostrica) (opzionale, disponibile presso Seasalter Shellfish (Whitstable) Ltd. Whitstable, Kent) Sgusciatore ostriche/molluschi (opzionale, disponibile presso M. Gilbert (Greenford) Ltd. Greenford, Middlesex) Coltello per ostriche (opzionale) Rompi ostrica (opzionale, disponibile presso Atlantic Shellfish Ltd, Rossmore, Cork, Ireland) Imbuto di acciaio (opzionale) Contenitori sterili - capacità nominale di 250 ml Bilancia con sensibilità di 0.1g Stomacher (opzionale) Miscelatore rotante (opzionale) Diluitore gravimetrico (opzionale) Termostati: 37 C + 1 C 44 C + 1 C (opzionale) Lampada UV a 366nm Buste per stomacher Pipettatori automatici e relativi puntali sterili in grado di erogare volumi fino a 10mL e 1mL (opzionale) Pipette (sterili con rilascio totale) 10mL e 1mL graduate in volumi di 0.1 ml (opzionale) W & E Co-ordinators Forum and the Environmental Surveillance Unit, CDSC. Pagina 6 di 20

7 5.0 TERRENI DI COLTURA Soluzione peptonata 0.1% Peptone Acqua ph 7.0 ± 0.2 a 25 C 1.0 g 1 L Diluente peptone salino (DPS) (Diluente di maggior isolamento) Peptone Cloruro di sodio Acqua ph 7.0 ± g 8.5 g 1 L Terreno glutamato minerali modificato (TGMM) Concentrazione normale Lattosio L(+) Acido glutammico L(+) Arginina monoidrocloruro L(-) Acido aspartico L(-) Cisteina Formiato di sodio Fosfato disodico potassio idrogenato Cloruro di ammonio Solfato di magnesio eptaidrato Cloruro di calico diidrato Scaglie di citrato ferrico Acido nicotinico Tiamina (cloridrato di Aneurina) Acido pantotenico Bromocresolo porpora Acqua ph 7.0 ± 0.2 a 25 C Distribuire in volumi di 10 ml 10.0 g 6.35 g 20 mg 24 mg 20 mg 0,25 g 0.9 g 2.5 g 0.1 g 10 mg 10 mg 1 mg 1 mg 1 mg 10 mg 1 L Concentrazione doppia Come per la concentrazione normale ma con concentrazione doppia per litro di acqua. Agar 5-bromo-4-cloro-3indolil- -D-glucuronide (BCIG) Triptone Sali biliare No. 3 Agar BCIG (come sale cicloexilammonio) Acqua ph 7.2 ± 0.2 a 25 C 20.0 g 1.5 g 15.0 g g 1 L W & E Co-ordinators Forum and the Environmental Surveillance Unit, CDSC. Pagina 7 di 20

8 6.0 PROCEDIMENTO 6.1 Conservazione del campione e diluizioni I campioni devono essere trasportati in un in frigoriferi portatili contenenti confezioni di ghiaccio. All arrivo in laboratorio i campioni devono essere conservati a temperatura di 5 C od inferiore ed esaminati il più presto possibile e non più tardi di 24 ore dalla loro raccolta. I campioni non devono essere congelati. 6.2 Preparazione del campione Selezionare almeno 15 cozze, vongole (in funzione delle dimensioni) o 10 ostriche o molluschi. Per altre specie di dimensioni superiori devono essere selezionati almeno 6 molluschi. Pulire i molluschi con raschiamento, strofinando e lavando sotto acqua potabile fredda, e lasciar scolare su carta asciugamani pulita. Deve essere scartato qualsiasi mollusco con guscio aperto o danneggiato. Non immergere i molluschi in acqua o impiegare acqua calda corrente perché ciò può provocare l apertura dei gusci. Aprire i molluschi utilizzando un rompi ostriche sterile o un coltello sterile per ostriche nel modo seguente: Rompi ostriche ostriche/molluschi bivalvi Il rompi ostrica è formato da branche di acciaio con la parte inferiore della tenaglia a forma di lama allungata. Reggere l ostrica nel palmo della mano, la parte del guscio a forma di coppa rivolto verso il basso (per non perdere il liquido dell ostrica) e con il margine sottile rivolto verso di voi. Con la lama in posizione distante, al di sotto dell ostrica, tagliuzzare il bordo sottile fino ad ottenere un piccolo foro sufficiente a permettere l inserimento della lama senza difficoltà. La lama è foggiata per tagliare il muscolo, non per forzare l apertura del guscio, come per un coltello per ostriche. Raschiare con la lama la parte superiore del guscio verso sinistra in modo da tagliare il muscolo cerniera. Quando i gusci si aprono di scatto, tirare verso l alto il guscio superiore e separare il muscolo dal guscio inferiore. Raccogliere i contenuti, incluso il liquor, in un contenitore sterile. Ostriche/molluschi bivalvi - coltello per ostriche Reggere il guscio in modo sicuro su una superficie con la parte piatta o inferiore rivolta verso l alto. Inserire fra i gusci la punta di un coltello sterile per ostriche. Fare leva per aprire il guscio superiore, drenare il liquor in un contenitore sterile ed inserire poi il coltello all interno dell ostrica per recidere l inserzione del muscolo. Fare leva per allentare il cardine, ed aggiungere i componenti, incluso il liquor, in un contenitore sterile. Cozze Porre il cardine della cozza e la parte convessa rivolta verso l alto in un imbuto d acciaio inserito o posto sopra di un contenitore sterile. Inserire la punta di un coltello sterile per ostriche a circa 2cm dal cardine (apertura biassiale) ed esercitare pressione. (L imbuto funge da scudo per la protezione delle mani). Aprire il guscio con un movimento oscillante del coltello e separare i muscoli adduttori. W & E Co-ordinators Forum and the Environmental Surveillance Unit, CDSC. Pagina 8 di 20

9 Lasciare drenare il liquor attraverso l imbuto in un contenitore sterile. La polpa è poi rimossa ed aggiunta al contenitore tagliando i legamenti residui. Vongole Aprire le vongole utilizzando il metodo descritto per le cozze, ma posizionare il cardine delle vongole nella parte inferiore dell imbuto ed inserire il coltello nel margine ventrale. Attrezzatura alternativa per l apertura dei molluschi Ostriche/molluschi bivalvi confezione clic huitre (ostriche):- è costituita da un coltello ed un dispositivo di blocco di gomma. Sgusciatore di ostriche/molluschi bivalvi :- trattasi di uno strumento manuale con lama sostituibile. Pulizia e disinfezione Disinfettare il banco di lavoro fra i campioni. Pulire i coltelli per ostrica e gli imbuti e disinfettare usando acqua calda o iso-propanolo. 6.3 Preparazione dell omogeneizzato Impiego dello stomacher Trasferire tutta la polpa ed il liquor dei molluschi in una busta sterile per lo stomacher. Riporre questa all interno di due o più buste in modo da prevenire la foratura da parte dei frammenti di guscio ed omogeneizzare per 2-3 minuti. Trasferire 50g in un altra busta per lo stomacher. Aggiungere circa 100mL da una soluzione di 450 ml di peptone 0.1% preparata ed omogeneizzare di nuovo per 3 minuti. Aggiungere la parte rimasta della soluzione di peptone 0.1% all omogeneizzato e miscelare vigorosamente. Questa è una diluizione a Impiego del frullatore Pesare tutta la polpa ed il liquor dei molluschi (questa modifica è conseguente all incontro del WG di questa settimana!). Aggiungere due parti in peso di una soluzione sterile di peptone 0.1%. Trasferire in un miscelatore rotante sterile, riposizionare il coperchio ed omogeneizzare per il tempo sufficiente a raggiungere rotazioni. La durata non deve superare i 2.5 minuti. Lasciare riposare per 30 secondi. Fare nuovamente girare vorticosamente per breve tempo, trasferire poi 30 ml dell omogeneizzato in un volume misurato di 70 ml di una soluzione di peptone 0.1% e mescolare in modo opportuno. Il preparato ha una diluizione di Preparazione delle diluizioni Dalla diluizione 10-1 preparare una diluizione 10-2 trasferendo 1 ml in 9 ml di un diluente peptone salino (DPS). Per la categoria C e per le aree di raccolta proibite sono richieste diluizioni successive. Preparare una diluizione 10-3 aggiungendo 1 ml della diluizione10-2 a 9 ml di diluente peptone salino e, se richieste, diluizioni successive in base dieci. 6.5 Semina ed incubazione Aggiungere 10 ml della diluizione10-1 del campione a ciascuno di cinque 10 ml di terreno glutamato minerali modificato a doppia concentrazione (TGMM) (equivalente a 1g di tessuto per provetta). Aggiungere 1 ml delle diluizioni 10-1 e 10-2 del campione a ciascuno di cinque TGMM da 10 ml a concentrazione normale (equivalente a 0,1 e 0.01 g di tessuto). Seminare, se necessario, ulteriori diluizioni. Può essere usata la stessa pipetta graduata da 1mL se si inizia dalla diluizione più elevata (10-3 ) per trasferire l inoculo. Inserire le provette seminate in termostato a 37 C ± 1 C per 24 ± 2 ore. W & E Co-ordinators Forum and the Environmental Surveillance Unit, CDSC. Pagina 9 di 20

10 6.6 Riconoscimento e conteggio Esaminare le provette di TGMM per la comparsa di acidità (colore giallo nel terreno). E da notare che la presenza di qualsiasi acido, indipendentemente dalla quantità, è considerata come risultato positivo. L assenza di acido è considerata come risultato negativo per E. coli. Registrare tutti i risultati. 6.7 Conferma delle E. coli Eseguire sottocolture da tutte le provette che presentano produzione di acido su una sezione di una piastra di agar BCIG, strisciare in modo da ottenere colonie isolate ed inserire in termostato a 44 C ± 1 C per 24 ± 2 ore. Non refrigerare le provette prima della suttocoltura. Dopo incubazione:- Esaminare le piastre BCIG per la presenza di colonie blu-verdi. Le provette dalle quali crescono colonie blu-verdi sono registrate come positive per E. coli. L assenza di colonie blu-verdi indica che le provette sono negative per E.coli. 6.8 Ceppi di controllo Controllo positivo:- Escherichia coli NCTC 9001 Escherichia coli NCTC (ceppo positivo, debole attività della glucoronidasi) Controllo negativo:- Klebsiella aerogenes NCTC CALCOLO DEI RISULTATI Registrare il numero delle provette di ciascuna diluizione nella quale sono state riscontrate E. coli. Usando le tabelle del numero più probabile (MPN) calcolare il MPN per 100g (Allegato 2). Quando si usano le diluizioni, scegliere una serie consecutiva di 3 diluizioni in base dieci che presentano alcune reazioni positive ed alcune negative secondo le seguenti indicazioni: Scegliere il volume più piccolo (diluizione più elevata) che presenta alcune reazioni positive con due serie di diluizioni precedenti ad esempio. Provette positive 5, 3, 2, 0 utilizzare 5, 3, 2. Quando possibile impiegare serie di diluizioni i cui risultati non siano tutti positivi o tutti negativi, ed il cui valore medio non sia né 5 né 0. Quando ciò non è possibile scegliere serie di diluizioni contenenti reazioni positive piuttosto che tutte negative. ad esempio. Provette positive 5, 5, 2, 0, utilizzare 5, 5, 2. Se solo una serie di provette presenta una reazione positiva, se possibile, utilizzare questa diluizione ed una maggiore ed una inferiore. ad esempio. Provette positive 0, 1, 0, 0, W & E Co-ordinators Forum and the Environmental Surveillance Unit, CDSC. Pagina 10 di 20

11 utlizzare 0, 1, 0. Nota: Le tabelle del MNP riportate contengono solo valori di categoria 1 e 2, vale a dire: quelli che hanno la maggiore probabilità di essere corretti. I valori che non appaiono nella tabella non sono accettabili e non devono essere utilizzati. Se i risultati della combinazione di provette determinano valori non accettabili, la prova deve essere ripetuta in modo completo su molluschi refrigerati o su un campione ottenuto successivamente. 8.0 ESPRESSIONE DEI RISULTATI Se nessuna E, coli è stata rilevata, refertare come inferiore a 20/100g Se i il numero di microrganismi ricercati è di 20 o superiore per grammi refertare come: a per 100g ove a è un numero ottenuto dalle Tabelle del Most Probable Number (Tabelle 1 e 2). Se il numero è superiore a 100 registrare una cifra prima e dopo il punto decimale dell appropriata potenza di dieci. Sono disponibili i limiti di confidenza 6. Se il valore del MPN ottenuto non è accettabile, refertare il risultato come non validi (consultare la nota alla sezione 7). W & E Co-ordinators Forum and the Environmental Surveillance Unit, CDSC. Pagina 11 di 20

12 Allegato 1: Diagramma di flusso che illustra la procedura operativa del conteggio di E. coli nei molluschi crudi con la Tecnica delle Provette Multiple Aprire i molluschi ( 10 ostriche/molluschi bivalvi, 15 cozze, vongole ed inserire il contenuto (polpa e liquor) in una busta per stomacher Collocare la busta per lo stomacher all interno di altre due o più ed azionare lo strumento per 2 3 minuti Pesare il contenuto, aggiungere il doppio, in peso, di peptone 0.1% Pesare 50g di omogeneizzato in un'altra busta per stomacher, aggiungere 50 ml di soluzione peptone 0.1% da una preparazione di 450 ml Miscelare con miscelatore rotante ( rivoluzioni) Azionare lo stomacher per 2 3 minuti Rimuovere 30 ml di omogeneizzato, aggiungere 70 ml di soluzione di peptone 0.1% che fornisce una diluizione10-1 (miscelare i modo idoneo) Aggiungere la restante soluzione di peptone 0.1% per ottenere la diluizione10-1 (miscelare bene) Preparare le diluizioni di 10-2 e 10-3 Seminare 10 ml della diluizione10-1 in 5 provette di terreno glutammato minerali modificato (TGMM) a doppia concentrazione Seminare 1 ml di ciascuna diluizione in 5 provette di brodo TGMM a concentrazione normale per diluizione Incubare tutte le provette di TGMM a 37 C Controllare per la produzione di acido dopo 24 ore Eseguire sottocolture dalle provette che presentano produzione di acido su W & E Co-ordinators Forum and the Environmental Surveillance Unit, CDSC. Pagina 12 di 20

13 agar BCIG posto a 44 C per 24 ore Refertare il numero più probabile di E. coli per 100 grammi di tessuto W & E Co-ordinators Forum and the Environmental Surveillance Unit, CDSC. Pagina 13 di 20

14 Allegato 2: Le Tabelle riportano i numeri probabili di microrganismi (adattata da Tilllett 1987) Tabella 1: Numeri probabili di microrganismi. Tavole rivedute per il metodo con provette multiple (risultati espressi come MPN per 100 grammi utilizzando 5 x 1 g, 5 x 0.1 g, e 5 x 0.01 g) Categoria A (<230 E. coli) Categoria B (> 230 a <4.600 E. coli W & E Co-ordinators Forum and the Environmental Surveillance Unit, CDSC. Pagina 14 di 20

15 Categoria C (>4.600 a <46.000) * Richiede ulteriori diluizioni per chiarire la classificazione W & E Co-ordinators Forum and the Environmental Surveillance Unit, CDSC. Pagina 15 di 20

16 Tabella 2: Numeri probabili di microrganismi. Tavole rivedute per metodo con provette multiple (risultati espressi come MPN per 100 grammi utilizzando 5 x 0.1 g, 5 x 0.01 g e 5 x 0.001g) Categoria A (<230 E. coli) Categoria B (>230 a <4.600 W & E Co-ordinators Forum and the Environmental Surveillance Unit, CDSC. Pagina 16 di 20

17 Categoria C (>4600 a <46000 Vietate (>46.000) W & E Co-ordinators Forum and the Environmental Surveillance Unit, CDSC. Pagina 17 di 20

18 Tabella 3: Tabella 1: Numeri probabili di microrganismi. Tavole rivedute per metodo con provette multiple (risultati espressi come MPN per 100 grammi utilizzando 5 x 0.01 g, 5 x g, e 5 x g) Categoria B (>230 a <4600 E. coli Categoria C (>4.600 a < E. coli W & E Co-ordinators Forum and the Environmental Surveillance Unit, CDSC. Pagina 18 di 20

19 Vietate (> E. coli) W & E Co-ordinators Forum and the Environmental Surveillance Unit, CDSC. Pagina 19 di 20

20 BIBLIOGRAFIA 1 European Communities. Council Directive 91/492/EEC laying down the health conditions for the production and the placing on the market of live bivalve molluscs. Official Journal of the European Communities 1991: No. L268/1 (15 July), Ministry of Agriculture, Fisheries and Food, Department of Health, Scottish Office, Welsh Office. The Food Safety (Live Bivalve Molluscs and other Shellfish) Regulations Statutory Instrument No London: HMSO, Ministry of Agriculture, Fisheries and Food, Department of Health, and Public Health Laboratory Service Working Group. Bacteriological examination of shellfish. PHLS Microbiology Digest, 1992; 9: Roberts D. Hooper W. Greenwood M. (eds) Practical Food Microbiology. PHLS : London, Donovan TJ, Gallacher S, Andrews NJ, Greenwood M, Graham J, Russell JE, Roberts D, Lee R Modification of the standard method used in the United Kingdom for counting Escherichia coli in live bivalve molluscs. Communicable Disease and Public Health; 1998; 1: Tillett HE. Most probable numbers of organisms: revised tables for the multiple tube method. Epidemiology and Infection 1987; 99: W & E Co-ordinators Forum and the Environmental Surveillance Unit, CDSC. Pagina 20 di 20