VIRUS. Rapporto virus-ospite e virus umani

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1 VIRUS Rapporto virus-ospite e virus umani

2 I virus, strutture ultramicroscopiche (max 0.3 µm), parassiti endocellulari obbligati: devono infettare una cellula per potersi replicare Costituiti da materiale genetico (RNA o DNA ss o ds): un solo tipo di acido nucleico rivestito da proteine (capside) virus nudi eventuale pericapside o envelope fosfolipidico acquisito da ospite Proteine di superficie necessarie x inerazione con cellula bersaglio infettano cellule batteriche, eucariotiche vegetali e animali Gamma di ospiti + - ristretta (solo un tipo cellulare di una specie o di specie diverse, vari tipi cellulari di una stessa specie, ) Interazione con cellula ospite puo provocare morte, trasformazione cellulare o danni +- lievi: in gen. apparato biosintetico della cellula è stravolto e dirottato verso sintesi di particelle virali

3 Genomi virali Dimensione : 3,2 kb-1200 kb DNA-RNA ss o ds, lineare o circolare, singola molecola o genoma segmentato Filamenti + o - Strategie espressive/replicative diverse a seconda di tipo/polarità di acido nucleico mrna(+) proteina

4 Compattezza dei genomi virali Limitazione dimensioni dovuta a capside proteico Strategie per aumentare numero funzioni virali ORF sovrapposte Splicing alternativo Precursori poliproteici che maturano in diverse proteine Geni per Enzimi specifici replicazione virale Inibitori ospite (es degradazione DNA ospite, blocco sintesi proteica e replicazione DNA ospite, etc) Proteine strutturali (nuovi virioni)

5 Evoluzione virale In generale virus (soprattutto ad RNA) mostrano rapida evoluzione dovuta a: Elevato tasso di errori nella copiatura del materiale genetico (spec per virus a RNA in cui le RNA polimerasi RNA-dipendenti non hanno correzione bozze); Elevata capacità riproduttiva: migliaia di copie genomiche /cellula infettata elevata possibilità di mutazione in tempi brevi Altri fenomeni genetici contribuiscono all evoluzione virale interazione genica durante co-infezione mediante: Riassortimento genomico: scambio di frammenti di genoma tra virus genotipicamente diversi solo in virus con genomi segmentati Ricombinazione genetica: nuove combinazioni di loci genici: a livello di DNA con sistemi ricombinazione cellulare, in virus ad RNA con meccanismi tipo salto enzima trascrittasi Complementazione: interazione a livello funzionale. Virus difettivi diversi si supportano vicendevolmente

6 Virus batterici o fagi I fagi hanno testa icosaedrica o filamentosa contenente DNA ds Molti fagi hanno una coda a simmetria elicoidale attraverso cui trasferito DNA Le fibre e la piastra basale servono per adesione ai recettori batterici

7 I fagi di serie T sono litici : producono la lisi cellulare Ciclo litico del fago T4

8 Il fago λ è temperato: può provocare lisi dell ospite oppure instaurare lisogenia (stato di profago); La lisogenia può revertire alla via litica in base a condizioni ambientali (UV, agenti tossici, carenza nutrienti, )

9 Ciclo lisogeno e via litica del fago λ Durante la lisogenia il genoma fagico è replicato insieme a quello dell ospite: il virus è in uno stato di quiescenza

10 Il genoma di λ è DNA ds lineare con estremità coesive: Estremità 5 a singola elica protrudenti e complementari

11 L integrazione del fago avviene dopo circolarizzazione del genoma virale a livello dei siti COS e mediante successiva ricombinazione sito-specifica (promossa da integrasi virale) in una regione specifica del cromosoma batterico (λ att)

12 Il genoma fagico è replicato generando un concatamero (tante copie genomiche legate insieme) che viene poi tagliato in singole molecole DNAds con estremità sporgenti (ss) COS Le singole molecole sono impacchettate nelle teste fagiche

13 Fasi del ciclo riproduttivo di un virus eucariotico Legame tra proteine di attacco e recettori cellulari Fusione con membrana o endocitosi mediata da recettore uncoating Modalità replicazione-biosintesi a volte degradazione DNA ospite; trascrizione geni virali e sintesi proteine virali Assemblaggio e rilascio mediante gemmazione o lisi cellulare

14 L interazione virus-ospite eucariotico può concludersi in: INFEZIONE PRODUTTIVA: Rilascio progenie virale numerosa morte celllulare per necrosi o apoptosi (cellule permissive) INFEZIONE ABORTIVA: no progenie (cellule non permissive) INFEZIONE RESTRITTIVA: scarsa progenie virale, ma persistenza del virus nella cellula in forma latente (cellule solo transitoriamente permissive)

15 Lo stato di latenza spesso consiste nella integrazione del genoma virale in quello dell ospite: STATO DI PRO-VIRUS Al contrario dei fagi lo stato di provirus è stabile e generalm irreversibile INTEGRAZIONE in gen casuale per genomi DNA a livello di siti virali specifici (LTR) per virus ad RNA In alcuni casi l infezione di cellule non permissive provoca la trasformazione neoplastica: virus oncògeni o tumorali virus a DNA (SV40, HPV, Epstein-Barr, HBV) interferiscono con normale proliferazione cellulare alterando pattern di espressione genica o altro virus a RNA (retrovirus HTLV-1) contengono copie alterate di geni endogeni cellulari coinvolti in controllo ciclo

16 Alcuni virus ad RNAss (retrovirus come HTLV, HIV, ALV, MuLV, RSV) ricopiano il proprio RNA (+) in DNA (cdna) (enzima trascrittasi inversa) per poi integrarlo nel DNA della cellula ospite (ricombinaz sito-specifica) coinvolgendo LTR provirus DNAprovirale trascritto da RNApol cellulare in mrna(+) che funziona sia come stampo per sintesi di proteine virali che come copie del genoma virale progenie rilasciata per gemmazione

17 Molti virus sono agenti eziologici di malattie umane (raffreddore, influenza, epatiti, vaiolo, poliomielite, AIDS, rabbia, morbillo, varicella ) Il virus dell influenza A è ad RNA segmentato; capside + pericapside fosfolipidico con spicole proteiche che mediano adesione con cell ospite Gamma d ospite: infetta cellule tratto respiratorio di vari animali (mammiferi ed uccelli) Molto contagioso Responsabile di pandemie (epidemie diffuse in grosse aree)

18 CICLO VITALE del virus influenza A Le molecole di RNA- sono trascritte in mrna+ (RNA pol RNA dipendente virale) traduzione nel citosol proteine virali Trascrizione nel nucleo nuovi genomi RNA- morte cellulare Elevato tasso di errore della trascrittasi, co-infezione e ampiezza serbatoio animale ospite veloce evoluzione del virus influenzale sempre nuove varianti verso cui SI non è preparato (vaccini annuali)

19 Le infezioni miste con virus influenzali provenienti da animali virulenza Il virus influenzale H1N1 è di origine suina e si è prodotto per ricombinazione di tratti virali suini, aviari e umani evoluzione rapida e drastica del genoma (shift antigenico) pandemie

20 VIRUS ONCOGENI (a RNA e DNA) Inducono trasformazione cellulare in vitro e tumorigenesi in vivo Molti virus oncogeni ad RNA sono retrovirus che hanno casualmente exciso dal genoma della cellula infettata un gene cellulare che controlla proliferazione trasduzione e mutazione del gene. Gli oncogéni virali sono quindi omologhi (mutati/aberranti) di geni cellulari

21 Retrovirus che provocano tumori in vari animali: genoma con tratti caratteristici e conservati nei retrovirus (GAG-POL-ENV) + oncogene Il retrovirus HTLV-1 umano provoca tumore (leucemia) perché un suo gene (regione X) codifica per fattore che attiva l espressione di vari geni cellulari che stimolano crescita (citochine, recettori fattori di crescita, ) e reprime geni che frenano proliferazione (es p53)

22 Virus oncogeni a DNA nell uomo Es HPV infetta epiteli - responsabile del 70% tumori cervice uterina (trasmissione via sessuale) Oncogeno quando si integra in genoma ospite: espressione di geni che stimolano crescita cellulare neoplasia (ceppi HPV-16 e -18) Vaccinazioni preventive, utilità di PAP test Degrada oncosoppressore p53 Lega e inattiva oncosoppressore Rb

23 Nobel Prize in Physiology or Medicine Harald zur Hausen for his discovery of "human papilloma viruses causing cervical cancer" and -Françoise Barré-Sinoussi and Luc Montagnier for their discovery of "human immunodeficiency virus Harald zur Hausen went against current dogma and postulated that oncogenic human papilloma virus (HPV) caused cervical cancer, the second most common cancer among women. He realized that HPV-DNA could exist in a non-productive state in the tumours, and should be detectable by specific searches for viral DNA. He found HPV to be a heterogeneous family of viruses. Only some HPV types cause cancer. His discovery has led to characterization of the natural history of HPV infection, an understanding of mechanisms of HPV-induced carcinogenesis and the development of prophylactic vaccines against HPV acquisition. Françoise Barré-Sinoussi and Luc Montagnier discovered human immunodeficiency virus (HIV). Virus production was identified in lymphocytes from patients with enlarged lymph nodes in early stages of acquired immunodeficiency, and in blood from patients with late stage disease. They characterized this retrovirus as the first known human lentivirus based on its morphological, biochemical and immunological properties. HIV impaired the immune system because of massive virus replication and cell damage to lymphocytes. The discovery was one prerequisite for the current understanding of the biology of the disease and its antiretroviral treatment

24 Virus oncogeni a DNA nell uomo -virus di Epstein Barr (EBV); infetta linfociti e cellule epitelio cavo orale; contribuisce a sviluppo di tumori linfoma di Burkitt Le proteine virali EBNA agiscono da fattori trascrizionali che attivano l espressione del gene c-myc (fattore trascrizionale stimolatore di proliferazione) -HBV (virus epatite B): infetta epatociti; provoca epatite acuta, cronica e epatocarcinoma (HCC). L induzione del tumore dipende da stato infiammatorio cronico (iperstimolazione dei linfociti) e da proteine virali che alterano normali vie apoptotiche e proliferative Vaccinazioni preventive

25 Virus dell immunodeficienza umana (HIV) Retrovirus con genoma ad RNA+ (2 molecole), nucleocapside e pericapside fosfolipidico 2 ceppi principali (HIV-1 e -2) con diversa distribuzione geografica Attacca cellule del SI che presentano recettore CD4 (soprattutto linfociti T helper, alcuni macrofagi e dendriti) Fase acuta: sintomi influenzali Fase cronica: asintomatica anche per diversi anni ma compromissione del SI (infezioni opportunistiche e tumori)

26 dopo retrotrascrizione in DNA e formazione delle LTR, Il genoma di HIV è integrato a caso nel DNA cellulare Ciclo di HIV Enzima RT ha 3 attività catalitiche: 1.Retrotrascrive RNA in DNA 2.Degrada RNA su ibrido DNA- RNA 3.Copia secondo filamento DNA Genoma evolve rapidamente per alto tasso di mutazione Ricombinazione promossa anche dai salti molecolari della RT Difficoltà nel produrre vaccini Farmaci attuali sono inibitori delle proteasi e della RT

27 Viroidi Agenti infettivi subvirali che parassitano cellule vegetali Differenze rispetto ai virus: Genomi piccoli (alcune centinaia di nt) ad RNAss circolare e/o bastoncellare Non codificano per proteine Non esistono (isolati) in forma libera

28 HP sull origine dei virus forme di vita degenerate che hanno perso molte delle loro funzioni essenziali Porzioni di genoma cellulare che si sono affrancate Evoluzione parallela ed indipendente rispetto a organismi cellulari (retaggio di mondo ad RNA) Virus comunque comparsi dopo cellule

29 I virus batterici sono sistemi modello per lo studio del gene e dei meccanismi molecolari che sottendono al flusso di informazione genica Facili da coltivare Elevata capacità replicativa grandi numeri Modello sperimentale semplice, rapido, buona statistica

30 La morfologia della placca di lisi è carattere fenotipico utilizzato per l analisi genetica virale Lisi rapida placche piccole margini irregolari Lisi lenta placche grandi margine netto Carattere r

31 Altro carattere fenotipico utilizzato per l analisi genetica virale è la specificità di infezione o gamma di ospite Carattere h

32 Genetica batterica Anche batteri sono ottimi modelli di studio: semplici dal pv genetico (genomi piccoli e aploidi), facili da coltivare in laboratorio, tasso riproduttivo alto, Negli anni studi sui batteri hanno permesso di dimostrare natura del materiale genetico (esp trasformazione di Griffith ripreso da Avery, MacLeod, McCarty) Es. p di ricombinazione prime mappature geniche Esp di Jacob e Monod: modello operone nella regolazione dell espr. genica

33 I Batteri possono essere coltivati in terreni di coltura solidi o liquidi Caratteri fenotipici tipicamente studiati: Morfologia colonia Mutanti nutrizionali (capacità di crescere in particolari condizioni colturali) Mutanti di resistenza

34 Oltre al genoma principale (cromosoma batterico formato da DNA ds circolare) i batteri hanno plasmidi ed episomi: piccoli DNA circolari. Contengono geni per resistenza a/sintesi antibiotici, produzione tossine, e/o funzioni che possono dare vantaggio selettivo in particolari condizioni crescita, e geni di trasferimento

35 Plasmidi: solo citoplasmatici Episomi: sia in forma libera citoplasmatica che integrati nel genoma principale

36 Eucarioti e procarioti contengono elementi genetici mobili o trasposoni: sono DNA parassiti che spostandosi nel genoma possono distruggere geni o interferire con loro espressione Anni 40 Studi di Barbara McClintock Sul mais: esistenza di mutazioni geniche particolarmente instabili

37 anni 60: scoperta dei trasposoni batterici Nei batteri esistono vari tipi di trasposoni (ma solo a DNA): 1) Elementi IS: semplici, brevi (2,5 kb), con solo geni per mediare trasposizione e seq riconosciute da trasposasi; trasposizione conservativa 2) Trasposoni composti (Tn): altri geni, es resistenza antibiotico; trasposizione replicativa

38 Trasposizione conservativa e replicativa ( Molti trasposoni si muovono con entrambi meccanismi Trasposizione intra o inter DNA trasposone si sposta da un punto all altro Duplicazione durante trasposizione

39 Nei genomi eucariotici si trovano anche retrotrasposoni: migrano tramite intermedio ad RNA. Il retrotrasposone codifica per una trascrittasi inversa che copia l RNA in DNA: questo si inserisce in un altro punto genomico (trasposizione duplicativa). Retrotrasposoni umani L1 (15% genoma) ed Alu.

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41 Il genoma umano è costituito per il 40% da elementi genetici mobili (trasposoni o simili)!! Mentre regioni codificanti (ORF) sono solo il 2%

42 Rilevanza clinica: I trasposoni batterici contribuiscono alla diffusione della resistenza gli antibiotici I trasposoni che veicolano i geni di resistenza si inseriscono in plasmidi o episomi che possono trasferirsi da cellula a cellula Geni di resitenza codificano per enzimi che degradano, modificano, o espellono l antibiotico

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44 Sessualità e ricombinazione genica nei batteri La ricombinazione si puo avere solo in condizioni di diploidia parziale che si verificano a seguito di trasformazione, trasduzione e coniugazione.

45 Trasformazione Una molecola di DNA rilasciata nell ambiente da un batterio è captata da una cellula ricevente (NB entra DNA ss) Se il DNA entrato ha omologia di sequenza con DNA endogeno ricombinazione: trasferimento di informazione genica In alcune fasi della crescita i batteri sono competenti cioè predisposti ad assumere DNA nudo dall ambiente extracellulare La cellula competente ha opportune proteine di membrana per legare e internalizzare DNA esogeno

46 Fenotipo S (virulento) ed R (innocuo) osservato da Griffith negli esperimenti su pneumococco (1928) dimostrazione del principio trasformante

47 Coniugazione Trasferimento unidirezionale di DNA da batterio donatore a ricevente mediante contatto fisico (pilo sessuale o canale coniugativo)

48 Individuati 3 tipi sessuali F- : ricevente F+: donatore, ha un fattore F (episoma) con funzione coniugativa Hfr: donatore con alta freq di ricombinazione, ha fattore F integrato nel genoma

49 Il fattore F contiene geni per formare pilo coniugativo Il trasferimento avviene a partire da un punto preciso: mentre si trasferisce, il DNA si duplica ( una copia resta nella cellula donatrice) La cellula ricevente a sua volta diventa F+

50 Nei ceppi Hfr il fattore F è integrato nel genoma Questi ceppi trasferiscono, oltre al DNA di F, anche il DNA genomico associato In q caso, la cellula ricevente raramente diventa F+ perchè prima di trasferire l ultimo tratto di F deve essere trasferito intero genoma (contatto deve durare almeno 1 h 30 min!!)

51 Esperimenti di accoppiamento interrotto tra ceppi Hfr e ceppi F- (con genotipi diversi) ha permesso di creare mappe genetiche di E. coli (ordine relativo dei geni definito in base al tempo necessario per trasferire versione alternativa del gene corrispondente mediante coniugazione) Questi esperimenti hanno anche dimostrato che il genoma batterico è circolare

52 Intercellular Nanotubes Mediate Bacterial Communication. Gyanendra P. Dubey and Sigal Ben- Yehuda Cell Bacteria are known to communicate primarily via secreted extracellular factors. Here we identify a previously uncharacterized type of bacterial communication mediated by nanotubes that bridge neighboring cells. Using Bacillus subtilis as a model organism, we visualized transfer of cytoplasmic fluorescent molecules between adjacent cells. Additionally, by coculturing strains harboring different antibiotic resistance genes, we demonstrated that molecular exchange enables cells to transiently acquire nonhereditary resistance. Furthermore, nonconjugative plasmids could be transferred from one cell to another, thereby conferring hereditary features to recipient cells. Electron microscopy revealed the existence of variously sized tubular extensions bridging neighboring cells, serving as a route for exchange of intracellular molecules. These nanotubes also formed in an interspecies manner, between B. subtilis and Staphylococcus aureus, and even between B. subtilis and the evolutionary distant bacterium Escherichia coli. We propose that nanotubes represent a major form of bacterial communication in nature, providing a network for exchange of cellular molecules within and between species. Comunicazione tramite nanotubi è meno efficiente di coniugazione vera e propria, ma non richiede plasmidi coniugativi ed è bidirezionale Alla base di trasferimento genico orizzontale?

53 Trasduzione Trasferimento di DNA da un batterio donatore (precedentemente infettato) and un ricevente, attraverso un fago -Generalizzata: trasferito tratto qualsiasi DNA batterico (ospite) che si impacchetta insieme a DNA virale - Specializzata: trasfer di seq. specifiche

54 Trasduzione specializzata Deriva da un fago lisogeno (integrato come profago nel DNA batterico) Quando il fago si excide dal genoma batterico per riprendere via litica, può incorporare per sbaglio breve tratto di DNA batterico Il tratto trasdotto è specifico perchè il sito di integrazione del fago sul genoma batterico è specifico (siti att)

55 Anche gli studi sul trasferimento genico associato a trasformazione e trasduzione hanno contribuito a mappare geni batterici (soprattutto quelli molto vicini) In particolare la frequenza di cotrasduzione e/o di cotrasformazione di marcatori genici ha permesso di stimare il grado di associazione tra geni: cioè quanto sono distanti fisicamente sul DNA Freq cotrasduzione alta minore distanza fisica Freq cotrasduzione bassa maggiore distanza fisica

56 Meccanismo molecolare di ricombinazione Ricombinazione omologa: scambio reciproco di DNA tra sequenze omologhe (crossing over tra cromatidi meiotici, integrazione di DNA trasdotto, coniugato o trasformato in batteri, ricombinazione virale) La ricombinazione avviene per rotture a doppio filamento sul DNA, srotolamento, invasione di ssdna su filamento complementare, saldatura, taglio e ricongiunzione (vari enzimi coinvolti, alcuni si trovano nel complesso sinaptinemale) Modello di Holliday

57 Ricombinazione sito-specifica: brevi seq specifiche di DNA sono riconosciute da enzimi recombinasi unione delle 2 molecole di DNA in cui si trovano sequenze (+efficiente di ricombin. omologa) Es integrazione di fago λ e di fattore F nel genoma batterico