SEMINARI GRIFA M. Balderacchi M. Trevisan A. Arnoldi E. Conte M. Gennari C. Vischetti

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1 SEMIARI GRIFA 24-5 Quaderno GRIFA n 24 A cura di: M. Balderacchi M. Trevisan A. Arnoldi E. Conte M. Gennari C. Vischetti

2 Immagine di copertina di Gian Paolo Puglisi 26 GRIFA Gruppo Italiano Ricerca Fitofarmaci ed Ambiente via Emilia Parmense, 84 I-291 Piacenza tel.: , fax.:

3 Questo quaderno raccoglie le presentazioni tenute nei seminari GRIFA di: Milano -17 dicembre 24 Roma - 5 maggio 25 Catania - 11 novembre 25 Milano - 17 dicembre 24 Elga Monaci Daniele Del Buono Marco icelli Giovanna Boschin Roma - 5 maggio 25 Johann Santer Rosanna Gatti Tiziana Generali Graziella Amendola Interferenze reciproche tra pesticidi e biomassa microbica nei suoli e in materiale organico di diversaprovenienza 4 Antidoti e detossificazione dei fitofarmaci: una strategia possibile per la decontaminazione del sistema suoloiacqua 28 Un approccio per la riduzione della contaminazione delle acque. Biomassbed, due anni di sperimentazione in azienda 47 Relazione struttura e reattività in condizioni idrolitiche e fotochimiche di erbicidi solfonilureici 6 La chimica analitica e curve di degrado del proesadione calcio (Prohexadione Calcium) 75 Valutazione del rischio di esposizione dermica a fitofarmaci nelle coltivazioni ortofrutticole in serra 88 Consiglio Oleicolo Internazionale: ruolo e compiti dell'istituto Superiore di Sanità 12 Piani Triennali per la sorveglianza sanitaria di fitofarmaci: controllo degli alimenti destinati all'infanzia 113 Paolo Flori La previsione dei residui di agrofarmaci sui prodotti vegetali 127 Simone Lucchesi Catania - 11 novembre 25 Andrea Gualco Luca Fiorilla Anna Carone Colture minori: la situazione emersa nell'ambito del "Controllo dei residui dei prodotti fitosanitari finalizzato alla razionalizzazione delle tecniche di difesa delle colture" 142 Prodotti fitosanitari: ricaduta sull'agricoltura siciliana dell'evoluzione del quadro normativo comunitario 155 ormativa ed autorizzazione dei presidi fitosanitari con riferimento al ruolo della valutazione del rischio 177 Daniela Borzì Indagini sul comportamento della Fenexamide nell'ambiente

4 Elga Monaci Interferenze reciproche tra pesticidi e biomassa microbica nei suoli e in materiale organico di diversaprovenienza 4

5 Seminario GRIFA - Università di Milano-17 Dicembre 24 ITERFEREZE RECIPROCHE TRA FITOFARMACI E BIOMASSA MICROBICA EL SUOLO E I MATERIALI ORGAICI DI DIVERSA PROVEIEZA Dott.ssa Elga Monaci Dipartimento di Scienze Ambientali e delle Produzioni Vegetali Area di Scienze del Suolo e.monaci@univpm.it Tel Perché i fitofarmaci sono degli xenobiotici? (xeno=estraneo; bios=vita) Cl In natura H 3 CH 2 C H Atrazina H CH 3 CH CH 3 OH Cl Cl Cl C Cl Cl Di sintesi Cl Indolo Cl Chlordano Cl 2,4 Diclorofenolo 5

6 DEGRADAZIOE FITOFARMACI ABIOTICA Minerali argillosi, ossidi, idrossidi e sostanza organica BIOTICA Batteri, funghi, enzimi, virus, alghe, microfauna L attività biotica (microbica) è maggiormente significativa da un punto di vista ambientale perché sistemi enzimatici accelerano le cinetiche di degradazione e possono determinare la completa distruzione degli inquinanti organici BIODEGRADAZIOE Singola specie o consorzio di popolazioni microbiche 6

7 METABOLISMO I fitofarmaci vengono utilizzati dai microrganismi per crescere e trasformati in CO 2, H 2, acidi organici, biomassa, costituenti inorganici COMETABOLISMO anche detto metabolismo fortuito, consiste nella trasformazione della molecola originaria del fitofarmaco in molecole che non possono rientrare nei principali processi metabolici tipico di sistemi enzimatici poco specifici (Ossigenasi) Biodisponibilità Lars Bergstrom e John Stenstrom, Ambio Vol. 27,

8 Come si modifica l equilibrio l dell ecosistema ecosistema e quali sono gli effetti sulle popolazioni microbiche non- target? Inibizione della fotosintesi nei cianobatteri da parte di bipiridilici, triazine ed uracili Riduzione della sintesi delle proteine e repressione della divisione cellulare da parte dei benzimidazolici e delle dinitroaniline Danneggiamento delle membrane cellulari inclusa la distruzione del complesso enzima-membrana determinata da bipiridilici e derivati tiocarbammici (diretta o dei metaboliti) Come si valuta l eventuale l effetto tossico di un fitofarmaco? IDICATORI microbici e tests biochimici Rispondono velocemente alle modificazioni di equilibrio Sensibili alle fluttuazioni di breve periodo, ma resistenti a quelle di lungo periodo Rappresentativi delle variazioni proprietà chimico-fisiche e di quelle biologiche 8

9 Inoltre Possibilità di applicazione a diverse e numerose tipologie di suoli e materiali organici Semplici, rapidi nell esecuzione ed economici Il nostro metodo Determinazione del contenuto di C- biomassa Respirazione Attività enzimatiche (idrolitiche specifiche e ossidoriduttive) 9

10 PERCHE? Studio del C-biomassa ci consente di valutare la variazione quantitativa della popolazione microbica in risposta alla presenza del fitofarmaco Metodo della fumigazione-estrazione (Sparling e West, 1988) Fumigazione in cloroformio Estrazione del C solubile in K 2 SO 4 (,5M) Ossidazione carbonio organico di origine microbica con K 2 Cr 2 O 7 (,6M) in ambiente acido Titolazione del K 2 Cr 2 O 7 con Sale di Mohr (,3 M) mg di C-CO 2 kg 1 s. s. 1

11 Respirazione Misura della CO 2 prodotta dall attività respiratoria della biomassa microbica - modificazioni indotte sulla respirazione basale - modificazioni sulla respirazione substrato indotta Studio della respirazione - Analisi titrimetrica (Metodo Dumontet-Mathur, 1989) Respirometro Espressa come mg CO 2 Kg s.s 11

12 EZIMI IDROLITICI FDA-Idrolisi (Swisher e Carol, 198 modificato da Perucci et al., 2) -Test sensibile e non specifico che valuta attività idrolitica della microflora (Veckemans, 1989) - Strumento utile a evidenziare repentinamente l eventuale effetto tossico esercitato dai fitofarmaci sulla biomassa microbica (Dumontet et al.,1997) Determinazione spettrofotometrica (49 nm) della Fluoresceina liberata dall idrolisi della Fluoresceina-Diacetato (1 (1 h di di incubazione a C, ph ph = 7,6). Espressa come µg µg FDA idrolizzata g -1-1 h -1-1 s.s s.s Fosfatasi Alcalina (Page 1982) IDROLASI SPECIFICHE - Mineralizzazione del fosforo organico; specifica dei soli microrganismi (Juma e Tabatabai, 1988) - Difficoltà nell utilizzo di questa attività come indice microbico Arilsolfatasi - Responsabili della mineralizzazione dello zolfo Determinazione spettrofotometrica (42 (42nm) del del p-nitrofenolo sviluppato dall idrolisi (dopo un ora di di incubazione a 37 C,) del del p-nitrofenilfosfato (FOSFATASIpH= 11; 11; mg mg di di p-nitrofenilfosfato idrolizzato g -1-1 h -1-1 )) e del del p- p- nitrofenilsolfato (ARILSOLFATASI ph=5.8mg mg di di p-nitrofenilsolfato idrolizzato g -1-1 h -1-1 )) 12

13 ATTIVITA OSSIDO-RIDUTTIVE Deidrogenasi (von Mersi e Schiner,1991) - catalizzano la riduzione del AD+ o ADP+ partecipando così a reazioni ossidoriduttive di biosintesi. - non hanno attività extracellulare, indicatore utile per studiare gli effetti dei fitofarmaci sull attività microbica Determinazione spettrofotometrica (464 (464nm) del del formazano prodotto dalla dalla riduzione del del sale sale dello dello ioduro di di tetrazolino (IT, 2-(p-iodophenil)-3-(pnitrophenil)-5-phenyl-tetrazolium-chloride durante due due ore ore di di incubazione a 4 4 C. C. Espresso come nmoli ITF g -1-1 h -1-1 ATTIVITA OSSIDO-RIDUTTIVE o-difenolossidasi (Perucci et al 2) - chinoni derivanti dalla ossidazione dei fenoli (funghi lignoliticiwhite rot fungi e actinomiceti) che ne derivano possono essere inglobati in polimeri umici o legarsi al suolo Determinazione spettrofotometrica (525 nm) del del chinone formato dall ossidazione del del catecolo (in (in presenza di di prolina, incubando per 1 1 mint t 3 3 C, ph=6,5) µmoli catecolo ox ox g -1-1 s.s s.s 13

14 IDICI DI VALUTAZIOE METABOLICA qco 2 = coefficiente di respirazione specifica, quantità di CO 2 svolta per unità di carbonio-biomassa (Anderson e Domsch, 199) Un aumento di qco 2 indica uno stress della biomassa microbica IDICI DI VALUTAZIOE METABOLICA qfda = attività idrolitica specifica, livello di attività idrolitica riferita all unità di carbonio biomassa (Perucci et al.,2) Un aumento del qfda indica un peggioramento dell attività metabolica della biomassa microbica 14

15 Applicazioni sperimentali del metodo di studio al suolo Effetto del Rimsulfuron e Imazethapir sulla biomassa microbica nel suolo in presenza ed in assenza di compost Perucci et al., Biol Fertil Soils (2) 32:17-23 TESI (3 gg) Rimsulfuron (R) D e 1D + suolo D e 1D + suolo +compost Imazetapyr (I) D e 1D + suolo D e 1D + suolo +compost Effetti -C-BIOMASSA -RESPIRAZIOE -qco 2 -FDA - qfda 15

16 COTEUTO DI C-BIOMASSA (I) 1D e (R) 1D + suolo + suolo + compost DECREMETO DELLA BIOMASSA MICROBICA essun effetto negativo attribuibile a (I)D e (R)D Attività di respirazione specifica (qco 2 ) Attività idrolitica specifica (qfda) Consumo di energia STRESS (I)D+suolo+ compost Tossicità qco2 (R) 1D +suolo+compost qco2 Efficienza energetica qfda + - (R) 1D+suolo+ compost (I) 1D+suolo+ compost 16

17 Rimsulfuron ed Imazethapyr -Rimsulfuron a 1D tossico soprattutto nei suoli compost -Imazethapyr a 1D meno tossico nei suoli con compost -Imazethapyr (D) sembra stimolare la selezione di biomassa microbica soprattutto nei campioni trattati con compost Modificazioni indotte sul contenuto di biomassa microbica e degradazione di Imazamox e Benfluralin (Vischetti et al., Biology and Fertility of Soils 22) Tre suoli diversi sono stati trattati con Imazamox (x e 4x) Benfluralin (x e 2x) x = dose di campo In condizioni di 25 C e 75% di umidità 4 C e 75% 25 C e 33% 1 C e 75% 17

18 IMAZAMOX Decremento massimo del 2% Ripresa della biomassa microbica quando la concentrazione del fitofarmaco raggiunge il 5% della concentrazione (caso peggiore a 1 C e 75% WHC) BEFLURALI Decremento massimo del 64,7% Ripresa della biomassa microbica quando la concentrazione del fitofarmaco raggiunge il 5% della concentrazione (caso peggiore a 1 C e 75% WHC la biomassa non riprende) 18

19 Studio delle modificazioni indotte sulla respirazione basale (RB) e substrato indotta (SIR) in presenza di fitofarmaci Un nuovo metodo cinetico per la quantificazione della biomassa microbica e dei suoi stati fisiologici di attività (r) e dormienza (k) (John Stenström et al., 1998 Ambio Vol.27 o 1) p = p + r/µ (e µt -1) +Kt+ SIR = la quantità di CO 2 ottenuta istantaneamente all aggiunta del substrato è dato dalla somma r + k Sperimentazione svolta presso il Department of Microbiology Swedish University of Agricultural Sciences SUOLI Ekhaga 4,85 org. C (%); argilloso Ulleraker 1,82 org.c(%); sabbioso Imazamox = (imidazolinone) erbicida sistemico pre-post emergenza Chlorpyrifos = (organofosfato) insetticida non sistemico Metalaxil = (fenilammide) fungicida sistemico e di contatto Respicond III (ordgren Innovation AB, Umea, Sweden) 19

20 Ekhaga ppm Ima Preincubazione dei campioni IMAZAMOX (5-1 ppm) µgc-co 2gdw -1 h mg di C-CO 2 svolta g -1 s. s Time (hours) µgc-co 2g -1 dwh COTROLLO µgc-co2gdw -1 h ppm Ima Time (hours) Time (hours) Ulleraker Preincubazione dei campioni IMAZAMOX (5-1 ppm) µgc-co2g -1 dwh ppm Ima mg di C-CO 2 svolta g -1 s. s Time (hours) µgc-co2g -1 dwh COTROLLO µgc-co 2 g -1 dwh ppm Ima Time (huors) Time (hours) 2

21 Addiction of IMAZAMOX before SIR EKHAGA µg C-CO2 g-1 d. w ectrl e IMA 5 e IMA 1 k r Addiction of IMAZAMOX before SIR µgco2-c g -1 dw h ULLERAKER u CTRL u IMA 5 u IMA 1 k r Applicazioni sperimentali del metodo di studio al materiale organico 21

22 Microbial biomass-c content in UWC samples for the three pesticides at three experimental times (Vischetti et al., Int. J.Environ.Anal. Chem., in press) 6 Chlorpyrifos Control D 5D 1 Glyphosate mg C kg -1 d.m. 4 mg C kg -1 d.m T T1 T2 2 T T1 T2 mg C kg -1 d.m Metalaxyl T T1 T2 Chlorpyrifos = decremento di MBC che permane alla dose più alta Metalaxil e Glyphosate = incremento di MBC; fonte di C FDA- Hydrolysis activity in UWC samples for the three pesticides at three experimental times (Vischetti et al., Int. J.Environ.Anal. Chem., in press) µg FDA hydrolysed,1 g d.m. h -1 5 Chlorpyrifos T T1 T2 Control D 5D µg FDA hydrolysed,1 g - 1 d.m. h Glyphosate T T1 T2 µg FDA hydrolysed,1 g - 1 d.m. h Metalaxyl T T1 T2 Chlorpyrifos = decremento di FDA-idrolisi 25,7% e 36,% per D e 5D 22

23 qfda Control Chl (D) Chl (5D) Gly (D) Gly (5D) Meta (D) Meta (5D) T T T Evoluzione della popolazione di Pseudomonas METALAXYL PSEUDOMOAS spp UFC 1 4 gss T T1 T2 TEMPO COTR MET D MET 5D CHLORPYRIFOS PSEUDOMOAS spp GLYPHOSATE PSEUDOMOAS spp U F C 1 4 g s s T T1 T2 COTR CHL D CHL 5D UFC 1 4 gss T T1 T2 TEMPO COTR GLY GLY 5D TEMPO Prof. Ciani M. Dip. Scienza degli Alimenti Università Politecnica delle Marche-Facoltà di Agraria 23

24 Evoluzione della popolazione di MUFFE e LIEVITI METALAXYL MUFFE e LIEVITI U F C 1 6 g s s T T1 T2 COTR MET D MET 5D CHLORPYRIFOS MUFFE e LIEVITI TEMPO GLYPHOSATE MUFFE e LIEVITI U F C 1 6 g s s T T1 T2 TEMPO COTR CHL D CHL 5D UFC 1 6 gss T T1 T2 TEMPO COTR GLY D GLY 5D Prof. Ciani M. Dip. Scienza degli Alimenti Università Politecnica delle Marche-Facoltà di Agraria Evoluzione della popolazione degli ATTIOMICETI METALAXYL ATTIOMICETI U F C 1 6 g ss T T1 T2 COTR MET D MET 5D CHLORPYRIFOS ATTIOMICETI TEMPO GLYPHOSATE U F C 1 6 g s s T T1 T2 TEMPO COTR CHL D CHL 5D ATTIOMICETI U F C 1 6 g ss T T1 T2 COTR GLY D GLY 5D TEMPO Prof. Ciani M. Dip. Scienza degli Alimenti Università Politecnica delle Marche-Facoltà di Agraria 24

25 ISOLAMETO e CARATTERIZZAZIOE dei MICRORGAISMI Pseudomonas fluorescens Pseudomonas aeruginosa Burkholderia cepacia Criptococcus humiculus Candida rugosa APPLICAZIOI PRATICHE 25

26 Bioremediation i microrganismi al lavoro... Strategia o processo che utilizza microrganismi, piante o sistemi enzimatici di origine microbica o vegetale per la detossificazione degli inquinanti I SITU EX SITU applicazione a materiale organico (compost, residui organici del settore agroindustriale) utilizzato in sistemi biologici di bioprofilassi ambientale e decontaminazione. Biomassbed C ap ri, T revisan, ic e lli et al.,

27 GRAZIE PER L ATTEZIOE 27

28 Daniele Del Buono Antidoti e detossificazione dei fitofarmaci: una strategia possibile per la decontaminazione del sistema suoloiacqua 28

29 Antidoti e detossificazione dei fitofarmaci: una strategia possibile per la decontaminazione del sistema suolo/acqua D. Del Buono and L. Scarponi Dipartimento di Scienze Agroambientali e della Produzione Vegetale dell Università degli Studi di Perugia Borgo XX Giugno Perugia Detossificazione di erbicidi nei vegetali: - reazioni di ossidazione, riduzione o idrolisi - reazioni di coniugazione (glutatione, glucosio, amminoacidi) - compartimentalizzazione dei coniugati nei vacuoli o loro immobilizzazione su matrici cellulari (lignina, cellulosa ecc.) La capacità di detossificare un fitofarmaco è in stretta relazione con la capacità di alcuni enzimi di adattarsi al substrato xenobiotico. 29

30 Glutatione S - transferasi lfamiglia di enzimi che catalizzano la coniugazione di composti dannosi per la cellula con il glutatione Erbicida GSH GS-erbicida GST lproteine dimere risultanti dall associazione di sub-unità (25 3 KDa) GS-erbicida trasporto modificazione e sequestro lenzimi attivi nei confronti di substrati dotati di un sito elettrofilo (es. cloroacetanilidi e s-clorotriazine) Antidoti Recenti ricerche sulle interferenze dei fitofarmaci sul metabolismo dei vegetali hanno portato allo sviluppo di composti (antidoti) in grado di aumentare in maniera selettiva la capacità delle colture di tollerare i trattamenti erbicidali. 3

31 Buffer strips Zone non coltivate lasciate ai margini dei campi a protezione del sistema suolo/acqua da inquinanti (es. erbicidi); Possono essere rese più efficaci tramite inverdimento con adeguate essenze vegetali (buono sviluppo radicale, elevata capacità di assorbire acqua, adattabilità alle più differenti condizioni climatiche, ecc.); Possono essere potenziate tramite l uso di antidoti? 31

32 l Vegetale test: mais Oggetto della ricerca l Essenze vegetali scelte: Festuca arundinacea e Arabidopsis thaliana Callo e tessuti rigenerati in vitro da germogli di mais l Antidoto: benoxacor (B) O CH 3 C O CHCl 2 lerbicidi: terbutilazina (TBA) metolachlor (M) C(CH 3 ) 3 H Cl CH 2 CH 3 O CH 3 ClCH 2 C CH CH 2 OCH 3 H 3 C CH 2 CH 3 32

33 Scopo della ricerca l Gli antidoti (B) sono in grado di interferire nella detossificazione ione di cloro-triazine (TBA) e di cloroacetanilidi (M) nei vegetali scelti? In particolare: l Quale è la natura di questa interferenza nel mais, nella festuca e nell arabidopsis arabidopsis? lantidoti e fasce tampone possono essere un valido strumento di prevenzione o per la decontaminazione di siti inquinati? l La tecnica di rigenerazione in vitro può fornire ulteriori informazioni sul meccanismo d azione d degli antidoti e può consentire l ottenimento l di plantule maggiormente resistenti all azione azione erbicidale? Attività delle GST(CDB) del mais GST(CDB) activity (n mol sec -1 mg -1 protein) Hours after treatment untreated samples 2.33±.5 a 2.66±.3 a 2.49±.1 a 2.11±.2 a benoxacor-treated samples 2.4±.4 a,b 4.39±.2 b 2.9±.1 c 2.73±.2 c TBA-treated samples 1.86±.1 b 2.99±.3 a 2.1±.25 b 1.8±.7 b TBA + benoxacor-treated samples 2.8±.4 c 4.81±.2 c 2.73±.1 c 2.52±.2 c maize lb determina un incremento di attività dal 12% al 65% ltba determina un decremento di attività dal 14% al 2% l TBA + B determina un incremento di attività dal 1% al 4% 33

34 Parametri cinetici estratti proteici di mais mais V max (nmoli min -1 ) K M (mm) Controllo 44.±5. a 1.79±.3 a Campioni trattati con B 38.±1. a 1.34±.4 b l B non determina variazioni significative della Vmax l B determina una diminuzione della KM del 2% Profili elettroforetici di estratti proteici da mais 29 KDa 3 KDa 27 KDa 26 KDa 25 KDa Trattato con B Trattato con TBA Trattato con B Trattato con TBA Trattato con B Trattato con TBA 28.6±.78 S S S S S S 26.98±.98 21% S 122% S S S 26.7± % S 135% 118% 15% 135% lcontrollo = 1% lpi KDa 25 KDa 34

35 Attività delle GSTs del mais vs TBA e B GST(TBA) (nmol h -1 mg -1 protein) maize GST(benoxacor) (nmol h -1 mg -1 protein) maize untreated 2.28±.15 a 6.3±.2 a B-treated 4.21±.3 b 11.2±.5 b TBA-treated 2.72±.15 c 5.9±.2 a l i campioni di mais trattati con TBA manifestano un incrementata attività delle GST vs TBA (+19%) - autoinduzione l i campioni di mais trattati con B manifestano un incrementata attività delle GST vs TBA (+85%) l i campioni di mais trattati con B manifestano un incrementata attività delle GST vs B (+8%) l dai dati si deduce che le isoforme indotte da B presentano un elevata attività detossificativa vs TBA e B Accumulo e persistenza di TBA in germogli di mais 3,5 3 2,5 2 1,5 TBA TBA+B 1, hours after treatments lb determina una generale riduzione dei residui di TBA con un decremento dell accumulo massimo pari al 45% l B determina una riduzione di persistenza della TBA pari a 48 ore (su 168) 35

36 M ais: conclusioni l B è risultato capace di indurre l attività delle GST (CDB); lb ha determinato una diminuzione delle KM delle GST(CDB); lb ha determinato un aumento delle sub-unità di GSTs del mais, abbinata ad un aumento dell attività delle GST nei confronti sia dell erbicida che dell antidoto (GST vs TBA e B). lcome conseguenza delle azioni esplicate da B, sono state riscontrate diminuzioni dell accumulo e della persistenza della TBA nel mais Attività delle GST(CDB) della festuca GST(CDB) activity (n mol sec -1 mg -1 protein) festuca untreated samples 2.5±.5 a 2.49±.4 a 3.12±.5 a 3.5±.4 a benoxacor-treated samples 2.7±.3 a 2.94±.2 b 4.32±.2 b 3.9±..5 b TBA-treated samples 1.47±.2 b 2.71±.3 a,b 3.1±.3 a 3.27±.15 a TBA + benoxacor-treated samples 2.45±.22 a 2.56±.2 a 2.7±.1 a 3.35±.2 a,b lb determina un incremento di attività dal 18% al 39% ltba determina un decremento di attività del 41% l TBA + B non determina incrementi di attività rispetto al controllo 36

37 Parametri cinetici Festuca V max (nmoles min -1 ) K M (mm) Controllo 25.±1. a.541±.1 a Campioni trattati con B 23.±1. a.268±.22 b lb non determina variazioni significative della Vmax l B determina una diminuzione della KM del 5% Attività delle GSTs della festuca vs TBA e B GST(TBA) (nmol h -1 mg -1 protein) festuca GST(benoxacor) (nmol h -1 mg -1 protein) festuca untreated.91±.17 a 3.82±.2 a B-treated 1.36±.1 b 3.7±.24 a TBA-treated 1.9±.7 a 3.6±.1 a l i campioni di festuca trattati con B manifestano un incrementata attività delle GST vs TBA (+5%) l i campioni di festuca trattati con B non manifestano incrementi di attività delle GST vs B l dai dati si deduce che le isoforme indotte da B presentano un elevata attività detossificativa vs TBA 37

38 Accumulo e persistenza di TBA in germogli di festuca 1,2 1,8,6 TBA TBA+B,4, hours after treatments lb determina una generale riduzione dei residui di TBA con un decremento dell accumulo massimo pari al 52% l B determina una riduzione di persistenza della TBA pari a 48 ore (su 144) F estuca: conclusioni l B è risultato capace di indurre l attività delle GST (CDB); lb ha determinato una diminuzione delle KM delle GST(CDB); lb ha determinato aumento dell attività delle GST nei confronti dell erbicida (GST vs TBA). lcome conseguenza delle azioni esplicate da B, sono state riscontrate diminuzioni dell accumulo e della persistenza della TBA nella festuca 38

39 Attività delle GST(CDB) estratte da Arabidopsis thaliana GST(CDB) (nmoli s -1 mg -1 ) Pianta controllo Pianta trattata con B Coltura radicale controllo Coltura radicale trattata con B Coltura cellulare controllo Coltura cellulare trattata con B (1µM).11±.1 a.17±.1 b.12±.7 a.27±.4 b.98±.9 a 2.15±.15 c lb determina nella pianta un incremento di attività GST(CDB) del 54% lb determina nella coltura radicale un incremento di attività GST(CDB) del 125% lb determina nella coltura cellulare un incremento di attività GST(CDB) del 119% Attività delle GSTs, purificate per AC da sospensioni cellulari di Arabidopsis thaliana, vs CDB, M e B GST(CDB) (nmoli s -1 mg -1 ) GST(B) (nmoli h -1 mg -1 ) GST(M) (nmoli h -1 mg -1 ) Coltura controllo 97.6±2.2 a 5.4±.7 a 11.1±3. a Coltura trattata con B (1µM) 11.6±8.4 b 17.8±2.8 b 9.±2. a Coltura trattata con B (1µM) 123.8±4. b 27.2±2. c 26.4±3. b lb determina un incremento di GST(CDB) 13% (1µM) e 27% (1 µm) lb determina un incremento di GST(B) 229% (1µM) e 44% (1 µm) lb determina un incremento di GST(M) 138% (1 µm) 39

40 Persistenza di CDB, B e M in sospensioni cellulari di Arabidopsis benoxacor ore 4 ore 8 ore 24 ore on pretrattate 1% (93±2)% (83±8)% D Pretrattate con B 1% (52±4)% (28±2)% D CDB ore 4 ore 8 ore 24 ore on pretrattate 1% (11±2)% (1±1)% D Pretrattate con B 1% (9±1)% D D metolachlor ore 4 ore 8 ore 24 ore on pretrattate 1% 1% (89±11)% (66±1)% Pretrattate con B 1% (88±16)% (38±3)% (3±1)% Ogni valore è la meida di tre determinazioni ± SD Western blotting di proteine estratte da Arabidopsis thaliana Sei differenti classi di GSTs risultano coinvolte in stress biotici e abiotici KDa 66 KDa 31 KDa ZmGSTF1-2 TaGSTU KDa Delle sei classi di GST, sono risultate inducibili dall antidoto le seguenti: phi (GSTF) e tau (GSTU). 4

41 GRIFA Quad Seminari GRIFA 24-5 Analisi proteomica (MALDI-ToF MS) di GSTs inducibili dal benoxacor in Arabidopsis t. 8 AtGSTU AtGSTF kda AtGSTU4 AtGSTU8 12 AtGSTU kda 31 kda AtGSTF kda Caratterizzazione dei prodotti di coniugazione GSH benoxacor * ** a b c * *** *** ** Cromatogrammi HPLC per benoxacor standard (a), reazione di coniugazione non enzimatica (b) e reazione di coniugazione enzimatica (c). * = benoxacor; ** = coniugato GSH-benoxacor; *** = coniugato GSH-benoxacor-GSH A O Tris-HCl ph 8.8 OH - Cl O Cl B O O Cl - OH OH E O - H2O O O GS - D C O GS - GS-Benoxacor-SG OH O SG Meccanismo di reazione proposto per la formazione dei coniugati GSH - Benoxacor 41

42 A rabidopsis thaliana: conclusioni GST estratte da piante, da colture radicali e da sospensioni cellulari di Arabidopsis thaliana, manifestano un aumento di attività nei confronti di CDB, metolachlor e benoxacor in risposta a trattamento con B; La persistenza di CDB, benoxacor e metolachlor risulta considerevolmente ridotta in seguito al trattamento con B; lb induce in maniera specifica GSTs (classi tau e phi); lle GSTs indotte da B sono state sequenziate e caratterizzate, ed identificati i geni responsabili della loro espressione. ll addotto GSH-benoxacor è stato identificato e cartterizzato Tessuti rigenerati da callo di mais Rigenerazione in sospensione con o senza antidoto callogenesi su agar Rigenerazione su agar con o senza antidoto 42

43 Attività delle GSTs nel callo GST(CDB) mais = 2.4 nmol s -1 mg -1 GST(CDB) callo = nmol s -1 mg -1 V max (nmoles min -1 ) K M (mm) Mais 44.±5. a 1.79±.35 a Callo 18.±1. b 3.69±.2 b Tessuti rigenerati su agar Attività vs CDB per tessuti rigenerati su agar Controllo 9.22 a nmol s -1 mg -1 Rigenerato in presenza di B 17.2 b nmol s -1 mg -1 Attività specifica n moli mg -1 h -1 Controllo Trattato con B Controllo Trattato con B Controllo Trattato con B Controllo Trattato con B Benoxacor 1.35 a 1.65 b Terbuthylazine D D Metolachlor.94 a 1.95 b Fluorodifen D D 43

44 Tessuti rigenerati in sospensione Attività vs CDB per tessuti rigenerati in sospensione Controllo 1. a nmol s -1 mg -1 Rigenerato in presenza di B 12.5 b nmol s -1 mg -1 Attività specifica n moli mg -1 h -1 Controllo Trattato con B Controllo Trattato con B Controllo Trattato con B Controllo Trattato con B Benoxacor 1.8 a 2.5 b Terbuthylazine 3.26 a b Metolachlor 2.1 a 3.44 b Fluorodifen D D Tessuti rigenerati: conclusioni l Il callo ha manifestato un elevata attività GST (CDB); l I tessuti rigenerati su agar in presenza di B manifestano un incrementata attività delle GSTs vs CDB, B e M. li tessuti rigenerati in sospensione in presenza di B manifestano un incrementata attività delle GSTs vs CDB, B, M e TBA; 44

45 Considerazioni generali lei germogli di mais si è riscontrato un incremento dell attività detossificativa vs TBA in risposta a trattamento con B lle prove su vitroderivati di mais hanno evidenziato la presenza di attività transferasica e confermato l induzione dell attività delle GST da parte di B nei confronti di TBA e M li parametri cinetici e i profili elettroforetici hanno evidenziato la formazione di isoforme delle GSTs nel mais in risposta ai trattamenti con B leffetti analoghi a quelli sopra riportati per il mais sono stati osservati anche nella Festuca arundinacea e nell Arabidopsis thaliana lgli studi su Arabidopsis hanno portato all'identificazione dei geni codificanti per GSTs coinvolte nei suddetti processi di induzione Conseguenze lb si è rivelato un antidoto efficace nel proteggere il mais dall azione della TBA lfestuca arundinacea e Arabidopsis thalina, in virtù della loro risposta a trattamento con B, risultano potenzialmente utilizzabili nelle fasce tampone per prevenire l inquinamento del sistema suoloacque superficiali da cloroacetanilidi ed s-clorotriazine. 45

46 Hanno partecipato alle ricerche: lprof. Edwards R. University of Durham, UK Centre for Bioactive Chemistry lprof. Standardi e Dott. Micheli Università degli Studi di Perugia Dip. Arboricoltura e Protezione delle Piante l I dati presentati sono oggetto delle seguenti pubblicazioni: lrobert Edwards, Daniele Del Buono, Michael Fordham, Mark Skipsey, Melissa Brazier, David P. Dixon and Ian Cummins.Differential induction of glutathione transferases and glucosyltransferases in wheat, maize and Arabidopsis thaliana by herbicide safeners. Zeitschrift für aturforschung 25, 6-3/4 l Luciano Scarponi and Daniele Del Buono. Benoxacor induction of terbuthylazine detoxification in zea mays and festuca arundinacea. Journal of Agricultural and Food Chemistry 25, 53(7),

47 Marco icelli Un approccio per la riduzione della contaminazione delle acque. Biomassbed, due anni di sperimentazione in azienda 47

48 BIOMASSBED Prova di campo di un sistema biologico per la riduzione delle potenziali contaminazioni puntiformi Fonti di inquinamento delle acque 5% 25% 1% 4% 5% 5% 1% Deriva Ruscellamento Percolazione Volatilizzazione Drenaggio Contaminazioni puntiforme 6%? Contaminazioni Diffuse 4%? Aziendali Stade e ferrovie 48

49 Le contaminazioni puntiformi Riempimento botti Sversamenti accidentali Fitofarmaco residuo nelle botti, pompe e tubi Apparecchiature malfunzionanti Lavaggio e pulizia del sistema aspersore Eliminazione rifiuti e scarichi consentiti Contaminazione diretta Il Biomassbed Tralci di vite 4% Compost 4% Suolo 2% C 25,7%,9% C/ 28,7 Densità 525 g/l 49

50 Copertura Sist. irrigazione Pompa di riciclo ogni 4 ore per 15min 1,5 M Griglia metallica 1 M 1,5 M 3 M Volume max 4,5 m 3 Tessuto non tessuto Rete plastica Sabbia Biomass 1,6 m 3 Parametri dimensionali - Volume di lavaggio finale - Trattamenti (numero, volume) - Parco macchine (Trattori, botti) 5

51 51

52 52

53 AALISI Acque Biomassa Sedimento Fitofarmaci Zolfo 71% Rame 15% Organici 14% Zolfo 62,3% 24 Organici 27,2% Cu 1,4% 53

54 Organici 23 FEITROTHIO 7% MACOZEB 79% CIMOXAMIL CIPRODIIL FEITROTHIO FLUDIOXOIL FLUFEOXURO IPROVALICARB MACOZEB METALAXIL PECOAZOLO Organici 24 Mancozeb 86,9% Fludioxonil 1,2% Iprovalicarb,3% Penconazole,6% Clorpirifos 2,5% Metalaxyl 3,7% Fenitrotion 4,8% 54

55 Temperetura e altezza acque apr 12-giu 1-ago 2-set 9-nov 29-dic Temperatura C 23 Altezza acqua cm 23 Temperatura C 24 Altezza acqua cm carico 12,6 g abbattimento 1 % 24 carico 37,3 g abbattimento 99 % LoD,1 µg/l METALAXYL µg/l 23 µg/l 24 µg/l apr 12-giu 1-ago 2-set 9-nov 29-dic 17-feb 55

56 23 carico 4,8 g abbattimento 99,7 % 24 carico 6,4 g abbattimento 1 % µg/l PECOAZOLE µg/l 23 µg/l 24 LoD,1 µg/l 23-apr 12-giu 1-ago 2-set 9-nov 29-dic 23 carico 6,3 g abbattimento 1 % 24 carico 17,8 g abbattimento 1 % µg/l 1,4 1,2 1,8,6,4,2 CYPRODIIL µg/l 23 µg/l 24 LoD,1 µg/l 23-apr 12-giu 1-ago 2-set 9-nov 29-dic 17-feb 56

57 ppm 23 carico 419 g abbattimento 87 % 24 carico 385 g abbattimento 67 % 2, 18, 16, 14, 12, 1, 8, 6, 4, 2,, Rame Acque LoD 1 µg/l 2-mar 28-giu 6-ott 14-gen 23-apr 1-ago 9-nov 17-feb Rame nella biomassa ppm Iniziale finale 23 finale 24 57

58 BILACIO DI MASSA 23 RAME (419 g) biomassa 81% sedimenti 17% acqua 2% µg/l 23 carico 25 g abbattimento 1 % 4,5 4, 3,5 3, 2,5 2, 1,5 1,,5, CLORPYRIFOS µg/l 24 LoD,1 µg/l 23-apr 12-giu 1-ago 2-set 9-nov 29-dic 17-feb 58

59 Conclusioni 1) Alta efficienza - decontaminazione acque 86-1% 2) Possibilità di rilascio di acque in SWB già dopo i primi cicli (secondo il fitofarmaco) 4) Possibilità di usare la biomassa in agricoltura (secondo il fitofarmaco) 5) Il rame ha una diminuzione dell 87% nelle acque - il sedimento può essere riutilizzato? 6) uove opportunità di utilizzo del biomassbed come attrezzo per la certificazione di azienda ecocompatibile. 7) Un secondo anno sulla stessa biomassa può portare problemi quali accumulo di rame e minore permeabilità 59

60 Giovanna Boschin Relazione struttura e reattività in condizioni idrolitiche e fotochimiche di erbicidi solfonilureici 6

61 SEMIARIO GRIFA Milano, 17 dicembre 24 RELAZIOE STRUTTURA E REATTIVITA I CODIZIOI IDROLITICHE E FOTOCHIMICHE DI ERBICIDI SOLFOILUREICI Giovanna Boschin DISMA, Università degli Studi di Milano 1 SOLFOILUREE oggi 25 principi attivi in commercio elevata attività erbicida bassi dosaggi (2-1 g/ha) buona selettività nei confronti delle colture ampio spettro di impiego (cereali, riso, mais, barbabietola, soia, pomodori, patata) scarsa tossicità nei confronti dell uomo e degli animali (DL 5 > 4 mg/kg per via orale nel ratto) 2 61

62 Meccanismo d azione: blocco dell attività dell ALS Piruvato Piruvato ALS CO 2 Acetolattato α-chetobutirrato Piruvato ALS CO 2 Acetoidrossibutirrato Chetoisovalerato VALIA Isopropilmiristato LEUCIA ISOLEUCIA SITESI PROTEICA ACCRESCIMETO DELLE RADICI E DELLE PARTI AEREE DELLA PIATA 3 STRUTTURA GEERALE R 1 SO 2 H C H R 2 O Ponte solfonilureico (funzione attiva) Catena alifatica Gruppo aromatico Gruppo eterociclico Gruppo eterociclico contenente (pirimidina o triazina) 4 62

63 Meccanismi di degradazione in condizioni idrolitiche Rottura del ponte solfonilureico; esso è suscettibile all attacco di H 2 O (o di OH - a ph elevati) sul gruppo CO con formazione di CO 2, arilsolfonammide e ammina eterociclica O- e -dealchilazione dei sostituenti su R 2 Apertura dell anello triazinico Idrolisi di gruppi estere Contrazione-riarrangiamento del ponte solfonilureico Rottura del legame -CH 3 dell dell urea (tribenuron-methyl) La degradazione (velocità e pool di prodotti di idrolisi) dipende da: Temperatura ph della soluzione Struttura chimica 5 GRUPPO (a) H 3 C O 2 S H 3 C O CH 2 SO 2 H Amidosulfuron H OCH 3 OCH 3 COOCH 3 O SO 2 H H Sulfometuron-methyl CH 3 CH 3 COOCH 3 CH 2 SO 2 H COOCH 2 CH 3 SO 2 COOCH 3 SO 2 H H O O O H H H Bensulfuron-methyl Chlorimuron-ethyl Primisulfuron-methyl OCH 3 Cl OCHF 2 OCHF 2 OCH 3 OCH 3 Cl H CH 3 COOCH 3 SO 2 H O H Halosulfuron-methyl SO 2 Cl SO 2 COOCH 2 CH 3 Sarmah and Sabadie, J. Agric. Food Chem. 22, H H O O Imazosulfuron H Pyrazosulfuron-ethyl H OCH 3 OCH 3 OCH 3 OCH 3 OCH 3 6 OCH 3 63

64 GRUPPO (a): Solfoniluree con R 1 diverso da anello piridinico e R 2 diverso da anello triazinico Il principale meccanismo di degradazione è l idrolisi del gruppo solfonilureico con formazione dell ammina eterociclica (R 2 -H 2 ) e della solfonammide (R 1 -SO 2 -H 2 ) Un altro meccanismo, che avviene a ph basici, è l drolisi del gruppo estere rilevato per bensulfuron-methyl, chlorimuron-ethyl, primisulfuron-methyl, sulfometuron-methyl 7 Esempio di chlorimuron-ethyl COOCH 2 CH 3 O OCH 3 SO 2 H idrolisi H Cl saponificazione ph>1 ph<8 COOH O OCH 3 OCH 3 SO 2 H H H 2 Cl + COOCH 2 CH 3 SO 2 H 2 ciclizzazione CO H Cl Sabadie, Weed Res., 1995, 33-4 e SO 2 saccarina 8 64

65 Cl O OCH 3 GRUPPO (b) CH 2 CH 2 CF 3 O OCH 3 SO 2 H H SO 2 H H Chlorsulfuron Prosulfuron OCH 2 CH 2 OCH 3 O SO 2 H H Cinosulfuron CH 3 OCH 3 OCH 2 CH 2 Cl O SO 2 H H Triasulfuron COOCH 3 O OCH 3 CH 3 CH 3 OCH 3 CH 3 SO 2 H COOCH 3 O SO 2 H H Ethametsulfuron-methyl OCH 2 CH 3 HCH 3 COOCH 3 SO 2 CH 3 Tribenuron-methyl O H H CH 3 OCH 2 CF 3 COOCH 3 O OCH 3 CH 3 Triflusulfuron-methyl (CH 3 ) 2 SO 2 H H S COOCH 3 OCH 3 O Metsulfuron-methyl CH 3 SO 2 H H Thifensulfuron-methyl Sarmah and Sabadie, J. Agric. Food Chem. 22, CH 3 GRUPPO (b) Solfoniluree con R 2 uguale ad anello triazinico Il meccanismo principale è l idrolisi del ponte solfonilureico A ph acidi, può avvenire la demetilazione dell OCH 3 dell anello triazinico e la successiva apertura dell anello stesso con formazione di un acetil-triureto. Questo è stato osservato per chlorsulfuron, metsulfuron-methyl, prosulfuron, triasulfuron, thifensulfuronmethyl. 1 65

66 Esempio di chlorsulfuron O S H O C O Cl O-demetossilazione O O S H C H H OCH 3 CH 3 OH idrolisi H 2 + O S H 2 O Cl OCH 3 Cl O CH 3 CH 3 11 Reiser et al., J. Chromatog., 1991, O O O O O S H C H C H C H C CH 3 O Cl 1 H-MR (DMSO, 3 MHz) Zanardini, Boschin et al., Annals of Microbiology, 22,

67 Esempio di triflusulfuron-methyl CH 3 O O (CH 3 ) 2 CH 3 O S H C H S H 2 O COOCH 3 OCH 2 CF 3 O COOCH 3 + (CH 3 ) 2 Identificazione tramite LC-MS (ESI) H 2 OCH 2 CF 3 Vega et al., J. Agric. Food Chem., 2, Boschin et al., Proceedings of XII Symposium Pesticide Chemistry, 23, GRUPPO (c) CF 3 O OCH 3 SO 2 CH 2 CH 3 O OCH 3 SO 2 H H SO 2 H H Flazasulfuron OCH 3 Rimsulfuron OCH 3 F 3 C COOCH 3 O SO 2 H H Flupyrsulfuron-methyl OCH 3 OCH 3 F 3 C CO(CH 3 ) 2 O SO 2 H H icosulfuron OCH 3 OCH 3 14 Sarmah and Sabadie, J. Agric. Food Chem., 22,

68 GRUPPO (c) Solfoniluree con R 1 uguale ad un anello piridinico (piridin-2-solfoniluree) La rottura del ponte solfonilureico è una via di degradazione secondaria Avviene la contrazione-riarrangiamento del gruppo solfonilureico. Questo meccanismo è stato scoperto con rimsulfuron; successivamente confermato per flupyrsulfuronmethyl e flazasulfuron mentre per nicosulfuron prevale l idrolisi. La posizione 2 della piridina viene attaccata dall dell urea, si ha eliminazione di SO 2 a formare il prodotto di contrazione del ponte che, in ambiente basico, idrolizza a piridinil-pirimidinil ammina. 15 Esempio di rimsulfuron SO 2 -CH 2 -CH 3 SO 2 H O C H OCH 3 Meccanismo della reazione di contrazioneriarrangiamento del ponte solfonilureico OCH 3 - SO 2 CH 3 CH 2 O H 2 SO 2 OCH 3 CH 3 CH 2 SO 2 H OCH 3 - CO 2 - H 3 OCH 3 Prodotto di contrazione del ponte; prevale a ph 5 OCH 3 piridinil-pirimidinil ammina; prevale a ph 7 e 9 Schneiders et al., J. Agric. Food Chem. 1993,

69 Esempio di flupyrsulfuron-methyl COOCH 3 O OCH 3 SO 2 H H F 3 C contrazione OCH 3 O COOCH 3 O H F 3 C H 2 F 3 C ciclizzazione O H 3 CO OCH 3 H 3 CO OCH 3 17 Singles et al., Pestic. Sci. 1999, H 3 C O S O H O C Studi di stabilità AZIMSULFURO H OCH 3 CH 3 OCH 3 Gulliver Risaia Dose: 2-3 g/ha Modo d azione: assorbimento fogliare e traslocazione sistemica ph k. 1-3 (d -1 ) R t 1/2 (d)

70 Ambiente acido H 3 C O O OCH 3 S O H C H H 3 C CH 3 O S O 1 H 2 + CH 3 OCH 3 H 2 Rottura ponte solfonilureico 2 OCH 3 OCH 3 19 H 3 C O S H Ambiente basico OCH 3 O C H Rottura ponte solfonilureico O CH 3 OCH 3 H 3 C Contrazione ponte solfonilureico LC-MS ESI POSITIVO E EGATIVO ESPERIMETI LC/MS n 3 OCH 3 SPETTROSCOPIA 1 H-MR SPETTROSCOPIA 13 C-MR H CH 3 OCH 3 Boschin et al. Proceedings of XII Symposium Pesticide Chemistry 23,

71 Conclusioni Azimsulfuron in virtù della sua reattività può essere inserito nel gruppo (c) dato che presenta il meccanismo di contrazioneriarrangiamento del ponte a ph basici come le altre piridin-2- solfoniluree GRUPPO (c) Flazasulfuron Rimsulfuron Flupyrsulfuron-methyl Azimsulfuron Sulfosulfuron 21 SO 2 CH 2 CH 3 SO 2 H O H OCH 3 Sulfosulfuron Saha and Kulshrestha, J. Agric. Food Chem., 22, OCH 3 GRUPPO (a) Cl O SO 2 H H OCH 3 Imazosulfuron Morrica et al., J. Agric. Food Chem., 21, OCH 3 Cl COOCH 3 OCH 3 COOCH 2 CH 3 O O CH 3 SO 2 H H H SO 2 H Halosulfuron-methyl OCH 3 H Pyrazosulfuron-ethyl 22 OCH 3 OCH 3 71

72 Meccanismi degradativi Condizioni fotochimiche rottura del ponte solfonilureico desolfonilazione via rottura del legame C-S (soprattutto con sostituenti OR in orto) o del legame -S O R 1 SO 2 H C C-S -S O H R 2 O HO SO 2 H C H R 2 H 2 C H R 2 O-demetilazione dell OCH 3 triazinico O-dealchilazione di sostituenti aromatici 23 Esempio di triasulfuron (in H 2 O a 254 nm) OCH 2 CH 2 Cl OCH 3 SO 2 H 2 + H 2 CH 3 OH SO 2 H O H OCH 3 OCH 2 CH 2 Cl O OCH 3 CH 3 SO 2 H H CH 3 OCH 2 CH 2 Cl SO 2 H O H OH C-S cleavage -S cleavage O OCH 3 O OCH 3 CH 3 HO O 2 S H C H H 2 C H CH 3 CH 3 Pusino et al., Pestic. Sci., 1999, Vulliet et al., J. Agric. Food Chem., 22,

73 Esempio di cinosulfuron OCH 2 CH 2 OCH 3 O OCH 3 SO 2 H H C-S -S CH 3 O OCH 3 O OCH 3 HO SO 2 H H H 2 triazinsulfonic-urea acid λ>29 nm CH 3 H triazinurea λ<29 nm CH 3 25 Vulliet et al., J. Photochem. Photobiol. A: Chemistry, 24, Conclusioni I sostituenti influenzano il cammino degradativo sia per quanto riguarda la velocità, sia la struttura dei prodotti che si formano in condizioni idrolitiche e fotochimiche. I fenomeni non-biologici contribuiscono solo in parte alla degradazione di questi erbicidi nell ambiente. E necessario considerare anche il ruolo dei microrganismi

74 GRAZIE A Organizzatori del seminario Prof.ssa Anna Arnoldi Dipartimento di Scienze Molecolari Agroalimentari (DISMA) Facoltà di Agraria Università degli Studi di Milano Dott.ssa Sheila Morandi Dott.ssa Donatella Resta Dott.ssa Alessandra D Agostina Dott.ssa Cristina Antonioni Dott.ssa Daniela Locati 27 74

75 Johann Santer La chimica analitica e curve di degrado del proesadione calcio (Prohexadione Calcium) 75

76 Chimica analitica del prohexadione calcio Curve di degrado Johann Santer, Centro di Sperimentazione Agraria e Forestale Laimburg, I-394 Ora Svolgimento della presentazione rivista di diversi metodi recuperi curve di degrado 76

77 Forumula strutturale della molecola... CH 3 CH 2 O C O O O C O Ca Alcuni dati, tratti dal Pesticide Manual... OMECLATURE prohexadione-calcium IUPAC name calcium 3-oxido-5-oxo-4-propionylcyclohex-3-enecarboxylate Chemical Abstracts name calcium 3,5-dioxo-4-(1-oxopropyl)cyclohexanecarboxylate CAS R [ ] Development codes KUH 833; KIM-112 (both Kumiai); BX-112 (Ihara); BAS 125 W (BASF) prohexadione Common name prohexadione (BSI, draft E-ISO) IUPAC name 3,5-dioxo-4-propionylcyclohexanecarboxylic acid Chemical Abstracts name 3,5-dioxo-4-(1-oxopropyl)cyclohexanecarboxylic acid CAS R [ ] PHYSICAL CHEMISTRY prohexadione-calcium Composition Tech. is >89%. Mol. wt M.f. C1H1CaO5 Form Odourless, fine white powder. M.p. >36 ºC V.p mpa (2 C) KOW logp = -2.9 Henry Pa m3 mol-1 (calc.) S.g./density 1.46 Solubility In water 174 mg/l (2 ºC). In methanol 1.11, acetone.38 (both in mg/l, 2 C). Stability Stable in water; DT5 (2 C) 5 d (ph 5), 83 d (ph 9). Stable to heat (2 C). Stable in sunlight in water, DT5 4 d. pka 5.15 prohexadione Mol. wt M.f. C1H12O5 77

78 Applicazioni,... COMMERCIALISATIO History Reported by Kumiai Chemical Industry Co., Ltd (Y. Toyokawa et al., Proc. Ann. Meeting Soc. Chem. Regul. Pl. (Jap.), 68 (1987) and T. Miyazawa et al., Proc. Br. Crop Prot. Conf. - Weeds, 3, 967 (1991)). The calcium salt (1:1) developed by Kumiai Chemical Industry Co., Ltd and Ihara Chemical Industry Co., Ltd. Introduced in Japan in Patents EP 1231; US Manufacturers Ihara/Kumiai APPLICATIOS Biochemistry Inhibits 3b-hydroxylation of GA2 to GA1 in gibberellin biosynthesis. The reduced level of gibberellins leads to growth retardation of plants. Mode of action Plant growth regulator and retardant. Foliar applied and absorbed via green tissue; translocated basipetally, as well as acropetally, within plants. Uses As an anti-lodging agent in small grain cereals ( kg/ha). Also could be used as a growth retardant in turf (.2-.4 kg/ha), peanuts (.1-.3 kg/ha), flowers (.5-.1 kg/ha); and to inhibit new twig elongation of fruit trees (.2-.4 kg/ha) Formulation types SC; WP. Selected products: 'Viviful' (Kumiai) OTHER PRODUCTS prohexadione-calcium 'Apogee' (BASF); 'Baseline' (BASF, Kumiai, Ihara); 'Regalis' (BASF) mixtures: 'Médax' (+ mepiquat chloride) (BASF) AALYSIS Product and residues by hplc. Details available from Kumiai. MAMMALIA TOXICOLOGY prohexadione-calcium Oral Acute oral LD5 for rats and mice >5 mg/kg. Skin and eye Acute percutaneous LD5 for rats >2 mg/kg. Slightly irritating to eyes; not irritating to skin (rabbits). Inhalation LC5 (4 h, whole body) for rats >4.21 mg/l air. OEL (2 y) for male rats 93.9, female rats 114, male mice 279, female mice 351 mg/kg b.w. daily; (1 y) for male and female dogs 8 mg/kg b.w. daily. Other on-mutagenic, nonteratogenic (rats and rabbits). ECOTOXICOLOGY prohexadione-calcium Birds Acute oral LD5 for bobwhite quail and mallard ducks >2 mg/kg b.w. Dietary LC5 (5 d) for bobwhite quail and mallard ducks >52 mg/kg diet. Fish LC5 (96 h) for carp >15 ppm, rainbow trout and bluegill sunfish >1 mg/l. Daphnia LC5 (48 h) for D. carinata >15 mg/l; EC5 for D. magna 9 ppm. Algae EC5 (12 h) for Selenastrum capricornutum >1 mg/l. OAEC/OAEL for Skeletonema costatum and Selenastrum capricornutum 1.1, Anabaena flos-aquae 1.2 ppm. Other aquatic spp. EC5 for eastern oyster 117, Lemna gibba and avicula pelliculosa 1.2 ppm; OAEC for mysid shrimp 125 ppm; Bees LD5 (oral and contact) >1 mg/bee. Worms LC5 (14 d) for Eisenia foetida >1 mg/kg soil. Determinazione diretta... 78

79 Comunque la determinazione diretta tramite GC è difficile perchè: Trattandosi di un composto polare, i picchi sono asimmetrici Il limite di sensibilità è alto Il metodo semplice non ha funzionato (estrazione acetone/acqua,aggiungere acido, ripartizione con diclorometano) Derivatizzazione: silanizzazione Francesco Bartolozzi et al., Journal of Chromatography A 758 (1997), Prohexadione Calcium viene sciolto in 5% EtOH aggiungendo.1m imidazolo tampone ph 7, aliquota viene portata a secco in corrente d aria Si riprende con 4 µl piridina, 2 µl esametildisilazane (HMDS) e 1 µl trimetilclorosilane (TMCS) si porta a 6 C per due ore. si lascia raffreddare e si inietta 79

80 un cromatogramma del prohexadione silanizzato... cromatogramma prohexadione metilato... 8

81 lo spettro di massa del prohexadione metilato... Yagi (Kumiai) già nel 1991 pubblicò un metodo... 81

82 pubblicato, con più dettaglio, nel Il metodo propone... estrazione mediante una miscela di 6 ml acetone e 2 ml acido solforico 1 primo clean up tramite repartizione (MeOH/ cloroformio 3/1) clean up tramite scambiatore ionico DEAE, dietilaminoetildestrano, uno scambiatore anionico, eluendo con tampone ph 7.7 si aggiungono 2. ml acido solforico, si estrae con cloroformio/meoh 3/1, si evapora il solvente si riprende con 5mL MeOH, si porta in un pallone, si aggiungono 5 µl acido solforico conc. e si riflussa a 75 C per 1 h si lascia raffreddare, si aggiungono 2mL acqua e si estrae 2 volte con 2 ml diclorometano ulteriore clean up con ODS, 5g, eluendo con n-esano, benzene, MeOH 8/2/.4 determinazione finale con HPLC/UV-Vis a 274 nm 82

83 Il metodo Yagi pare complicato: Il clean up è estremamente laborioso e lungo il clean up pare esagerato due cromatografie a colonna (scambio ionico più ODS) più diversi passi fase acquosa-fase organica in funzione del ph non è chiaro perchè viene scelto HPLC come determinazione finale per la cromatografia liquida non deve neanche essere derivatizzato il prohexadione La documentazione è buona, così Yagi dice che dopo 12h a temperatura ambiente i recuperi sono identici con la versiona con bollitura a riflusso Yagi dice che il prohexadione in acqua non passa in n- esano p.htm Prohexadione calcium Apples BASF D968 (1,88 KB) 1/13/1997 GC/MSD.5 Prohexadione calcium Beef Kidney BASF D968 (1,88 KB) 1/13/1997 GC/MSD.5 Prohexadione calcium Peanut utmeat BASF D961 (1,49 KB) 11/12/1996 GC/MSD.5 83

84 Il metodo di registrazione tedesco prevede... estrazione (terreno,25g) con 12 ml acetone e 4 ml 1 acido solforico, si agita per 3 minuti, filtrare, lavare con 8mL acetone Si concentra a 45 ml, si aggiunge 15 ml 6 acido solforico, si diluisce a 65 ml con acqua, si estrae 3 x con 2,2,1mL etile acetato si asciuga con sodio solfato anidro, si estrae con una miscela di 2 ml tampone di fosfato ph 7 e 5mL 2 aoh ed altre due volte con tampone di fosfato ph 7 le fasi acquose vengono riunite, si addiziona 3.8 ml acido solforico concentrato, si estrae 3x con 6 ml etile acetato si asciuga con sodio solfato anidro, si porta a secco si rprende con 4 ml MeOH, si addizionano 5 µl acido solforico concentrato, si fa ebollire con refrigerante a ricadere per 1 h a 75 C si addizionano 8mL di acqua e si estrae 3x con 1mL diclorometano la fasi di diclorometano unite vengono asciugate con sodio solfato anidro, si porta a secco, si trasferisce in un pallone con diclorometano, si porta a secco si addizionano 3 ml di MeOH e 15 µl cicloesilammina si fa bollire con refrigerante a ricadere per due ore a 75 C si addizionano 12 ml di acido cloridrico.1 si porta a ph 1-2 con acido cloridrico 1 si estra 3x con 12 ml diclorometano si asciuga con sodio solfato anidro si evapora il solvente clean up con colonnina gel di silice, e si eluisce con n-esano/etile acetato 4/1, viene collezionata la frazione 7-18 ml si porta a secco, si riprende con 2mL di acetone si procede alla determinazione finale mediante GC-MS metodo di casa g di materiale vengono estratti con 2 ml di una miscela acetonitrile/1.5 acido solforico, si filtra, si porta a volume (25 ml) con acetonitrile Si porta la metà dell estratto grezzo in un pallone da 5 ml, si evapora l acetonitrile, si aggiungono 5 ml acido solforico concentrato e 1 ml metanolo si fa bollire con refrigerante a ricadere per due ore si lascia raffreddare, si estrae 3 volte con diclorometano 5 ml si riuniscono gli estratti organici, si filtra su sodio solfato anidro e si porta a volume e si inietta. 84

85 alberi di Fuji su M9, trattati con 5g/hL 1% Prohexadione- Ca il campionatura ogni 14 giorni 1 mele all altezza degli occhi 1 foglie, sempre la 3. o 4. foglia di un germoglio 85

86 risultati su mela... curva di degrado del prohexadione, trattato il residuo di prohexadione, mg/kg ; 5,25 7; 2,43 13; 1,23 24;,36 3;,5 38; 1,31 44;,651; 65; 73; giorni dopo il trattamento risultati su foglie... curva di degrado del prohexadione su foglie 25 mg/kg prohexadione ; ; 1,75 24; 37; 44; 51; 56; 65; 73; 74; 81; giorni dopo il trattamento 86

87 COCLUSIOI la misurazione tramite GC-MS dell estere metilico del prohexadione metilato è il metodo più accurato tra quelli provati su foglie il degrado avviene molto velocemente, forse perchè il prohexadione viene metabolizzato GRAZIE: si ringrazia il reparto Fisiologia delle Piante del Centro Laimburg, specialmente il p.a. Josef Vigl 87

88 Rosanna Gatti Valutazione del rischio di esposizione dermica a fitofarmaci nelle coltivazioni ortofrutticole in serra 88

89 Valutazione del rischio di esposizione dermica a fitofarmaci nelle coltivazioni ortofrutticole in serra Rosanna Gatti EEA C.R. Casaccia BIOTEC/SIC Coltura Principi attivi 23 acrinathrin azoxystrobin chlorpyrifos ethyl azoxystrobin fenarimol metalaxyl Principi attivi 24 metalaxyl azoxystrobin chlorpyrifos ethyl tetradifon Rosanna Gatti - EEA 2 89