Tabella 1. Vantaggi della misurazione della frazione di monossido di azoto nell aria espirata (F E NO) (15-17). Metodica non disponibile ovunque

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1 Misurazione del monossido di azoto nell'aria espirata: una metodica non-invasiva validata per la valutazione ed il monitoraggio terapeutico dell'infiammazione respiratoria Prof. Paolo Montuschi Dipartimento di Sanità Pubblica, Unità Operativa Complessa di Farmacologia Farmacologia Clinica, Policlinico Gemelli, 3 piano, Piastra Tecnologica Polifunzionale, stanza J308m Tel.: ; fax: Tel. cellulare: pmontuschi@rm.unicatt.it Introduzione Il respiro è una matrice biologica costituita da una fase gassosa, contenente monossido di azoto (NO), monossido di carbonio e composti volatili, e da una fase liquida, il condensato del respiro, costituita principalmente da vapore acqueo ma contenente anche particelle aerosoliche nelle quali sono state identificate numerose biomolecole, come leucotrieni, prostalandine, F2-isoprostani, adenosina, trombossano, che svolgono un ruolo importante nella fisiopatologia delle malattie respiratorie (1-4). NO è sintetizzato mediante l azione di enzimi, le nitrossido-sintasi (NO-sintasi), attraverso l ossidazione della L-arginina a L-citrullina (5). Ubiquitario nell organismo, questo gas è prodotto da vari tipi di cellule nel sistema respiratorio, come le cellule epiteliali bronchiali, le cellule endoteliali e le cellule infiammatorie, e ha importanti effetti fisiologici (ad es., broncodilatazione) e patologici (ad es., infiammazione) (5). La prima descrizione della presenza di NO endogeno nell aria esalata risale al 1991 (6). In seguito, diversi studi hanno dimostrato che adulti e bambini con asma hanno, rispetto a soggetti sani di controllo, un aumento delle concentrazioni di NO nell aria espirata (7-9) che si riducono dopo terapia con glucocorticoidi (10). Elevati valori di NO nell aria espirata, sono stati anche descritti in soggetti allergici, con o senza asma. Alcuni studi hanno evidenziato un aumento delle concentrazioni di NO nell aria espirata in pazienti con broncopneumopatia cronica ostruttiva (BPCO) (11,12) e malattie interstiziali polmonari (13,14), anche se, generalmente, l aumento è di minore entità rispetto a quello osservato in soggetti asmatici. In soggetti asmatici non in terapia con glucocorticoidi, le concentrazioni di NO nell aria espirata sono correlate con la conta degli eosinofili nell espettorato indotto, una misura diretta di infiammazione delle vie aeree, e con la iperreattività bronchiale, una caratteristica dell asma (15). La misurazione del monossido di azoto nell aria espirata, più propriamente della frazione del monossido di azoto nell aria espirata (fraction of exhaled nitric oxide, F E NO), come spiegato in seguito, è una metodica non-invasiva, standardizzata, validata ed ampiamente accettata per la valutazione ed il monitoraggio terapeutico dell infiammazione respiratoria come indicato dalle linee guida sulla misurazione del F E NO dell American Thoracic Society (ATS) e European Respiratory Society (ERS) (16,17). Questa metodica, utile soprattutto, ma non esclusivamente, nei pazienti con asma, è parte della respiromica (breathomics), una nuova omica basata sull analisi molecolare del respiro mediante metodiche analitiche altamente specifiche e sensibili. Con il suo percorso dalla

2 1 dimostrazione della presenza dell NO nell aria espirata nell uomo (6) alla approvazione di un analizzatore di F E NO per uso clinico da parte della Food and Drug Administration (FDA) (18), la misurazione del F E NO è un esempio paradigmatico di traslazione delle conoscenze dalla ricerca di base alla clinica. Vantaggi e svantaggi della misurazione del F E NO sono riassunti in Tabella 1. Attualmente, questa metodica è compresa routinariamente nella valutazione diagnostica e nel monitoraggio della terapia farmacologica di pazienti con asma nei principali centri ospedalieri statunitensi ed europei (16,17). Tabella 1. Vantaggi della misurazione della frazione di monossido di azoto nell aria espirata (F E NO) (15-17). Vantaggi Svantaggi Standardizzata Non invasiva Riproducibile Test di breve durata, fornisce risultati immediati Approvata in clinica F E NO correla con infiammazione eosinofila ed iper-reattività bronchiale prima della terapia con glucocorticoidi Analizzatori di F E NO relativamente costosi Metodica non disponibile ovunque Misurazione con tecnica del a respiro singolo difficile in bambini di età pre-scolare Valuta solo una componente della risposta infiammatoria F E NO non correla con la gravità dell asma Valori di F E NO modificati da diversi fattori (ad es., allergia, polimorfismi genici, età, genere, fumo di sigaretta, infezioni respiratorie, dieta) Utile nella diagnosi di asma Utile nello screening per asma F E NO è predittivo di riacutizzazioni di asma Utile nel monitoraggio della risposta alla terapia farmacologica anti-infiammatoria nell asma Utile per la valutazione ed il monitoraggio della compliance farmacologica Origine del monossido di azoto nell aria espirata NO è prodotto da cellule residenti delle vie aeree, come le cellule epiteliali bronchiali, le cellule endoteliali e le cellule infiammatorie, per azione di tre isoenzimi, le nitrossido-sintasi (NOS), che sono responsabili dell ossidazione della L-arginina a L-citrullina con formazione di NO (5). Le NOS costitutive (cnos) comprendono la NOS neuronale (NOS1) e la NOS endoteliale (NOS3) che producono piccole quantità di NO che hanno probabilmente un ruolo regolatorio locale nella

3 2 neurotrasmissione (NOS1) o del flusso ematico (NOS3) (5). La NOS inducibile (NOS2) non è espressa costitutivamente nelle cellule ma è indotta da stimoli infiammatori o di tipo infettivo (5). L attività enzimatica NOS2 produce grandi quantità di NO che hanno un effetto pro-infiammatorio. L aumento di NO nell aria espirata osservato in persone con asma deriva verosimilmente dall aumento dell espressione della NOS2 nelle vie aeree (5). Comunque, NO misurato nell aria espirata può derivare in parte dall attività delle cnos (5). La NOS3 è espressa nelle cellule endoteliali dei vasi bronchiali e polmonari dove, mediante l effetto vasodilatatore dell NO, svolge un ruolo nella regolazione del flusso ematico (19). NOS3 è anche espressa nelle cellule endoteliali dei capillari alveolari dove può ridurre la permeabilità capillare (20) e nelle cellule epiteliali bronchiali lungo tutto il tratto respiratorio dove regola il battito ciliare e, pertanto, la clearance muco-ciliare (21). In modelli sperimentali animali, alterazioni funzionali della NOS3 contribuiscono alla iper-reattività bronchiale (21), la caratteristica funzionale dell asma. La NOS1 si trova nelle fibre colinergiche delle vie aeree (22). NO prodotto dall attività enzimatica NOS1 ha effetto broncodilatatore, contribuendo alla trasmissione inibitoria non adrenergica non colinergica nelle vie aeree (22). L arginasi, la cui attività enzimatica è aumentata nell asma, riduce la sintesi di NO dovuta a NOS1, aumentando, pertanto, la broncocostrizione neurogena (23). NOS1 è anche espressa nelle cellule epiteliali bronchiali e negli pneumociti di tipo 1 (5). L espressione di NOS2 è aumentata nelle cellule epiteliali bronchiali di persone con asma e si riduce in seguito a terapia con glucocorticoidi inalatori (24). Inibitori selettivi della NOS2 riducono le concentrazioni di F E NO in persone con asma ed in soggetti sani (25-27), ma hanno minore effetto in pazienti con BPCO, un dato che indica che, in queste persone, NO deriva da NOS1 oltre che da NOS2 (5). Metodologia Diversi analizzatori di NO nell aria espirata sono disponibili in commercio. Due di essi, NIOX e NIOX MINO (Aerocrine, Solna, Svezia), sono stati approvati per uso clinico dalla FDA per la valutazione dell infiammazione delle vie aeree in pazienti con asma ed altre patologie respiratorie (18,28). NIOX è un analizzatore da banco ed è stato il primo analizzatore di NO nell aria espirata ad essere stato approvato per uso clinico nel 2000 in Europa e nel 2003 negli Stati Uniti (18). Questo sistema di monitoraggio delle concentrazioni di F E NO è stato sviluppato per facilitare la misura on-line a flusso costante. Il sensore dell NO del NIOX, come quello di altri analizzatori, si basa su una reazione di chemiluminescenza che richiede la presenza di ozono. NO, contenuto nel campione di aria espirata è immesso nella camera di reazione dell analizzatore dove reagisce con elevate concentrazioni di ozono generate dall analizzatore stesso (18) secondo la reazione: NO + O 3 NO 2 + O 2 + fotone Questa reazione produce ossigeno, biossido di azoto ed emissione di fotoni (chemiluminescenza) rilevati da un tubo fotomoltiplicatore (fotodetettore) che genera un voltaggio linearmente proporzionale alla concentrazione di NO presente nel campione di aria espirata (18). L intensità della emissione di luce è, pertanto, proporzionale alla concentrazione NO nell aria espirata (18). L analizzatore NIOX ha un elevata sensibilità (2 ppb) che lo rende adatto alla misurazione di concentrazioni di NO nel respiro (18). Per agevolare l espirazione a flusso costante, requisito essenziale per ottenere valori di F E NO riproducibili, l analizzatore ha al suo interno un

4 3 sistema di controllo dinamico del flusso aereo che adatta il flusso a variazioni di pressione di apertura delle vie aeree e consente di monitorare i parametri espiratori in modo da garantire conformità della misurazione con le linee guida (18). Uno pneumotacografo all interno dell analizzatore consente di monitorare il flusso aereo espiratorio durante l esecuzione del test in modo da mantenerlo costante o, comunque, entro valori predeterminati (18). NIOX MINO, l altro analizzatore di FENO approvato dall FDA per uso clinico in pazienti con asma ed altre patologie respiratorie (28), è uno strumento portatile che contiene al suo interno un sensore elettro-chimico che, a contatto con l NO contenuto nell aria espirata, rileva variazioni di corrente o di potenziale proporzionali alla concentrazione dell NO nel campione biologico (elettro-analisi) (28). Anch esso, come NIOX ed altri analizzatori, consente la misurazione on-line dell NO nell aria espirata. Le misure ottenute mediante NIOX MINO e NIOX, questo ultimo considerato l analizzatore di riferimento in quanto adotta la metodica gold standard nell analisi dell NO nell aria espirata, sono del tutto riproducibili (29). Nella misurazione on-line del FENO, il campionamento dell aria esalata mediante l analizzatore di NO avviene in maniera continua (16) (Figura 1). A) B) Figura 1. Misurazione del FENO mediante analizzatore NIOX (A) e NIOX MINO (B). Pertanto, l andamento nel tempo di parametri come velocità di flusso espiratorio e pressione, che è necessario mantenere costanti all interno di intervalli predeterminati per tutta la durata del test, ed il profilo delle concentrazioni di FENO sono osservabili in tempo reale (16). Per eseguire la misurazione on-line del FENO, si chiede alla persona di compiere una inspirazione completa con la bocca attraverso un boccaglio fino a capacità polmonare totale e di espirare immediatamente, sempre attraverso il boccaglio, cercando di mantenere una velocità di flusso espiratorio di 50 ml/sec mediante l ausilio di un segnale visivo (ad es., una mongolfiera o la lancetta di un contachilometri), che compare sullo schermo dell analizzatore (16), come spiegato dal medico prima dell inizio del test. La durata del test è di 10 secondi, tempo necessario al raggiungimento del plateau delle concentrazioni di FENO nell aria espirata (16). Per ottenere misure standardizzate e riproducibili di NO proveniente dalle vie respiratorie inferiori è necessario mantenere la velocità del flusso espiratorio ad un valore costante ed escludere la contaminazione dell NO prodotto a livello

5 4 nasale (16). I valori di F E NO sono flusso-dipendenti, in quanto la diffusione dell NO nel lume bronchiale dipende dal tempo di transito dell aria espirata nelle vie aeree (5,15,16). Bassi flussi aerei espiratori (< 0.1 L/sec), aumentano le concentrazioni di F E NO, riducendo, pertanto, il problema di misurare valori di NO vicini al limite di sensibilità degli analizzatori, e migliorando la capacità di discriminazione della metodica, ma richiedono una espirazione più prolungata per il raggiungimento del plateau delle concentrazioni di F E NO (16). Questo può risultare difficile in pazienti con malattia respiratoria grave. Il mantenimento di una velocità di flusso espiratorio di 50 ml/sec sembra essere un ragionevole compromesso tra sensibilità della metodica analitica e confort della persona che esegue il test (16). Quando si misurano le concentrazioni nell aria espirata di NO proveniente dalle vie aeree inferiori, è importante escludere il contributo dell NO prodotto nelle cavità nasali, in quanto le concentrazioni di NO nasale sono molto più alte di quelle raggiunte nell aria espirata bronchiale (16). Attraverso il naso-faringe posteriore, l NO nasale può raggiungere la cavità orale ed aggiungersi, nell aria esalata, a quello proveniente dalle vie aeree inferiori (16). Per ridurre al minimo la contaminazione dell NO nasale, l espirazione è eseguita a flusso-costante contro una resistenza espiratoria (tecnica del respiro ristretto, restricted breath) che provoca il raggiungimento di una pressione positiva nel boccaglio di 5-20 cm H 2 O consentendo, pertanto, la chiusura del velopendulo (16). All interno del boccaglio è presente un filtro che consente di inspirare aria priva di NO (16). Essendo l NO normalmente presente nell aria ambiente, a concentrazioni ambientali variabili a seconda del livello di inquinamento atmosferico, l inspirazione di aria priva di NO consente di misurare nell aria espirata della persona assistita esclusivamente l NO di derivazione endogena (16). Le concentrazioni ambientali di NO nell aria ambiente sono, comunque, misurate dagli analizzatori di NO (16). L espirazione a flusso espiratorio costante produce un profilo di F E NO a respiro singolo che può essere rappresentato graficamente dall andamento delle concentrazioni di NO nell aria espirata nel tempo dove ad una fase di wash-out segue una fase di plateau, generalmente riproducibile e piatta (16). La durata dell espirazione deve essere sufficiente a raggiungere e mantenere la fase di plateau per almeno 3 secondi (almeno 4 secondi nei bambini di età inferiore a 12 anni e maggiore di 6 secondi nei ragazzi di età superiore a 12 anni e negli adulti) (16). Questo corrisponde ad un volume di aria espirata di 0.3 L ad una velocità di flusso espiratorio di 0.05 L/sec che consente lo svuotamento del compartimento delle vie aeree ed il raggiungimento di un adeguato plateau (16). Generalmente, le persone assistite sono in grado di eseguire espirazioni della durata fino a 10 secondi senza particolare sforzo. Questo può essere il tempo necessario a raggiungere una fase di plateau stabile, definita in un intervallo di 3 secondi (0.15 L) compreso tra il punto A (inizio del plateau) ed il punto B (fine del plateau) nella curva dell andamento delle concentrazioni di NO nell aria espirata nel tempo (16). La fase di plateau può essere piatta, a pendenza positiva o negativa (16) (Figura 2).

6 5 Figura 2. Diagramma schematico dell andamento nel tempo delle concentrazioni di F E NO durante la misurazione on-line. E mostrato un plateau orizzontale (a sinistra), a pendenza verso il basso (al centro) e verso l alto (a destra). Il plateau inizia al punto A e finisce al punto B come descritto nel testo. Comunque, l entità della pendenza del plateau deve essere ridotta al minimo mediante i seguenti criteri: nella curva delle concentrazioni di NO nell aria espirata nel tempo, i punti A e B devono essere scelti in modo da definire il primo intervallo di 3 secondi nel quale la differenza dei valori assoluti tra A e B è inferiore al 10%; inoltre, nessun valore di concentrazione di NO nell aria espirata compreso in questo intervallo di 3 secondi deve avere una differenza superiore al 10% rispetto al punto A e B (16). La concentrazione a plateau è, quindi, definita come concentrazione media di NO nell aria espirata, in questo intervallo di 3 secondi ed è più comunemente nota come concentrazione della frazione di NO nell aria espirata (fraction of exhaled nitric oxide, F E NO) (16). Per valori di F E NO inferiori a 10 ppb, il criterio del 10% può essere difficile da mantenere a causa della variabilità dell analizzatore e di variazioni nel controllo della velocità di flusso espiratorio da parte della persona che esegue il test (16). In questi casi, una variazione di 1 ppb o inferiore tra i punti A e B è considerata accettabile ai fini del raggiungimento del plateau (16). La valutazione online dei profili di concentrazione di F E NO mediante gli analizzatori in commercio consente una identificazione automatica della fase di plateau del F E NO sulla base di questi criteri (16). Alla velocità di flusso espiratorio di 50 ml/sec, come indicato dalle linee guida, la fase di plateau è, generalmente, piatta e facilmente riconoscibile (16). Una volta raggiunto un plateau, come definito in precedenza, della durata di almeno 3 secondi, non è necessario proseguire l espirazione (16). Alcuni analizzatori (ad es., NIOX) richiedono l esecuzione di tre misure riproducibili, a distanza di almeno 30 secondi l una dall altra, che abbiano una variabilità delle concentrazioni di F E NO non superiore al 10% (18). Il valore di F E NO fornito dal laboratorio sarà, quindi, il valore medio delle tre misure. La misurazione del F E NO con NIOX MINO richiede, invece, una sola misura in quanto è stato dimostrato che, con questo analizzatore, la variabilità di misure ripetute è minima (28). La

7 6 misurazione del F E NO on-line consente di ottenere risultati immediati (NIOX) o entro 1 minuto e 40 secondi (NIOX MINO) in base al tipo di analizzatore. Modelli di escrezione polmonare del monossido di azoto Conoscere la dinamica degli scambi di NO nel sistema respiratorio consente di stabilire la provenienza dell NO (grandi vie aeree versus alveoli) e, pertanto, la sede dell infiammazione nelle diverse patologie respiratorie. Con questo obiettivo, sono stati elaborati diversi modelli di escrezione polmonare di NO basati su evidenze sperimentali (5). L osservazione che le concentrazioni di F E NO sono inversamente correlate con la velocità del flusso espiratorio (30) è compatibile con un compartimento respiratorio di NO a volume fisso, nel quale l aumento della velocità di flusso espiratorio riduce il tempo di contatto della corrente d aria espirata con la superficie delle parete bronchiale dove è prodotto l NO, determinando una correlazione inversa tra velocità di flusso aereo espiratorio e concentrazioni di F E NO (5). Le vie aeree di conduzione (compartimento centrale), relativamente rigide, sono, pertanto, una fonte di NO nell aria espirata, come dimostrato anche da numerose evidenze sperimentali (5). Se NO fosse prodotto solo nel compartimento centrale, la velocità di eliminazione di NO, vale a dire il prodotto della concentrazione di F E NO e della velocità del flusso espiratorio (NO output espresso in nl/sec), dovrebbe essere costante entro un ampio intervallo di flussi. E stato, invece, dimostrato sperimentalmente che la velocità di eliminazione di NO aumenta con l aumento della velocità del flusso espiratorio (31). Questo significa che NO è prodotto anche nel compartimento respiratorio periferico (vie aeree distali/alveoli) che contribuisce alle concentrazioni di NO misurate nell aria espirata. Infatti, lo svuotamento di un compartimento elastico come quello alveolare non comporta variazioni della concentrazione di un composto volatile contenuto al suo interno e l aumento della velocità di svuotamento del compartimento alveolare provoca un aumento della velocità di eliminazione del composto volatile (5). Questi principi sono alla base del modello a due compartimenti riguardante gli scambi dell NO nel sistema respiratorio (compartimento centrale: grandi vie aeree; compartimento periferico: vie aeree distali/alveoli) (32-36) (Figura 3).

8 7 Figura 3. Rappresentazione schematica del modello a due compartimenti dell escrezione di NO. La frazione di monossido di azoto nell aria espirata (F E NO) è la somma dell NO proveniente dal compartimento alveolare per convezione e dell NO prodotto nella parete delle vie aeree che diffonde nel lume bronchiale seguendo un gradiente di concentrazione. Durante l espirazione, la concentrazione alveolare di monossido di azoto (C alv ) rimane costante, mentre il F E NO aumenta fino al raggiungimento di un plateau come descritto nel testo. C w : concentrazione di monossido di azoto nella parete delle vie aeree (modificata da Bates CA, Silkoff PE. Exhaled nitric oxide in asthma: from bench to bedside. J Allergy Clin Immunol 2003;111:256-62). Nella sua forma più semplice, il modello a due compartimenti è caratterizzato da due parametri: il flusso massimo di NO dal compartimento delle grandi vie aeree (J awno; bronchi di 1 a -16 a generazione) espresso in nl/s e la concentrazione media di NO allo stato stazionario nelle vie aeree distali/alveoli (CANO) espressa in ppb (5). Algoritmi sperimentali caratterizzati dalla misurazione di F E NO a diverse velocità di flusso espiratorio costante sono stati proposti (37). Nonostante la solidità del modello iniziale a due compartimenti, studi più recenti hanno dimostrato l importanza della retro-diffusione assiale dell NO nella fase gassosa, vale a dire la diffusione dell NO dalle vie aeree verso gli alveoli in senso contrario rispetto alla direzione dell espirazione (38-41). Questa osservazione ha condotto alla introduzione di modelli maggiormente complessi che prevedono algoritmi modificati per calcolare J awno e CANO (42-43). A questo proposito, un metodo frequentemente utilizzato è quello della pendenza-intercetta che consiste nel tracciare una linea di regressione in un grafico che pone in relazione la velocità di eliminazione dell NO con la velocità del flusso espiratorio: l intercetta e la pendenza sono stime di J awno e CANO, rispettivamente (32). La retro-diffusione dell NO dal compartimento delle vie aeree nel compartimento alveolare può aumentare artificiosamente i valori di CANO e ridurre quelli di J awno (5). Pertanto, il metodo della pendenza-intercetta è stato modificato sottraendo ai valori di CANO un valore proporzionale all entità del flusso espiratorio (J awno/0.53) e moltiplicando il valore di J awno per un fattore 1.7 (42). Dal punto di vista clinico, i modelli della dinamica degli scambi di NO nel sistema respiratorio, che sono in grado di distinguere tra NO proveniente dal compartimento bronchiale (J awno) ed alveolare (CANO), sono molto rilevanti in quanto potenzialmente capaci di stabilire la sede prevalente dell infiammazione eosinofila nel sistema respiratorio e di stimarne l entità (44,45). Questo modello è stato applicato con successo a pazienti con asma lieve e moderata-grave (43-50), anche se una maggiore comprensione della dinamica degli scambi polmonari di NO richiede probabilmente la considerazione di altri fattori come l eterogeneità strutturale del sistema respiratorio e dei pattern respiratori (51). Dal punto di vista pratico, il F E NO ottenuto a valori di flusso espiratorio di 50 ml/sec, come da linee guida ATS/ERS (16), è una stima affidabile dell NO di derivazione bronchiale (J awno) e risulta molto utile in pazienti con asma (5), mentre la stima dell NO di derivazione alveolare (CANO) richiede la determinazione del F E NO a diverse velocità di flusso espiratorio (5) e può risultare particolarmente utile in pazienti con altre malattie respiratorie croniche come la BPCO. A questo riguardo, la misurazione del F E NO a diversi flussi espiratori consente uno studio dello stato infiammatorio delle vie aeree periferiche ( piccole vie aeree) che ha una elevata importanza clinica per il ruolo fisiopatologico che l infiammazione delle vie aeree periferiche svolge in patologie come asma e BPCO e per l attuale mancanza di indicatori validati di infiammazione a questo livello.

9 8 Rilevanza clinica La misurazione del F E NO è particolarmente rilevante dal punto di vista clinico in quanto, attualmente, non esistono altre metodiche validate, completamente non invasive, per la valutazione dell infiammazione delle vie aeree/polmonare ed il monitoraggio della terapia farmacologica nei pazienti con malattie respiratorie (52). In particolare, nei pazienti con asma, un attento monitoraggio dell infiammazione delle vie aeree, la caratteristica fisiopatologia principale di questa patologia, e la conseguente prescrizione di efficaci farmaci anti-infiammatori che ne consentano il controllo (glucocorticoidi inalatori, antagonisti recettoriali dei leucotrieni), rendono possibile un intervento precoce in quei pazienti asintomatici, ma con evidenza di infiammazione respiratoria, per prevenire comparsa della sintomatologia, riduzione della funzionalità respiratoria, e, a lungo termine, alterazioni strutturali delle vie aeree (remodelling) conseguenti ad infiammazione persistente non controllata (52). L altra metodica non invasiva, standardizzata e validata, attualmente disponibile per la valutazione dell infiammazione respiratoria ed il monitoraggio della terapia farmacologica, è l analisi della conta degli eosinofili nell espettorato indotto (53,54). Questa metodica, che in realtà è semiinvasiva, ha il vantaggio di essere una misura diretta di infiammazione delle vie aeree ma, a differenza della misurazione del F E NO, può provocare broncospasmo durante l induzione (55), anche se il pre-trattamento con broncodilatatori β 2 -adrenergici agonisti selettivi a rapida insorgenza di azione (ad es., salbutamolo) riduce notevolmente questo rischio. Inoltre, l analisi degli eosinofili nell espettorato indotto è più complessa della misurazione del F E NO, in quanto richiede strumentazione dedicata (ad es., nebulizzatore ad ultrasuoni, citocentrifuga) e non fornisce risultati immediati poiché implica induzione ed analisi dell espettorato da parte di personale specializzato (54). Le recenti linee guida dell ATS sull interpretazione delle concentrazioni di F E NO per applicazioni cliniche raccomandano fortemente la misura del F E NO per 1) il monitoraggio dell infiammazione delle vie respiratorie in persone con asma e per 2) determinare la probabilità di risposta ai glucocorticoidi in persone con sintomi respiratori cronici possibilmente dovuti ad infiammazione delle vie aeree (17). L ATS considera forte raccomandazione una procedura/esame che dovrebbe interessare la maggior parte dei pazienti con una determinata condizione patologica, nel caso specifico sintomi respiratori possibilmente dovuti a persistente infiammazione respiratoria, che i medici dovrebbero prescrivere/eseguire nella maggior parte dei pazienti affetti da questo tipo di patologie e che i responsabili della programmazione sanitaria a diversi livelli (policy makers) dovrebbero provvedere a far inserire come prestazione sanitaria prevista per la valutazione di routine di questi pazienti (17).

10 9 I principali motivi che rendono necessaria la misurazione del F E NO in persone con patologie respiratorie sono riassunti in Tabella 2. Tabella 2. Principali motivi per misurare il F E NO (17). Definire l eziologia della sintomatologia respiratoria Migliorare la capacità di identificare pazienti asmatici con fenotipo eosinofilo Valutare la potenziale risposta o la mancanza di risposta alla terapia anti-infiammatoria, in particolare ai glucocorticoidi inalatori Stabilire valori basali di F E NO nel singolo paziente in condizioni di stabilità clinica prima di intraprendere programmi personalizzati di monitoraggio dell asma cronica Fornire una misura di outcome infiammatoria in grado di guidare variazioni nella posologia dei farmaci anti-infiammatori: riduzione della dose (step-down), aumento della dose (step-up) o sospensione della terapia anti-infiammatoria Facilitare la valutazione della compliance del paziente alla terapia anti-infiammatoria Valutare quanto l infiammazione delle vie respiratorie contribuisce allo scarso controllo dell asma, in particolare in presenza di fattori concomitanti che possono peggiorare il controllo dell asma (ad es., rino-sinusite, ansia, reflusso grastro-esofageo, obesità o continua esposizione ad allergeni). Oltre ai motivi elencati in Tabella 2, la misurazione del F E NO può avere valore diagnostico in quanto può confermare una diagnosi di asma (17). Studi di popolazione condotti per valutare la capacità diagnostica di questa metodica, comprendenti soprattutto pazienti con infiammazione eosinofila delle vie aeree, hanno dimostrato che la misurazione del F E NO (generalmente ad un valore di cut-off > 25 ppb) ha un valore predittivo superiore alle metodiche convenzionali come spirometria e misurazione della velocità di picco di flusso espiratorio (56) e simile a quello dei test di stimolazione bronchiale (57). Inoltre, uno studio condotto in giovani adulti ha dimostrato che la misurazione del F E NO eseguita mediante un analizzatore portatile (NIOX MINO) può essere utile per lo screening dell asma, quando si consideri come valore di cut-off per la diagnosi di asma una concentrazione di F E NO > 19 ppb (58). Generalmente, si ritiene che la misurazione del F E NO abbia valore di supporto nella diagnosi di asma che è, comunque, clinica (17). Più che nel definire una diagnosi esatta, l importanza della misurazione del F E NO consiste nella sua potenziale capacità di identificare la risposta alla terapia con glucocorticoidi (17). Dal punto di vista clinico, questa informazione è molto più rilevante in quanto consente al medico di evitare il trial di glucocorticoidi, vale a dire la somministrazione di glucocorticodi, generalmente per due settimane, per stabilire se il paziente risponde alla terapia, o di evitare inutili e prolungati periodi di terapia con questi farmaci (17). La misurazione del F E NO ha una capacità predittiva della risposta alla terapia corticosteroidea superiore a quella della spirometria, del test di reversibilità al broncodilatatore, del monitoraggio della velocità di picco di flusso espiratorio e del test di stimolazione bronchiale con metacolina (59-61). La risposta alla terapia farmacologica in pazienti con asma, e ancora di più con BPCO, è variabile (62). Poiché non tutti i pazienti con asma rispondono alla terapia con

11 10 glucocorticoidi inalatori, che sono generalmente i farmaci più efficaci per il controllo dell asma, un motivo importante per intraprendere il monitoraggio dell infiammazione respiratoria mediante F E NO consiste nella possibilità di identificare a priori i pazienti che verosimilmente risponderanno ai glucocorticoidi inalatori e quelli che, al contrario, hanno bassa probabilità di risposta a questi farmaci, nei quali si dovrebbe intraprendere un altro tipo di terapia (ad es., con antagonisti recettoriali dei leucotrieni) (17). Anche in assenza eosinofilia nell espettorato, il F E NO, ad un valore di cut-off di 33 ppb, è altamente predittivo della risposta alla terapia corticosteroidea nei pazienti con asma. (63). In presenza di risposta alla terapia con glucocorticoidi, il F E NO è la misura di outcome che si modifica più rapidamente in quanto la riduzione delle concentrazioni di F E NO generalmente precede, nell ordine, il miglioramento della sintomatologia, della funzionalità respiratoria e della reattività bronchiale (Figura 4). Questa ultima è la misura di outcome meno sensibile ai glucocorticoidi in quanto la comparsa della risposta può richiedere diverse settimane dall inizio della terapia (Figura 4). Inoltre, l effetto massimale della terapia corticosteroidea sulla riduzione delle concentrazioni di F E NO si raggiunge molto rapidamente, mentre quello sul miglioramento della sintomatologia, della funzionalità respiratoria e, soprattutto, della reattività bronchiale è più lento (Figura 4). Figura 4. Rappresentazione schematica dell andamento nel tempo della risposta ai glucocorticoidi delle concentrazioni di F E NO, della funzionalità respiratoria e della reattività bronchiale in pazienti con asma (modificata da Bates CA, Silkoff PE. Exhaled nitric oxide in asthma: from bench to bedside. J Allergy Clin Immunol 2003;111:256-62). Un obiettivo importante nel controllo dell asma è la prevenzione delle riacutizzazioni (64). Uno studio prospettico condotto per valutare il ruolo delle prove di funzionalità respiratoria e della misurazione del F E NO nella prevenzione delle riacutizzazioni di asma in 44 soggetti non fumatori con asma, clinicamente stabili da almeno 6 settimane ed in terapia con fluticasone/salmeterolo alla dose di 250/50 µg due volte al giorno da 3 anni, ha evidenziato come i pazienti con F E NO 28 ppb e volume espiratorio forzato nel primo secondo (forced expiratory volume, FEV 1 ) 76% del valore teorico avevano una probabilità dell 85% di avere una futura riacutizzazione di asma nei 18 mesi seguenti, mentre la probabilità era dello 0% in pazienti con asma che avevano valori di F E NO 28 ppb e di FEV 1 76% del valore teorico (47). Dei pazienti con concentrazioni basali di F E NO 28

12 11 ppb, il 76% andava incontro ad una riacutizzazione di asma nei 18 mesi seguenti, mentre nei pazienti asmatici con F E NO 28 ppb la frequenza di riacutizzazione era del 33% (p = 0.005, χ 2 ) (47). Ad un valore di cut-off di F E NO di 28 ppb, la sensibilità della metodica era 0.59, la specificità 0.82, il valore predittivo positivo 0.77 ed il valore predittivo negativo 0.87 (47). Indipendentemente dal valore basale di FEV 1, un valore di F E NO 28 ppb aumentava il rischio relativo di riacutizzazione di asma di 3.4 (intervallo di confidenza 95%, ; Mantel-Haenszel, p = 0.007) (47). Questi dati indicano l importanza della misurazione del F E NO nella prevenzione delle riacutizzazioni nei pazienti con asma (47), anche se sono necessari studi su larga scala per trarre conclusioni definitive. Linee guida operative sul significato da attribuire ai valori di concentrazioni di F E NO in pazienti nei quali sia stata stabilita una diagnosi di asma sono riassunte in Tabella 3. Tabella 3. *Linee guida generali sul significato delle concentrazioni di F E NO in pazienti con diagnosi di asma nota (5,17). F E NO < 25 ppb (< 20 ppb nei bambini) Sintomi presenti Considerare diagnosi alternative Risposta all aumento della dose di glucocorticoidi inalatori improbabile F E NO ppb (25-25 ppb nei bambini) Persistente esposizione ad allergeni Dose inadeguata di glucocorticoidi inalatori Scarsa compliance Resistenza ai glucocorticoidi F E NO > 50 ppb (< 35 ppb nei bambini) Persistente esposizione ad allergeni Scarsa compliance o inadeguata tecnica inalatoria Dose inadeguata di glucocorticoidi inalatori Elevato rischio di riacutizzazione Sintomi assenti Dose adeguata di glucocorticoidi inalatori Dose adeguata di glucocorticoidi inalatori La riduzione o sospensione dei glucocorticoidi inalatori può provocare la ripresa dei sintomi Buona compliance; considerare la riduzione o anche la sospensione della terapia Buona compliance; monitorare le variazioni di F E NO Scarsa compliance o inadeguata tecnica inalatoria *Misurazioni di F E NO consecutive possono fornire valori di cut-off di F E NO più appropriati nel singolo paziente con asma. Le decisioni cliniche basate sulle concentrazioni di F E NO devono tenere conto dei risultati delle prove di funzionalità respiratoria e della dose di glucocorticoidi inalalatori somministrata (5,17).

13 12 In sintesi, il valore aggiunto della misurazione del F E NO consiste nella possibilità di: 1) aumentare l efficacia di programmi di screening per asma; 2) intervenire precocemente con la terapia farmacologica in pazienti con asma asintomatici, ma con evidenza di infiammazione respiratoria, per prevenire riduzione della funzionalità respiratoria e comparsa dei sintomi; 3) individuare tra i pazienti con BPCO, che non rispondono o rispondono poco ai glucocorticoidi inalatori, quelli con fenotipo misto asma-bpco (65,65), nei quali questi farmaci sono generalmente efficaci; 4) ridurre la frequenza di riacutizzazioni, uno dei principali obiettivi del controllo dell asma sia dal punto di vista clinico che del contenimento dei costi, e prevenire le alterazioni strutturali delle vie aeree (remodelling) conseguenti ad infiammazione persistente non controllata mediante programmi di monitoraggio terapeutico; 5) ridurre il costo della terapia farmacologica a parità di controllo dell asma; 6) valutare la adesione (compliance) alla terapia farmacologica. La misurazione del monossido di azoto nell aria espirata al Policlinico Gemelli Il Policlinico Universitario Agostino Gemelli è stata la prima struttura italiana ad ottenere l inserimento della misurazione del F E NO tra gli esami riconosciuti dal Sistema Sanitario Nazionale. Dal 2005, questa attività, svolta dal Prof. Paolo Montuschi presso il Dipartimento di Sanità Pubblica, Unità Operativa di Farmacologia, Farmacologia Clinica, che dispone degli analizzatori NIOX e NIOX MINO approvati dalla FDA per uso clinico, è inserita tra gli esami di routine per pazienti ambulatoriali e ricoverati presso il Policlinico Agostino Gemelli con patologie respiratorie. Per i pazienti ambulatoriali, gli appuntamenti per la esecuzione della misurazione del F E NO vengono concordati contattando direttamente il Prof. Paolo Montuschi al numero telefonico o all indirizzo pmontuschi@rm.unicatt.it. Per eseguire il test, è necessaria una prescrizione medica per misurazione del monossido di azoto nell aria espirata su ricettario del Servizio Sanitario Nazionale. La misurazione del F E NO è eseguita presso la Piastra Tecnologica Polifunzionale, 3 piano del Policlinico Agostino Gemelli, Unità Operativa di Farmacologia, Farmacologia Clinica. Per accedere alla struttura, dall ingresso principale del Policlinico Agostino Gemelli (4 piano) è necessario seguire il percorso viola, scendere un piano e recarsi presso la stanza Farmacologia Clinica, J308m. La misurazione on-line fornisce risultati immediati. Il referto è fornito contestualmente all esecuzione del test in un tempo massimo di 10 minuti. Aspetti farmaco-economici L impianto terapeutico dei pazienti con asma potrebbe trovare utili risvolti farmacoeconomici in rapporto all impiego del test al di misurazione del F E NO. Uno studio condotto in adulti con asma, pubblicato su New England Journal of Medicine, ha dimostrato come la modulazione della posologia dei glucocorticoidi inalatori, il cardine della terapia antiasmatica, basata sul monitoraggio delle concentrazioni di F E NO rispetto alla modulazione della posologia degli stessi farmaci basata sull approccio convenzionale raccomandato dalle linee guida (sintomatologia, prove di funzionalità respiratoria) (64) consenta un risparmio medio di 271 µg al giorno di fluticasone inalatorio a parità

14 13 di controllo dell asma, vale a dire a parità di efficacia terapeutica (67). Se confermati in studi multicentrici, questi dati potrebbero implicare un risparmio annuo di circa 168 euro per paziente asmatico in terapia continuativa con fluticasone (Flixotide ) inalatorio, uno dei glucocorticoidi maggiormente prescritti per il controllo dell asma. Le linee guida Global Initiative for Asthma (GINA) consigliano terapia continuativa con glucocorticoidi inalatori per i pazienti con asma persistente (64). Considerando un costo di euro per µg di fluticasone inalatorio, l utilità del monitoraggio del F E NO per guidare la terapia con glucocorticoidi inalatori nell asma si potrebbe tradurre in un risparmio annuo di 168 euro sul costo di fluticasone per paziente asmatico che richieda terapia continuativa con glucocorticoidi inalatori (circa il 60% dei pazienti con asma corrispondenti a di pazienti con asma su totali in Italia, considerata una prevalenza dell asma del 5% nell adulto), vale a dire circa di euro all anno, considerando un costo analogo a quello del fluticasone per gli altri glucocorticoidi inalatori impiegati, a dosi equivalenti, per il controllo dell asma. Tenendo presente che nella regione Lazio i pazienti con asma sono circa e che per circa di loro esiste indicazione alla somministrazione continuativa di glucocorticoidi inalatori, la terapia con questi farmaci basata sul monitoraggio del F E NO si tradurrebbe in un risparmio sul consumo di fluticasone di circa euro all anno. Per quanto riguarda in particolare il Policlinico Agostino Gemelli, pazienti con diagnosi principale o secondaria di asma sono stati ricoverati nel Dato che per questi pazienti con asma esiste evidentemente indicazione alla somministrazione continuativa di glucocorticoidi inalatori, la terapia con questi farmaci basata sul monitoraggio del F E NO si tradurrebbe in un risparmio sul consumo di fluticasone di circa euro all anno. Questa cifra è probabilmente sottostimata in quanto non tiene conto dei pazienti ambulatoriali che richiedono terapia con glucocorticoidi inalatori, sicuramente più numerosi di quelli che richiedono ricovero ospedaliaro per attacco acuto di asma, e che dovrebberopertanto, essere considerati per una completa valutazione dei vantaggi del monitoraggio delle concentrazioni di F E NO in termini di riduzione dei costi della terapia con glucocorticoidi inalatori nei pazienti con asma. Considerazioni relative al tipo di glucocorticoidi utilizzati (beclometasone, budesonide, ciclesonide, flunisolide, fluticasone), ai periodi di sospensione della terapia (consigliati dalle linee guida GINA in pazienti che abbiano raggiunto e mantenuto un controllo dell asma per almeno 3 mesi) (64) e al frequente possibile mancato rispetto delle linee guida nella pratica clinica (68,69) possono ridurre la stima calcolata del risparmio annuo di glucocorticoidi inalatori consentito dalla gestione dei pazienti con asma basata sul monitoraggio delle concentrazioni di F E NO. Tuttavia, questo approccio risulta favorevole da un punto di vista farmaco-economico. Conclusioni La misurazione del F E NO è, attualmente, l unica metodica non invasiva validata e disponibile in clinica per la valutazione dell infiammazione delle vie respiratorie, caratteristica fisiopatologia principale di importanti patologie respiratorie croniche come l asma e la BPCO.

15 14 Come misura non-invasiva validata di outcome infiammatoria delle vie respiratorie, la misurazione del F E NO fornisce uno strumento unico per la valutazione dell effetto diretto dei farmaci antiinfiammatori esistenti e di nuovi potenziali farmaci in trial clinici in medicina respiratoria. Nell ambito di un approccio integrato comprendente metodiche convenzionali cliniche e funzionali, la misurazione del F E NO consente una più completa valutazione diagnostica e prognostica del singolo paziente con malattia respiratoria, in particolare asma, la personalizzazione della terapia, il miglioramento della sua gestione clinica e la sostanziale riduzione dei costi della terapia farmacologica. Bibliografia 1. Montuschi P, Barnes PJ. Analysis of exhaled breath condensate for monitoring airway inflammation. Trends Pharmacol Sci 2002;23: Montuschi P. Indirect monitoring of lung inflammation. Nat Rev Drug Discov 2002;1: Montuschi P., editor. New perspectives in monitoring lung inflammation: analysis of exhaled breath condensate. Boca Raton: CRC Press, Montuschi P. Analysis of exhaled breath condensate in respiratory medicine: methodological aspects and potential clinical applications. Ther Adv Respir Dis 2007;1: Barnes PJ, Dweik RA, Gelb AF, Gibson PG, George SC, Grasemann H, Pavord ID, Ratjen F, Silkoff PE, Taylor DR, Zamel N. Exhaled nitric oxide in pulmonary diseases: a comprehensive review. Chest 2010;138: Gustafsson LE, Leone AM, Persson MG, Wiklund NP, Moncada S. Endogenous nitric oxide is present in the exhaled air of rabbits, guinea pigs and humans. Biochem Biophys Res Commun 1991;181: Alving K, Weitzberg E, Lundberg JM. Increased amount of nitric oxide in exhaled air of asthmatics. Eur Respir J 1993;6: Kharitonov SA, Yates D, Robbins RA, Logan-Sinclair R, Shinebourne EA, Barnes PJ. Increased nitric oxide in exhaled air of asthmatic patients. Lancet 1994;343: Nelson BV, Sears S, Woods J, Ling CY, Hunt J, Clapper LM, Gaston B. Expired nitric oxide as a marker for childhood asthma. J Pediatr 1997;130: Silkoff PE, McClean P, Spino M, Erlich L, Slutsky AS, Zamel N. Dose response relationship and reproducibility of the fall in exhaled nitric oxide after inhaled beclomethasone dipropionate therapy in asthma patients. Chest 2001;119: Montuschi P, Kharitonov SA, Barnes PJ. Exhaled carbon monoxide and nitric oxide in COPD. Chest 2001;120: Gelb AF, Barnes PJ, George SC, Ricciardolo FL, DiMaria G, Zamel N. Review of exhaled nitric oxide in chronic obstructive pulmonary disease. J Breath Res 2012;6(4): Guilleminault L, Saint-Hilaire A, Favelle O, Caille A, Boissinot E, Henriet AC, Diot P, Marchand-Adam S. Can exhaled nitric oxide differentiate causes of pulmonary fibrosis? Respir Med 2013 Sep 5. doi:pii: S (13) /j.rmed [Epub ahead of print] 14. Tiev KP, Coste J, Ziani M, Aubourg F, Cabane J, Dinh-Xuan AT. Diagnostic value of exhaled nitric oxide to detect interstitial lung disease in systemic sclerosis. Sarcoidosis Vasc Diffuse Lung Dis 2009;26: Bates CA, Silkoff PE. Exhaled nitric oxide in asthma: from bench to bedside. J Allergy Clin Immunol 2003;111: Anonymous. Recommendations for standardized procedures for the on-line and offline

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