Diagnosi preimpianto, screening preimpianto e biopsia del globulo polare: razionale ed applicabilità in Italia Dr. Francesco Fiorentino

Transcript

1 Diagnosi preimpianto, screening preimpianto e biopsia del globulo polare: razionale ed applicabilità in Italia Dr. Francesco Fiorentino Introduzione La Legge 40/2004 (1) vieta qualsiasi forma di diagnosi genetica sull embrione; quindi in Italia non è più possibile eseguire la cosiddetta diagnosi genetica preimpianto (PGD), una tecnica che consiste nell asportare dall embrione, quando è ancora costituito da 7-8 cellule (al terzo giorno dalla fecondazione), una cellula, con lo scopo di verificare che l embrione non sia affetto da gravi malattie genetiche. Questa tecnica ha consentito a molte coppie (fertili e non) di avere figli sani, senza dover affrontare la scelta dolorosa di un eventuale aborto terapeutico (2-7). Il testo di legge 40 non specifica la liceità o meno della diagnosi preimpianto, rimandando ogni posizione alle successive linee guida emanate dal Ministero della salute, che poi, di fatto, hanno proibito espressamente ogni forma di diagnosi preimpianto a finalità eugenetiche. Quindi, da Marzo del 2004, le coppie italiane portatrici di patologie genetiche tutt'altro che rare, come per esempio la talassemia, la fibrosi cistica, la distrofia muscolare di Duchenne- Becker, la sindrome dell X-fragile, hanno la possibilità di ricorrere a due opzioni riproduttive: Il concepimento naturale, sottoponendosi successivamente a diagnosi prenatale, mediante villocentesi o amniocentesi, affrontando eventualmente la scelta dolorosa di un interruzione volontaria della gravidanza nel caso in cui venga individuato un feto affetto dalla specifica malattia; Ricorrere al cosiddetto turismo procreativo, cioè cercare di ottenere un trattamento sanitario mediante diagnosi preimpianto all estero, presso centri di fecondazione assistita ubicati in Paesi con legislazioni meno restrittive, affrontando quindi ingenti spese e notevoli disagi. Recentemente, si è presentata una nuova opportunità per le coppie italiane a rischio genetico: la cosiddetta diagnosi genetica pre-concepimento (PCGD) (8). Tale tecnica è stata messa a punto ed applicata clinicamente dal ns. Centro, determinando la nascita di una bambina sana generata da una coppia il cui partner femminile era portatore della malattia di Charcot Marie Tooth (CMTX). Attualmente, un altra coppia, il cui partner femminile era portatore della malattia del cromosoma X-Fragile, ha ottenuto una gravidanza in fase di gestazione, e a breve darà alla luce una bambina sana. La diagnosi genetica pre-concepimento La diagnosi genetica pre-concepimento, mira a selezionare gli ovociti in cui sia assente l anomalia genetica di cui il partner femminile della coppia è portatore, in modo da produrre solo embrioni sani. Ciò è realizzato eseguendo l analisi genetica dell ovocita, mediante biopsia del primo globulo polare (1PB), prima della sua fertilizzazione effettuata mediante ICSI (Intra Cytoplasmic Sperm Injection). Tale procedura, quindi, permette di effettuare la diagnosi preimpianto di malattie genetiche e cromosomiche sugli ovociti, prima che avvenga il concepimento, e non sugli embrioni. Grazie alla nuova tecnica, si risolve definitivamente il problema della selezione genetica degli embrioni e dell'eliminazione degli embrioni malati. Ciò consente di superare i problemi etici che hanno determinato il divieto della diagnosi preimpianto in Italia. Quest ultima, infatti, comporta l eliminazione degli embrioni che, all analisi genetica, risultano affetti dalla specifica patologia genetica di cui la coppia è portatrice. Con la

2 diagnosi pre-concepimento, invece, si esclude a priori la possibilità di produrre embrioni con anomalie genetiche. Il primo globulo polare, viene espulso dall ovocita nella fase finale della sua maturazione e contiene un assetto genetico che è speculare a quello presente nell ovocita stesso. L analisi di questa piccola cellula, che non ha alcun ruolo biologico e degenera dopo alcune ore, fornisce importanti informazioni sullo status genetico dell ovocita e può essere considerata un alternativa alla biopsia degli embrioni. Il primo globulo polare, infatti, può essere rimosso con una biopsia ed utilizzato per selezionare quegli ovociti che, all analisi genetica, non presentano la mutazione genica e, quindi, sono considerati idonei per essere poi fecondati. Inoltre, la letteratura scientifica ha dimostrato che la rimozione di questa cellula non ha alcun effetto negativo sul successivo sviluppo embrionale. L analisi del 1PB permette di identificare, in donne portatrici di una malattia genetica, quegli ovociti che non presentano la specifica mutazione genica. Infatti, poiché il 1PB possiede un assetto genetico speculare a quello dell oocita, se il 1PB presenta la mutazione ne consegue che l ovocita risulterà privo della mutazione (e quindi normale). Viceversa, se il 1PB non presenta la mutazione, sarà l ovocita a contenere quella mutazione (Figura 1). Solo gli ovociti normali (cioè senza la mutazione) saranno poi fecondati, mediante ICSI. In tal caso, gli embrioni che ne derivano potranno essere al massimo portatori della malattia (se lo spermatozoo conteneva la mutazione di cui è portatore il partner maschile della coppia), ma non saranno mai affetti dalla malattia. L analisi genetica del 1PB, tuttavia, può essere complicata da fenomeni di ricombinazione (scambio di porzioni cromosomiche), che avvengono regolarmente tra cromosomi omologhi durante la prima divisione meiotica. Se la ricombinazione coinvolge la regione cromosomica contenente il gene causa della malattia genetica, l ovocita tratterrà una copia normale del gene ed una contenente, la mutazione materna (Figura 1C). In tal caso la diagnosi genetica dell ovocita risulterà non conclusiva e quest ultimo non potrà essere fecondato. In pratica, gli ovociti con la ricombinazione verranno esclusi; ciò non inciderà sull affidabilità dell analisi (in quanto gli ovociti con la ricombinazione non verranno considerati per la successiva fecondazione) bensì comporterà solo una riduzione del numero di ovociti disponibili per la ICSI. L analisi del secondo globulo polare (2PB) degli ovociti con ricombinazione ovvierebbe al suddetto problema, fornendo una diagnosi univoca e definitiva dell ovocita. Purtroppo, poiché il 2PB viene espulso dall ovocita dopo la fecondazione, tale procedura non è utilizzabile in Italia poiché la legge 40 obbliga il trasferimento simultaneo in utero di tutti gli ovociti fertilizzati (zigoti), rendendo inutile quindi la diagnosi del 2PB. Nel protocollo di diagnosi genetica dell ovocita mediante analisi del primo globulo polare, i tempi da osservare sono strettissimi (al massimo 4 ore). Per questo motivo, l applicazione della tecnica segue uno schema articolato che richiede una stretta coordinazione tra due diverse equipe, i team del laboratorio di PMA e del laboratorio di genetica molecolare. L attività di questi due gruppi di professionisti consente di ottenere i risultati entro 6 ore dal prelievo degli ovociti, procedendo quindi alla fertilizzazione degli ovociti che sono risultati privi della mutazione di cui il partner femminile della coppia è portatore.

3 Figura 1: Schema della diagnosi genetica pre-concepimento mediante analisi del primo globulo polare (1PB). Il rettangolo nero rappresenta la mutazione genica di cui il partner femminile della coppia e portatore. L ovocita A risulta contenere la mutazione, poiché la diagnosi del 1PB non ha evidenziato la presenza della mutazione in questione. Viceversa, l ovocita B risulta essere normale, poiché la diagnosi genetica del 1PB ha evidenziato la presenza della mutazione. Nell ovocita C e avvenuta una ricombinazione tra cromosomi omologhi che ha coinvolto anche la regione cromosomica contenente il gene causa della malattia genetica. Questo ha, quindi, trattenuto una copia normale del gene ed una contenente la mutazione materna. In tal caso la diagnosi genetica dell ovocita risulterà non conclusiva e quest ultimo non potrà essere considerato utile per la fecondazione. In pratica, gli ovociti con ricombinazione verranno esclusi. L applicazione clinica della diagnosi pre-concepimento La procedura sopra descritta è stata applicata clinicamente a 26 coppie infertili, in 25 cicli, per totale di 12 differenti indicazioni (Tabella 1). La PCGD, ad oggi, ha avuto successo solo per 3 coppie; in due casi i partners femminili erano portatori di una malattia genetica legata al cromosoma X, mentre in un caso la coppia era portatrice di una malattia recessiva. In 2 cicli la procedura non ha avuto esito positivo (transfer non effettuato a causa di non disponibilità di embrioni da trasferire oppure gravidanza negativa dopo embryo transfer); in altri 7 cicli l esito della gravidanza al momento non è noto. Il primo caso con gravidanza positiva ha riguardato una donna di 33 anni, portatrice di Charcot Marie Tooth (CMTX), la malattia ereditaria più frequente del sistema nervoso

4 periferico, che colpisce 1 persona su 2500, ed ha una probabilità del 50% di trasmissione ai figli, manifestandosi completamente nei soggetti di sesso maschile. La coppia in questione ha avuto in precedenza un figlio con l ausilio della diagnosi preimpianto, prima dell approvazione della legge 40 (9). Successivamente, desiderando un nuovo figlio, la coppia è dovuta recarsi all estero, per accedere nuovamente alla tecnica di selezione genetica degli embrioni. Il tentativo, purtroppo non ha avuto successo, nonostante una gravidanza positiva; la gestazione, infatti, si è interrotta spontaneamente intorno alla settima settimana. Dopo tale tentativo, la coppia ha avuto, sempre all estero, per due volte, il trasferimento in utero di embrioni congelati, purtroppo anche questi con esito negativo. Successivamente, provata psicologicamente dai continui spostamenti e dagli insuccessi, la coppia ha deciso di restare in Italia ed accedere al programma della PCGD. A seguito di trattamento di procreazione medicalmente assistita, la paziente ha prodotto un numero complessivo di 19 ovociti, 15 dei quali sono risultati maturi e quindi idonei alla biopsia del 1PB. L esame genetico ha permesso di identificare 7 ovociti sani (cioè privi della mutazione), 6 ovociti invece segnalavano la presenza della mutazione, 1 ovocita è risultato con la ricombinazione (quindi ha prodotto un risultato non conclusivo) ed 1 ovocita non ha prodotto alcun risultato, a causa di un fallimento della reazione di amplificazione genica. A seguito di questo esame è stato possibile selezionare 3 ovociti privi di mutazione ed utilizzarli per la fecondazione in vitro con gli spermatozoi del partner attraverso tecnica ICSI. Ciò ha permesso di ottenere la formazione di 3 embrioni che sono stati trasferiti in cavità uterina della paziente, determinando una gravidanza positiva. Alla 12^ settimana di gestazione è stata effettuata l analisi del DNA dei villi coriali, che ha confermato i risultati della diagnosi pre-concepimento, dimostrato che il feto era sano, confermando quindi l accuratezza della procedura. Il secondo caso con gravidanza positiva ha riguardato una donna di 39 anni, portatrice di sindrome del cromosoma X fragile, la forma più comune di ritardo mentale dopo la sindrome di Down, che interessa circa un bambino maschio ogni 4000 e una bambina ogni La coppia ha avuto in precedenza un figlio nato affetto dalla malattia. La paziente ha prodotto un numero complessivo di 9 ovociti, a cui è stata effettuata la biopsia dei globuli polari; l esame genetico ha permesso di identificare 3 ovociti sani, 2 ovociti invece segnalavano la presenza della mutazione, 4 ovociti hanno presentato la ricombinazione, producendo quindi un risultato non conclusivo. I 3 ovociti privi di mutazione sono stati successivamente fertilizzati mediante ICSI; i 3 embrioni risultanti sono stati trasferiti in cavità uterina della paziente, dando luogo ad una gravidanza positiva. Alla 18^ settimana di gestazione è stata effettuata l analisi del DNA dal liquido amniotico che, anche in questo caso, ha confermato l accuratezza dei risultati della PCGD. Tale gravidanza è ancora in corso di gestazione. Il terzo caso con gravidanza positiva ha riguardato una donna di 36 anni, portatrice di Beta Talassemia, una malattia ereditaria caratterizzata da un difetto quantitativo nella produzione di emoglobina, molto comune nella nostra popolazione. La paziente ha avuto in precedenza un interruzione volontaria della gravidanza a causa di feto diagnosticato affetto dalla malattia. La paziente ha prodotto un numero complessivo di 15 ovociti, a cui è stata effettuata la biopsia dei globuli polari; l esame genetico ha permesso di identificare 2 ovociti sani, 5 ovociti invece segnalavano la presenza della mutazione, 6 ovociti hanno presentato la ricombinazione, producendo quindi un risultato non conclusivo e 2 ovociti non ha prodotto alcun risultato, a causa di un fallimento della reazione d amplificazione genica. I 2 ovociti

5 privi di mutazione sono stati successivamente fertilizzati mediante ICSI; i 3 embrioni risultanti sono stati trasferiti in cavità uterina della paziente, dando luogo ad una gravidanza positiva ancora in corso di gestazione. Tabella 1. Cicli di PCGD eseguiti ed indicazioni. Indicazione Nr. di cicli Nr. di coppie Malattie Monogeniche Nr. di gravidanze in corso di gestazione Nr. di Bambini già nati Fibrosi Cistica Beta Talassemia Distrofia Muscolare Duchenne (DMD) Distrofia Miotonia Atrofia Muscolare Spinale (SMA) Sordità ereditaria (CX26) X-Fragile (FRAXA) Charcot Marie Tooth (CMTX) Sindrome di Kallman Malattia di Treacher- Collins Traslocazioni Cromosomiche Robertsoniane Reciproche Totale Malattie genetiche generalmente diagnosticabili mediante analisi del 1PB La PCGD può essere applicata a coppie portatrici di malattie monogeniche a trasmissione autosomica recessiva (es. Fibrosi Cistica, Beta Talassemia), o legata al cromosoma X (Xlinked) (es. Distrofia Muscolare Duchenne-Becker DMD/DMB; Sindrome dell X-Fragile) o a

6 trasmissione autosomica dominante di origine femminile (Distrofia miotonia), nonché a coppie portatrici di anomalie cromosomiche di tipo strutturale (traslocazioni bilanciate). Con questa procedura non possono essere individuate solamente le malattie genetiche a trasmissione autosomica dominante di origine maschile. Tuttavia, da una valutazione retrospettiva dell attività di diagnosi preimpianto effettuata dal ns. Centro dal 1998 a Marzo 2004 (5), emerge che la PCGD sarebbe stata utilizzabile in 30 differenti malattie genetiche (81.1%) su un totale di 37 diagnosticate. Inoltre, considerati 293 cicli di diagnosi preimpianto effettuati per 189 diverse coppie, il 95.9% (281/293) di questi sarebbero stati effettuabili anche applicando l analisi del 1PB, riuscendo ad accettare il 95.8% (181/189) delle copie che hanno richiesto di poter accedere ad un ciclo di diagnosi preimpianto. I vantaggi della procedura L analisi è effettuata su materiale extra-embrionario, che non ha alcun ruolo biologico. La biopsia del 1PB non incide sullo sviluppo dell embrione, mantenendo inalterate le relative percentuali di impianto. La diagnosi genetica viene quindi eseguita sull ovocita, l embrione non viene manipolato. La diagnosi pre-concepimento è molto utile per quelle coppie portatrici di una malattia genetica che non vogliono affrontare il rischio di un interruzione della gravidanza nel caso in cui, a seguito di diagnosi prenatale, venga individuato un feto affetto dalla specifica malattia. I limiti della procedura L analisi consente di ottenere solo informazioni relative ad anomalie di origine femminile, ed è quindi inapplicabile in caso di malattie genetiche autosomiche dominanti di origine maschile. L incidenza dei fenomeni di ricombinazione comporta la mancata diagnosi di parte degli ovociti, riducendo quindi il numero di ovociti disponibili per la fecondazione. Una bassa risposta alla stimolazione ovarica incide sul numero di ovociti disponibili per l analisi genetica. Una buona riserva ovarica, quindi, è un requisito indispensabile per il successo della procedura. L analisi non consente di effettuare la tipizzazione dell HLA in fase preimpianto (3,4,7), procedura recentemente impiegata da coppie con un figlio affetto da una malattia genetica, per la cui cura è necessario effettuare un trapianto di cellule staminali da un soggetto compatibile. In questi casi la diagnosi preimpianto rappresenta una strategia che consente di individuare e trasferire embrioni che saranno, contemporaneamente, privi di mutazioni e HLA-compatibili con il figlio malato. Alla nascita del bambino, le cellule staminali presenti nel cordone ombelicale del nascituro potranno essere prelevate e trapiantate nel figlio malato della coppia, per consentirne la guarigione. Considerazioni L analisi genetica del primo globulo polare, di per sé, non è una novità. Tale metodica e stata impiegata per la prima volta nel 1990 da un gruppo di ricercatori statunitensi (10), prevedendo inizialmente l analisi del solo 1PB, procedura immediatamente abbandonata, ed integrata con l analisi del 2PB, al fine di aumentare l efficacia della metodica (11). I suddetti ricercatori, tuttavia, hanno impiegato un protocollo che prevedeva l analisi dei globuli polari dopo la fecondazione, a causa del lungo tempo necessario per il completamento della procedura diagnostica (circa 16h), non compatibile con i tempi

7 massimi di fertilizzazione degli ovociti, che solitamente devono essere fecondati entro 6-8h dal loro prelievo. Il nome di tale procedura, infatti, è stato in seguito modificato in diagnosi genetica pre-zigotica o pre-embrionica (12), proprio perché la diagnosi genetica interviene dopo la fertilizzazione dell ovocita, ma prima della formazione dello zigote (che avviene al momento della singamia, circa 18 ore dopo la fecondazione). I citati protocolli di diagnosi genetica pre-zigotica, tuttavia, non sono compatibili con la ns. legislazione vigente, perché se la fertilizzazione dell ovocita viene effettuata prima di conoscere il risultato dell esame genetico del globulo polare, la legge 40 obbligherebbe il trasferimento in utero di tutti gli embrioni prodotti, rendendo quindi la diagnosi genetica inutile. L unica procedura che rientra nei limiti imposti dalla citata legge, è la diagnosi genetica pre-concepimento (8), eseguendo l analisi genetica del solo primo globulo polare (1PB), ma prima della fertilizzazione dell ovocita. La ICSI sarà, quindi, effettuata solo dopo aver ottenuto gli esiti dell esame genetico. Per effettuare l analisi genetica del 1PB, prima della fertilizzazione dell ovocita, vi è un limitato spazio temporale, che fino ad oggi ne ha precluso una applicazione di routine. Il ns. centro ha ovviato a questa limitazione temporale, ottimizzando un protocollo diagnostico rapido (ed è qui che risiede la novità della procedura e la complessità della stessa) che può essere portato a termine entro 4h, quindi in tempo utile per eseguire la fertilizzazione degli ovociti risultati, all analisi genetica, essere privi della mutazione. Nella ricerca condotta analizzando un numero di 147 ovociti, tale procedura si è dimostrata estremamente efficace, fornendo una corretta diagnosi nel 100% dei casi (8). La medesima efficienza tecnica è stata ottenuta anche nell applicazione clinica della PCGD, anche se dal punto di vista dei risultati clinici bisogna fare alcune osservazioni. Infatti, il basso numero di gravidanze al momento ottenute suggerisce che l intera procedura necessità di miglioramenti, che saranno possibili con una migliore selezione dei pazienti afferenti alla tecnica (es. con buona riserva ovarica; età materna non superiore ai 40 anni) ed un affinamento della tecnica di biopsia del 1PB. Nonostante i limiti sopra descritti, la diagnosi pre-concepimento si è rivelata molto utile per quelle coppie portatrici di una malattia genetica che non vogliono affrontare la scelta dolorosa di un aborto terapeutico nel caso in cui, a seguito di diagnosi prenatale, venga individuato un feto affetto dalla specifica malattia. Tali coppie, dopo l approvazione della legge 40, sono alla ricerca di centri all estero, ubicati in Paesi con legislazioni meno restrittive, dove ottenere un trattamento sanitario mediante diagnosi preimpianto, ricorrendo al cosiddetto turismo procreativo. L opzione di un trattamento in Italia, mediante diagnosi genetica pre-concepimento, eviterà a queste coppie notevoli disagi, dovuti soprattutto al fatto di essere costretti a ricorrere ad un trattamento sanitario in un altro paese, con medici che non parlano la stessa lingua, affrontando ingenti spese, sia correlate al trattamento (costo della procedura, farmaci, visite mediche) che al viaggio e alla permanenza in loco. La diagnosi pre-concepimento potrà, inoltre, dare una speranza a molte coppie che non possono affrontare queste spese, a causa delle limitate disponibilità economiche. Ciò ha creato un iniquità di accesso alle pratiche sanitarie, diritto sancito costituzionalmente. L opzione della diagnosi sull ovocita fornisce alle coppie Italiane l opportunità di ottenere un accesso gratuito alle tecniche di PMA, i cui costi e quelli dei relativi farmaci sono a carico del Sistema Sanitario Nazionale. A parte l aspetto sociale, la diagnosi genetica pre-concepimento consente di superare un sentito problema etico, che è stata la causa principale del divieto della diagnosi preimpianto: la manipolazione dell embrione a fini diagnostici, quello che in molti hanno

8 definito come eugenetica. Utilizzando questa procedura, la diagnosi genetica viene eseguita sull ovocita, e non sull embrione. Grazie al test, quindi, si risolve definitivamente il problema della selezione genetica degli embrioni e dell'eliminazione degli embrioni malati. Infatti, a differenza della diagnosi preimpianto, che comporta l esclusione di quegli embrioni che all analisi genetica risultano affetti dalla specifica patologia genetica di cui la coppia è portatrice, con la diagnosi pre-concepimento, invece, si esclude a priori la possibilità di produrre embrioni con anomalie genetiche. Inoltre, stante le attuali restrizioni imposte dalla Legge 40 circa il numero di ovociti fertilizzabili (massimo tre), la diagnosi pre-concepimento rappresenta una tecnica più efficace rispetto alla diagnosi preimpianto effettuata nelle medesime condizioni. Infatti, dopo selezione genetica degli ovociti, gli embrioni che ne deriveranno saranno sicuramente sani. Con la diagnosi preimpianto, invece, gli embrioni potranno essere anche malati, e ciò comporterebbe una riduzione della sua efficienza. Ovviamente, come qualunque altra tecnica, la PCGD non rappresenta una procedura ideale per tutte le coppie. Infatti, l analisi non è applicabile in caso di malattie genetiche autosomiche dominanti di origine maschile; inoltre, per alcune malattie genetiche in cui il gene responsabile è localizzato in posizione telomerica (estremità terminale del cromosoma), l elevata incidenza dei fenomeni di ricombinazione riduce sensibilmente il numero di ovociti disponibili per la fecondazione, e di conseguenza le chance della coppia di ottenere un esito positivo. Per questa categoria di malattie genetiche, una buona riserva ovarica è quindi un requisito indispensabile per il successo della procedura. In conclusione, è prevedibile che la PCGD, rimuovendo il principale ostacolo etico (cioè il test genetico sugli embrioni), potrà in futuro rappresentare la soluzione che permette di conciliare le due opposte visioni di tutela dell embrione, e quindi ridurre la forte contrapposizione tra le parti in causa. Riferimenti Bibliografici 1. Italian Ministry of Health (2004) Guidelines on medically-assisted reproduction Law Decree 21 July Gazzetta Ufficiale n.191 (August 16, 2004). 2. Fiorentino F, Magli MC, Podini D, Ferraretti AP, Nuccitelli A, Vitale N, Baldi M, and Gianaroli L (2003) The minisequencing method: an alternative strategy for preimplantation genetic diagnosis of single gene disorders. Mol. Hum. Reprod 9, Fiorentino F., Biricik A., Karadayi H.; Berkil H., Karlıkaya G., Sertyel S., Podini D., Baldi M., Magli MC., Gianaroli L. and Kahraman S. (2004) Development and clinical application of a strategy for preimplantation genetic diagnosis of single gene disorders combined with HLA matching. Mol. Hum. Reprod. 10: Fiorentino F., Kahraman S., Karadayi H., Biricik A., Sertyel S., Karlıkaya G., Saglam Y., Nuccitelli A. and Baldi M. (2005) Short tandem repeats haplotyping of the HLA region in preimplatation HLA matching. Eur J Hum Genet. 13: Fiorentino F, Biricik A, Nuccitelli A, De Palma R, Kahraman S, Iacobelli M, Trengia V, Caserta D, Bonu MA, Borini A, et al. (2006) Strategies and clinical outcome of 250 cycles of Preimplantation Genetic Diagnosis for single gene disorders. Hum Reprod 21, Fiorentino F. (2008) Preimplantation Genetic Diagnosis, current status and future

9 prospects. 24^ Recent advances in obstetrics and gynaecology - W. Dunlop, W. Ledger - The Royal Society of Medicine Press. 7. Van de Velde H, De Rycke M, De Man C, De Hauwere K, Fiorentino F, Kahraman S, Pennings G, Verpoest W, Devroey P, Liebaers I. (2009) The experience of two European preimplantation genetic diagnosis centres on human leukocyte antigen typing. Hum Reprod. (In Press). 8. Fiorentino F, Biricik A, Nuccitelli A, De Palma R, Kahraman S, Sertyel S, Karadayi H, Cottone G, Baldi M, Caserta D, Moscarini M. Rapid protocol for pre-conception genetic diagnosis of single gene mutations by first polar body analysis: a possible solution for the Italian patients Prenatal Diagnosis (1): M Iacobelli, E Greco, L Rienzi, F Ubaldi, D Podini, A Nuccitelli, Jan Tesarik, M Baldi and F Fiorentino Preimplantation genetic diagnosis for Charcot Marie Tooth type X Reproductive BioMedicine Online 2003 Vol. 7, No Verlinsky Y, Ginsberg N, Lifchez A, Valle J, Moise J, Strom CM. (1990) Analysis of the first polar body: preconception genetic diagnosis. Hum Reprod. 5, Verlinsky Y, Rechitsky S, Cieslak J, Ivakhnenko V, Wolf G, Lifchez A, Kaplan B, Moise J, Walle J, White M et al. (1997) Preimplantation diagnosis of single gene disorders by two-step oocyte genetic analysis using first and second polar body. Biochem Mol Med 62, Kuliev A, Rechitsky S, Verlinsky O, Strom C, Verlinsky Y. (2001) Preembryonic diagnosis for sickle cell disease. Mol Cell Endocrinol. 183 Suppl 1, S19-22.