Valorizzazione tecnologica dei microrganismi autoctoni dei formaggi tradizionali lombardi

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1 Valorizzazione tecnologica dei microrganismi autoctoni dei formaggi tradizionali lombardi Morandi S., Brasca M., De Noni I. CNR Istituto di Scienze delle Produzioni alimentari (CNR-ISPA), Milano Dipartimento di Scienze per gli Alimenti, la Nutrizione e l Ambiente (DeFENS), Università degli Studi di Milano

2 ACCORDO QUADRO CNR-Regione Lombardia Bitto DOP Grasso d Alpe Fatulí Formagèla Valseriana Formaggella del Luinese DOP Formaggella della Valle di Scalve Formai de Mut DOP Semigrasso d Alpe Semuda Valtellina Casera DOP ARVA Formaggella della Valle di Scalve VALTEC Bitto DOP, Valtellina Casera DOP VARESEFERM Formaggella del Luinese DOP VALTEMAS Silter

3 839 Batteri autoctoni Genere Ceppi (n ) Specie (n ) Enterococcus Lactococcus Lactobacillus Leuconostoc Pediococcus Streptococcus Weissella

4 Enterococcus E. casseliflavus (1) E. durans (55) E. faecalis (140) E. faecium (157) E. gilvus (5) E. hirae (4) E. italicus (1) E. lactis (10) Enterococcus spp. (5) Lactobacillus Lb. brevis (4) Lb. casei (9) Lb. coryniformis (1) Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus (7) Lb. delbrueckii subsp. lactis (5) Lb. fermentum (17) Lb. parabuchneri (1) Lb. paracasei subsp. paracasei (49) Lb. plantarum (24) Lb. reuteri (1) Lb. rhamnosus (7) Streptococcus St. bovis (3) St. equinus (21) St. lutetiensis (3) St. macedonicus (6) St. parasanguinis (1) St. parauberis (4) St. salivarius (1) St. thermophilus (119) St. uberis (4) Streptococcus spp. (2) Leuconostocs Ln. citreum (3) Ln. lactis (5) Ln. mesenteroides (17) Ln. pseudomesenteroides (5) Lactococcus Lc. garvieae (21) Lc. lactis subsp. cremoris (21) Lc. lactis subsp. lactis (74) Lactococcus spp. (1) Weissella W. confusa (1) Pediococcus Pd. acidilactici (9) Pd. pentosaceus (15)

5 Caratterizzazione preliminare Morfologia al microscopio Temperature di crescita (15-45 C) Resistenza a sale (NaCl 2, 4, 6.5%) Produzione di CO 2 Identificazione e tipizzazione degli isolati Caratteristiche di interesse tecnologico Sequenziamento del 16S rrna RAPD-PCR (M13, D11344, D8635) rep-pcr, RSA PCR Attività acidificante Attività riducente Attività caseinolitica Attività lipolitica Prerequisiti di probioticità Sopravvivenza al tratto gastro-intestinale in vitro Capacità di aggregazione Idrolisi e resistenza ai sali di bile

6 Attività antimicrobica Listeria monocytogenes Staphylococcus aureus Bacillus cereus Escherichia coli Batteri lattici (13 specie) Clostridium spp. (4 specie) Pseudomonas spp. (6 specie) Geni enterocine enta, entas48, entb, entcrl35, entl50, entp, entq, ent1071, munks, bac31 Geni leucocine lccq, lccn, lcna, lcac, lacs, ppc7, mesi Gene Nisina nisp Antibiotico resistenza 14 antibiotici Geni antibiotici vana, vanb, vanc 1, vanc 2, vanc 3, vand, vane, vang tetk, tetl, tetm, teto, tets, int ermb, ermc Fattori di virulenza Gelatinasi Emolisi Ammine biogene Geni fattori di virulenza enterococchi cyla, asa1, gele, hyl, esp, ace, efaa Geni ammine biogene tdc, hdc

7 Distribuzione di Enterococcus spp. 94 ceppi 131 ceppi 57 ceppi 42 ceppi 37 ceppi E. casseliflavus E. durans E. faecium E. faecalis E. hirae E. italicus E. gilvus E. lactis Enterococcus spp.

8 Potenziale probioticità E. lactis Digestione in vitro Resistenza ai Sali di Bile in vitro Ceppo T 0 T 1 T 2 T LAPTg broth BT BT A LAPTg broth + Oxgall Risultati espressi in log 10 cfu/ml BT160 BT ore T 1 - Cavità orale: Lisozima (100 ppm) 37 C, 5 min T 2 - Digestione gastrica: Pepsina (5%), 37 C, 90 min; ph 3.0 T 3 - Digestione intestinale: Pancreatina (0.1 5%); Sali di bile (0.3%); 37 C, 150 min; ph 6.0 Nessun ceppo è resistente ai 14 antibiotici testati Attività antimicrobica E. durans E. faecium E. faecalis Cl. sporogenes Cl. tyrobutyricum Ps. syringae entp

9 Leuconostoc spp. (35 ceppi) Attività antimicrobica Antibiotico-resistenza Specie n ceppi Antibiotico n ceppi E. faecalis E. faecium E. durans E. hirae S. aureus Lb. fermentum Lb. helveticus Lb. reuteri Lb. paracasei subsp. paracasei St. thermophilus Ps. fluorescens Ps. aeruginosa Ps. syringae Ciprofloxacina Eritromicina Levofloxacina Oxacillina Penicillina G Streptomicina Tetraciclina Vancomicina Ampicillina Cloramfenicolo Mupirocina Nitrofurantonina Quinupristina/dalfopristina Rinfampicina mesi, lcna tetl (4), tetm (22), tets (2), int (1)

10 Progetto ValTec Caratterizzazione microbiologica 4 aziende Isolamento ceppi autoctoni Identificazione Caratterizzazione genotipica Caratterizzazione fenotipica Caratterizzazione tecnologica 2 Miscele starter

11 Progetto ValTec Lo starter ha dimostrato di costituire un ausilio per la corretta conduzione della caseificazione e quindi per l ottenimento di formaggi con le caratteristiche desiderate, senza standardizzare la produzione. I formaggi dei diversi produttori, presso i quali sono stati sperimentati gli starter, sono risultati distinguibili tra loro, dimostrando come, nonostante l impiego delle stesse miscele di fermenti, l identità di ciascuna azienda risulti comunque preservata e confermando che le caratteristiche dell allevamento e la pratica casearia rappresentano elementi determinanti per la qualità del formaggio. Forme 2008 senza innesto Forme 2009 con innesto

12 Progetto Valtemas Obiettivo: fornire ai produttori di Silter starter autoctoni liofilizzati preparati industrialmente (di pratico impiego e con costi sostenibili) con caratteristiche tecnologiche tali da garantire processi fermentativi capaci di ridurre il rischio di difetti e di mantenere le caratteristiche organolettiche e sensoriali tipiche del Silter. 50 ceppi autoctoni 11 miscele starter 4 miscele (15 ceppi) Idoneità dei ceppi al processo industriale 2 miscele

13 Curve di ph delle miscele 5 e 11 B Miscela 5 St. thermophilus, Ln. lactis, Lc. lactis subsp. lactis Miscela 11 St. thermophilus, Ln. lactis, Lc. lactis subsp. lactis R B: Minicaseificio R: Caseificio artigianale V: Cooperativa di medie dimensioni V

14 Log 10 cfu/g Leuconostoc cagliata 30 giorni 60 giorni 200 giorni Miscela 5 Miscela 11

15 Log 10 cfu/g Enterococchi cagliata 30 giorni 60 giorni 200 giorni Controllo Miscela 5

16 Log 10 cfu/g Enterococchi cagliata 30 giorni 60 giorni 200 giorni Controllo Miscela 11

17 Azienda B, minicaseificio, no innesto colore struttura occhiatura Miscela 5 Controllo 77% 15 assaggiatori 13% sapore struttura al tatto aroma odore colore struttura occhiatura Miscela 11 Controllo 47% sapore struttura al tatto 53% aroma odore

18 Azienda R, caseificio artigianale, no innesto colore struttura occhiatura 15 assaggiatori Miscela 5 Controllo 60% 40% sapore struttura al tatto aroma odore colore struttura occhiatura Miscela 11 Controllo sapore struttura al tatto 100% aroma odore

19 colore Azienda V, cooperativa di medie dimensioni, Innesto commerciale struttura occhiatura 17 assaggiatori Miscela 5 Controllo 88% 12% sapore struttura al tatto aroma odore colore struttura occhiatura Miscela 11 Controllo 70% 30% sapore struttura al tatto aroma odore

20 Conclusioni L ambiente e la tecnologia di produzione operano una pressione selettiva a favore di specifici biotipi batterici. La caratterizzazione tecnologica degli isolati permette di selezionare biotipi idonei per la formulazione di miscele starter autoctone. L impiego di starter autoctoni non comporta modifiche nelle caratteristiche del prodotto, infatti i formaggi delle lavorazioni sperimentali sono risultati distinguibili tra loro (l identità di ciascuna realtà produttiva viene preservata). L uso di miscele starter autoctone ha determinato un maggior apprezzamento sensoriale del formaggio. Miscela 5

21 Grazie per l attenzione