CARATTERIZZAZIONE FISICO-CHIMICA E MICROBIOLOGICA DI UNA PRODUZIONE A LATTE CRUDO DI CACIOTTA DELLA REGIONE MARCHE

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1 SCIENZA E TECNICA LATTIERO-CASEARIA, 59 (4), CARATTERIZZAZIONE FISICO-CHIMICA E MICROBIOLOGICA DI UNA PRODUZIONE A LATTE CRUDO DI CACIOTTA DELLA REGIONE MARCHE Sara SANTARELLI 1, Valentina BABINI 1, Lucia AQUILANTI 1 *, Sara PALAZZINI 1, Andrea OSIMANI 1, Elisabetta TUCCI 1, Cristiana GAROFALO 1, Francesca CLEMENTI 1 INTRODUZIONE Nell ambito di un progetto di caratterizzazione fisico-chimica e microbiologica di produzioni tradizionali a latte crudo della regione Marche [1], il presente studio si è focalizzato sulla Caciotta a latte misto, un formaggio incluso nell Elenco nazionale dei prodotti agro-alimentari tradizionali marchigiani. MATERIALI E METODI Il campionamento è stato effettuato un caseificio situato in provincia di Pesaro-Urbino, prelevando tre forme di uno stesso lotto (campioni no. 1, 2, 3) e una aliquota di latte-innesto, prodotto ed utilizzato presso lo stesso caseificio. Le analisi chimico-fisiche, microbiologiche e molecolari sono state effettuate come precedentemente descritto [1]. RISULTATI E DISCUSSIONE La caciotta in studio viene prodotta con latte crudo vaccino, aggiunto di latte crudo bovino, entrambi di provenienza locale. Al latte filtrato viene aggiunto latteinnesto (0,2%) e caglio in pasta di agnello (100 g/100 kg di latte), entrambi preparati presso il caseificio. La coagulazione, effettuata a 37 C per 15 min, è seguita dalla rottura manuale della cagliata. Prima dell estrazione, viene effettuata una sosta a 37 C per 5 min, cui segue la formatura manuale in stampi multipli, il ribaltamento e la stufatura a 38 C per circa 5 h. La salatura è a secco, massaggiando direttamente le forme con sale marino fino; la stagionatura viene condotta per circa 30 giorni in cella di maturazione (T 5 C) e per ulteriori 10 giorni a temperatura ambiente. Il prodotto finito ha forma rotonda; diametro: 16 cm; altezza 9 cm; peso 1-1,2 kg; lo scalzo è arrotondato; la pasta è bianca, di media consistenza e con una lieve occhiatura; la crosta è di colore giallo paglierino. L enumerazione di coliformi totali, Escherichia coli e Staphylococcus aureus ha rivelato conte vitali inferiori ai limiti di legge. L enumerazione della flora lat- * Corrispondenza ed estratti: l.aquilanti@univpm.it 1 Dipartimento di Scienze degli Alimenti, Università Politecnica delle Marche. Via Brecce Bianche, Ancona.

2 tica nei campioni di latte-innesto e formaggio ha condotto ai seguenti risultati: lattococchi 9,33 + 0,10 e 9,01 + 0,20 Log ufc/g; lattobacilli mesofili 6,73 + 0,07 e 8,47 + 0,08 Log ufc/g; cocchi termofili 8,63 + 0,27 e 7,79 + 0,34 Log UFC/g. I risultati delle analisi fisico-chimiche, effettuate su 100 g di formaggio, sono di seguito riportati come valore medio + deviazione standard: ph 5,6 + 0,1; a w 0,9 + 0,0; test di Kreis: negativo; NaCl 1,9 + 0,0 g; lipidi 26,8 +0,5 g; proteina totale 21,3 + 2,8 g. Dai fingerprints molecolari del DNA estratto da formaggio (dati non mostrati) si evidenzia la presenza, nei 3 campioni, di 3 bande ascrivibili alla specie Streptococcus thermophilus. L analisi del DNA estratto direttamente dai campioni di latte-innesto (dati non mostrati) e dai pool di colonie raccolti dalle piastre su cui sono state distribuite aliquote delle diluizioni dello starter naturale (Fig. 1 a, b, c) ha confermato la dominanza di St. thermophilus (bande se4-se7, sl4, sc2-sc7, sa2-sa8, sh2-sh5), riscontrato in tutti i campioni, e ha rivelato il contributo di Enterococcus lactis (bande sg2, sg3), Lactococcus lactis subsp. cremoris (banda sd4-sd7) e Lactobacillus buchneri/parabuchneri (banda sf2). Le specie St. thermophilus e E. lactis sono state precedentemente isolate da latte-innesti, dato questo che dimostra l effettiva selezione di specie termofile e termotolleranti nel latte termizzato. Mentre la specie St. thermophilus è tradizionalmente utilizzata per la formulazione di starter caseari, più dibattuto è l impiego di rappresentanti del genere Enterococcus nelle trasformazioni casearie [2]. L analisi DGGE effettuata sui pool di colonie relativi ai campioni di formaggio ha mostrato una più ampia biodiversità rispetto all analisi del DNA estratto da matrice (Fig. 1 d, e, f, g, h, i, l, m, n). I fingerprints della frazione coltivabile ha, inoltre, rivelato una sostanziale eterogeneità tra i 3 campioni, non correlabile alle materie prime utilizzate o ai parametri tecnologici, ma verosimilmente legata ad un mascheramento, in fase di amplificazione, delle specie meno rappresentate, per effetto di una competizione tra molecole stampo [3]. L analisi dei pool di colonie raccolte dalle piastre MRS (Fig. 1 d, e, f) ha mostrato il contributo delle specie St. thermophilus (bande 2N3, 2N5, 2N6, 3W5-3W8, 3Z6, 3V5, 3V7), St. pasteurianus (1C2-1C5), Lb. casei sensu latu (bande 3V5-3V7) Lc. lactis ssp. lactis (bande 3J3-3J6) e Leuconostoc mesenteroides (bande 1B2-1B7; 3Y3-3Y7); mentre le specie St. thermophilus e Leuconostoc mesenteroides sono state rilevate fino alle diluizioni più basse, St. pasteurianus e Lc. lactis ssp. lactis sono state identificate fino alla diluizione -5: questo dato mostra come queste ultime due specie siano quantitativamente meno rappresentative rispetto alle prime due, che risultano dominare il processo fermentativo. In generale, le specie individuate nel presente studio sono state precedentemente identificate in altre produzioni casearie a latte crudo [4], a conferma della elevata complessità microbica di tali produzioni, spesso caratterizzate da una flora avventizia non starter, importante, in fase di maturazione, per la produzione di composti aromatici [5]. 176 Santarelli et al (2008) Sci Tecn Latt-Cas, 59 (4),

3 Figura 1 Profili DGGE degli ampliconi ottenuti a partire dal DNA estratto dai pool di colonie sviluppatesi sui mezzi MRS ed M17 alle diverse diluizioni ( ) dei campioni di latte-innesto (a-c) e Caciotta (d-n). Figure 1 DGGE profiles of the amplicons obtained from the DNA extracted from the MRS and M17 bulk colonies harvested from different dilutions ( ) of thermized milk (panels a-c) and Caciotta (panels d-n). Santarelli et al (2008) Sci Tecn Latt-Cas, 59 (4),

4 L analisi PCR-DGGE dei pool di colonie sviluppatesi sulle piastre di M17 incubate a 22 C (Fig. 1 g, h, i) e a 45 C (Fig. 1 l, m, n) ha condotto a risultati analoghi a quelli ottenuti analizzando i pool di colonie sviluppatesi sul mezzo MRS, a dimostrazione della limitata selettività di tali terreni, già evidenziata in studi precedenti [3]. Oltre alle specie St. thermophilus (bande 2R5-2R8; 2K6-2K8; 2O8; 3A6, 3B6, 3H5-3H8; 3G5, 3G7-3G8; 3F6; 3E6; 1G2, 1E5-1E7, 1F2-1F4; 3B2-3B6; 3A5-3A6; 3X3-3X5; 3D4; 3C5, 3C7), Lc. lactis ssp. lactis (bande 2Q2-2Q4, 2T2-2T7, 3L2-3L5) e Leu. mesenteroides (bande 1I2-1I6, 2P2-2P7, 2S2-2S8, 3I2-3I8), l analisi dei bulk cellulari sviluppatesi sulle piastre di M17 a 45 C ha inoltre permesso di rilevare alle sole diluizioni -4 e -5, la presenza di rappresentanti del gruppo Lb. casei sensu latu e della specie St. pasteurianus dalla diluizione -2 alla -4. Come riportato in Letteratura, è frequente, nel corso di analisi PCR- DGGE, la visualizzazione di bande a diverse altezze, ascrivibili alla medesima specie: questo può essere dovuto, alla presenza, nello stesso genoma, di copie del gene codificante il 16S rrna caratterizzate da eterogeneità di sequenza [6] o, più semplicemente, alla presenza di ceppi biodiversi. RIASSUNTO La caratterizzazione fisico-chimica e microbiologica di una produzione di Caciotta a latte crudo della regione Marche ha permesso di verificare la buona qualità igienica di tale produzione e di valutarne i parametri compositivi. Le analisi PCR-DGGE condotte sul DNA estratto dal formaggio e dai pool di colonie sviluppatesi sui mezzi colturali MRS e M17 ha permesso di identificare le componenti della popolazione filo-casearia, dominata da St. thermophilus e Leu. mesenteroides, e caratterizzata dal contributo di numerose specie avventizie. Parole chiave: formaggi tradizionali e tipici, Caciotta, latte crudo, PCR-DGGE SUMMARY Physico-chemical and microbiological characterization of a raw milk manufacture of Caciotta cheese of the Marche region. The physicochemical and microbiological characterization of a manufacture of raw milk Caciotta of the Marche region allowed the high hygienic standard of such a production to be verified; the main compositional parameters (ph, a w, NaCl, lipids, proteins, rancidity, peroxides) have been also investigated. The PCR-DGGE analyses carried out onto the DNA extracted directly from the cheese samples and the bulk cells grown on MRS and M17 allowed the main components (St. thermophilus and Leu. mesenteroides) as well as the less representative species of the microbial community to be identified. Key words: typical and traditional cheeses, Caciotta, raw milk, PCR-DGGE Ringraziamenti: Progetto finanziato dalla Regione Marche (Legge 37/99 DGR 1234/05). Si ringrazia l Azienda Agricola Pala Luca, via ca Rio 7/a, Tavoleto (PU), per la fornitura dei campioni di latte-innesto e Caciotta 178 Santarelli et al (2008) Sci Tecn Latt-Cas, 59 (4),

5 BIBLIOGRAFIA 1) Babini V, Santarelli S, Aquilanti L, Bocci P, Osimani A, Tucci E, Garofalo C, Clementi F (2008). Caratterizzazione fisico-chimica e microbiologica di una produzione a latte crudo di caprino della regione Marche. Sci. Tecn. Latt.- Cas., in stampa. 2) Giraffa G (2003) Functionality of enterococci in dairy products. Int. J. Food Microbiol., 88, ) Aquilanti L, Santarelli S, Silvestri G, Osimani A, Petruzzelli A, Clementi F (2007). The microbial ecology of a typical Italian salami during its natural fermentation. Int. J. Food Microbiol., 120, ) Randazzo CL, Torriani S, Akkermans ADL, De Vos WM, Vaughan EE (2002). Diversity, dynamics, and activity of bacterial communities during production of an artisanal sicilian cheese as evaluated by 16S rrna analysis. App. Environ. Microbiol., 68, ) Albenzio M, Corbo MR, Rehman SU, Fox PE, De Angelis M, Corsetti., Sevi A, Gobbetti M (2001). Microbiological and biochemical characteristics of Canestrato Pugliese cheese made from raw milk, pasteurized milk or by heating the curd in hot whey. Int. J. Food Microbiol., 67, ) Dahllof I, Baillie H, Kjelleberg S (2000). rpob-based microbial community analysis avoids limitations inherent in 16S rrna gene intraspecies heterogeneity. Appl. Environ. Microbiol., 66, Santarelli et al (2008) Sci Tecn Latt-Cas, 59 (4),

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