VALUTAZIONE IGIENICO-SANITARIA E CARATTERIZZAZIONE MICROBIOLOGICA DELLA CACIOTTA CAPRINA A LATTE CRUDO DELL ISOLA DI CAPRAIA

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1 VALUTAZIONE IGIENICO-SANITARIA E CARATTERIZZAZIONE MICROBIOLOGICA DELLA CACIOTTA CAPRINA A LATTE CRUDO DELL ISOLA DI CAPRAIA CERRI D. 1, INNOCENTI E., FRATINI F. 1, EBANI V. V. 1, AMPOLA M. 3, ZUCCONI C., ANDREANI E. 1 1 Dipartimento Patologia Animale, Profilassi ed Igiene degli Alimenti - Università di Pisa; Dottore di ricerca in Patologia dei piccoli ruminanti; 3 Dottorando in Produzioni Animali, Sanità ed Igiene degli Alimenti nei Paesi a Clima Mediterraneo; Libero Professionista PAROLE CHIAVE: caciotta caprina, caratterizzazione fenotipica, batteri lattici KEY WORds: goat caciotta, phenotypical characterization, lactic acid bacteria ABSTRACT The main aim of the research is to carry out the phenotypical characterization of lactic acid bacteria isolated from goat caciotta in three cycles of caseification to prepare a native starter. Milk, curd and cheese samples have been analyzed to detect: total coliforms, Escherichia coli, Staphylococcus spp., lactic acid bacteria, yeasts and moulds. Total bacterial count (TBC) has been determined on milk as well. Staphilococci were represented on average with values of UFC/ml; total coliforms showes a progressively decreasing with seasoning (from UFC/ml to <5 UFC/ml); E. coli was represented on average with values <5 UFC/ml, while yeasts and moulds showed respectively values <1 UFC/ml e <3 UFM/ml. Medium milk TBC has been 1 UFC/ml; lactobacillus species showed a medium increasing until 1 seasoning day in each cycle of production with spikes of 9 millions UFC/ml in cheese at 1 days at the first caseification; lactococcus and enterococcus species were respresented with high values until seasoning day and successively showed a slow decreasing. About phenotypical characterization of lactic acid bacteria, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus plantarum, Lactococcus lactis lactis, Lactococcus cremoris e Enterococcus faecalis were found to be the main represented species. INTRODUZIONE L Isola di Capraia assieme alle isole di Gorgona, Elba, Pianosa, Montecristo, Giglio e Giannutri, appartiene al Parco Nazionale dell Arcipelago Toscano, il più grande parco marino d Europa; l isola ha una superficie di quasi kmq e uno sviluppo costiero di circa 3 km ed è sicuramente l isola più aspra e rocciosa dell arcipelago, caratterizzata da un terreno lavico che consente il proliferare di una vegetazione arbustiva tipica della macchia mediterranea. Fin dai tempi della civiltà etrusca la capra è sempre stata presente sull isola; tutt oggi permane un nucleo costituito da circa 1 capi, ufficialmente indenni da brucellosi, la maggior parte dei quali è rappresentato da soggetti derivati da incroci tra Saanen, Camosciata delle Alpi e Sarda, allevati allo stato semibrado. Questi animali possono usufruire sostanzialmente per tutto l anno di pascoli caratterizzati da essenze foraggiere ed arbustive peculiari dell isola che conferiscono al latte aromi e sapori unici. Il latte viene interamente trasformato per produrre la caciotta caprina a latte crudo dell Isola di Capraia che l ARSIA (Agenzia Regionale per lo Sviluppo e l Innovazione nel Settore

2 Agricolo-Forestale) ha inserito nell elenco dei prodotti tradizionali della Toscana. La caciotta viene prodotta nel periodo Marzo-Settembre con il latte della mungitura della sera e della mattina; tutte le operazioni del processo produttivo vengono svolte manualmente (rottura della cagliata, pressatura e salatura). Il prodotto è caratterizzato da un colore bianco leggermente paglierino, da una forma cilindrica del peso di circa - gr, la crosta è abbastanza evidente anche se piuttosto sottile, la pasta si presenta compatta e priva di occhiature con consistenza più asciutta rispetto ai caprini freschi. Il sapore è meno acido e più pronunciato in relazione al diverso stadio di maturazione del prodotto; generalmente viene consumata dopo 15- giorni di maturazione, fino ad un massimo di 3- giorni di stagionatura. La maturazione avviene all interno di apposite celle del laboratorio di trasformazione ad una temperatura di circa 1 C. La caciotta può essere trattata esternamente in crosta con olio d oliva sia per migliorarne l aspetto estetico, sia al fine di evitare eventuali crepe della crosta stessa legate a sbalzi di temperatura e ad eccessiva disidratazione. Scopo del presente lavoro è stato quello di effettuare la valutazione igienico-sanitaria e la caratterizzazione microbiologica della caciotta caprina a latte crudo dell Isola di Capraia al fine di individuare ceppi di batteri lattici da impiegare per la produzione di uno starter autoctono. MATERIALI E METODI L indagine ha preso in considerazione tre cicli di caseificazione eseguiti con la medesima modalità in tre diversi periodi dell anno (da Marzo a Settembre) nei locali del laboratorio di trasformazione dell allevamento. Il formaggio è stato prodotto secondo la seguente procedura: 1) Impiego del latte della mattina e della sera precedente refrigerato ad una temperatura di 3 C. ) Duplice filtrazione del latte con filtri monouso di cellulosa. 3) Riscaldamento a circa 35 C in caldaia di acciaio inox. ) Coagulazione con caglio in polvere di vitello (titolo di 1:15) (operazione eseguita a latte fermo). 5) Attesa del tempo di coagulazione: - minuti. ) Rottura della cagliata con rompicagliata in acciaio inox fino al raggiungimento delle dimensioni di un chicco di riso. 7) Prelievo e deposizione della cagliata in fuscelle di materiale plastico forato mediante accurata pressatura. ) Salatura superficiale con sale da cucina a circa 1 ore dalla preparazione e successivo ribaltamento della forma. 9) Stagionatura su assi di legno di abete a partire da un minimo di 15 giorni fino ad un massimo di 35 giorni in locali stabilmente abilitati a temperatura di circa 1 C. Per ciascuno dei 3 cicli di caseificazione oggetto dell indagine sono stati analizzati durante il processo di lavorazione i seguenti campioni del prodotto: latte prelevato in caldaia immediatamente prima del riscaldamento, cagliata appena terminata la rottura, formaggio a, 7, 1, 1, e 35 giorni di maturazione. Per il campionamento e l allestimento delle diluizioni si è fatto riferimento ai relativi Standard Internazionali FIL/IDF (5C: 1995 e 1C: 199). Il campione della cagliata, di circa grammi, è stato rapidamente conferito in contenitore sterile e refrigerato al laboratorio assieme al campione di latte di partenza; i formaggi sono invece stati fatti pervenire come forme intere per essere sottoposti alle analisi microbiologiche entro ore dal ricevimento. La determinazione del ph è stata eseguita mediante PHMETER GLP1 (Crison) con elettrodo ad infissione. Sui campioni di latte sono state eseguite diluizioni scalari da 1-1 a 1 - in Peptone Water sterile (Oxoid).

3 Dalla cagliata e da ogni forma è stato prelevato sterilmente un settore a spicchio dal quale sono stati ricavati 3 gr di prodotto impiegati per l allestimento della sospensione madre. Sono state eseguite diluizioni scalari da 1-1 a 1 - in citrato sodico sterile al %. Sul latte è stata determinata la carica mesofila totale mediante semina in doppio per inclusione di 1 ml di ciascuna diluizione in terreno PCA (Plate Count Agar) (Oxoid) ed incubazione a 3 C per 7 ore. Su latte, cagliata e campioni di formaggio sono state eseguite le seguenti determinazioni microbiologiche: 1) Coliformi totali mediante semina in doppio per spatolamento superficiale di, ml di ciascuna diluizione su piastre contenenti terreno VRBA (Violet Red Bile Agar) (Oxoid) ed incubazione a 37 C per ore. ) Escherichia coli mediante semina in doppio per spatolamento superficiale di, ml di ciascuna diluizione su piastre contenenti terreno TBX (Tryptone Bile X-Glucose Agar) (Oxoid) ed incubazione a C per ore. 3) Staphylococcus spp. mediante semina in doppio per spatolamento superficiale di, ml di ciascuna diluizione su piastre contenenti terreno Baird Parker Agar (Oxoid) con aggiunta di Tellurite Yolk Emulsion (Oxoid) e su piastre contenenti MSA (Mannitol Salt Agar) (Oxoid) e successiva incubazione a 37 C per ore. ) Enterococchi mediante semina in doppio per spatolamento superficiale su piastre contenenti terreno Kanamicina Esculina Azide Agar Base (Oxoid) con aggiunta di Kanamicin Selective Supplement (Oxoid) di, ml di ciascuna diluizione e incubazione a C per - ore. 5) Lattobacilli mesofili mediante semina in doppio per inclusione in terreno MRS Agar (Oxoid) acidificato a ph 5, con acido acetico glaciale di 1 ml di ciascuna diluizione e incubazione a 37 C per 7 ore in giara con atmosfera modificata al 5% di CO. ) Lattococchi mediante semina in doppio per inclusione in terreno M17 Agar (Oxoid) di 1 ml di ciascuna diluizione e incubazione a 3 C per ore. 7) Lieviti e muffe mediante semina in doppio per spatolamento superficiale di, ml di ciascuna diluizione su piastre contenenti terreno YGCA (Yeast Extract Glucose Chloramphenicol Agar) (Difco) e incubazione a 5 C per 5 giorni. (Salvatori Del Prato O., 199) La caratterizzazione fenotipica dei ceppi isolati è stata eseguita mediante API 5 CH (Biomerieux) per quanto riguarda lattobacilli e lattococchi, mediante API Strep per quanto riguarda gli enterococchi. (Innocenti et al., 1; Pedonese et al., ; Pedonese et al.(), ). RISULTATI Nelle tabelle 1,,3, sono riportati i risultati delle analisi microbiologiche dai quali emerge che i parametri igienico-sanitari rientrano costantemente nella norma. Nel grafico 1 relativo all andamento del ph nelle tre prove di caseificazione è possibile notare un decremento progressivo indice di una buona acidificazione (da valori di,5-,7 del latte fino a valori di 5 nel formaggio a 3 giorni ). Il grafico descrive l andamento dei batteri lattici nel 1 lotto di produzione; è possibile notare un picco di crescita dei lattococchi a giorni di stagionatura; i lattobacilli hanno un picco di crescita a 1 giorni, mentre gli enterococchi mostrano un picco a 7 giorni. Nel grafico 3 sono descritti gli andamenti dei batteri lattici relativi al lotto di produzione; il picco dei lattobacilli si ha al 7 giorno e i valori si mantengono elevati fino a 3 giorni, mentre i lattococchi mostrano il loro picco a giorni e gli enterococchi a 1 giorni. Il grafico, relativo al 3 lotto di produzione evidenzia come i lattobacilli si attestino su valori elevati a 7 giorni fino al picco massimo raggiunto al 3 giorno. I lattococchi raggiungono il picco massimo a 7 giorni e si mantengono su valori più elevati rispetto ai lattobacilli dal al 3 giorno; gli

4 enterococchi mostrano il loro picco a 7 giorni ed il loro andamento è pressoché sovrapponibile a quello dei lattobacilli. Nei grafici 5, e 7 vengono riportati gli andamenti dei batteri lattici per lotto di produzione; per quanto concerne i lattobacilli si ottengono curve simili nei 3 lotti con valori più elevati nel lotto a 3 giorni. L andamento degli enterococchi è sovrapponibile nei 3 lotti con punte massime nel lotto. Per quanto Tabella 1 Caratteristiche Microbiologiche e ph del Latte impiegato nelle 3 prove di caseificazione Prova 1 Prova Prova 3 CBT (ufc/ml) 1,x1 5 1,5x1 5 3,5x1 Stafilococchi (ufc/ml) Coliformi totali (ufc/ml) 5 5 E.Coli (ufc/ml) <5 <5 <5 Lattococchi (ufc/ml) 1,1x1,x1 3 1 Lattobacilli (ufc/ml) x Enterococchi (ufc/ml) 1x 1 <5 Lieviti (ufc/ml) <3 <1 <1 Muffe (ufc/ml) <5 <1 <1 ph,5,7,7 riguarda i lattococchi si assiste ad un andamento analogo nel 1 e 3 lotto di produzione, mentre il lotto presenta un andamento nettamente differente con valori più bassi rispetto agli altri due lotti. Tabella Risultati analisi microbiologiche effettuate nel corso della prima prova di caseificazione Cagliata gg 7 gg 1 gg 1 gg gg 3 gg Stafilococchi (ufc/ml) Coliformi totali (ufc/ml) < <1 E.Coli (ufc/ml) <5 55 <5 <5 5 <5 <5 Lattococchi (ufc/ml) 5x1 5 11,x1 x1,7x1 1,5x1 3,x1 7 x1 Lattobacilli (ufc/ml) 3x1 5 1,15x1 5 1,5x1 7 5x1 7 9x1 7 1x1 7 7,5x1 5 Enterococchi (ufc/ml),5x1 3x1 3,x1 1,5x1 5 x1 1,x1 9x1 5 Lieviti (ufc/ml) 5 1 1x1 1,5x1 75 <1 Muffe (ufc/ml) <1 ph,57 5, 5,3 5, 5,1 5 5,5

5 Tabella 3 Risultati analisi microbiologiche effettuate nel corso della seconda prova di caseificazione Cagliata gg 7 gg 1 gg 1 gg gg 3 gg Stafilococchi (ufc/ml) <1 < Coliformi totali (ufc/ml) <5 15 <1 <1 <1 E.Coli (ufc/ml) 1 <1 <1 <5 <5 <5 <5 Lattococchi (ufc/ml) ,x1 9,1x1 7 3,x1 7 1,5x1 7 1x1 Lattobacilli (ufc/ml) 9 7 x1 5 x1 x1 5 1,x1 7 1,x1 7 Enterococchi (ufc/ml) 95 1x1 x1 7 1,5x1 7 3,x1 1,5x1 7 1,x1 7 Lieviti (ufc/ml) <1 <1 <1 <1 <1 <1 Muffe (ufc/ml) <1 <1 5 1 <1 <1 <1 ph, 5,7 5,35 5,5 5, 5,1 5 Tabella Risultati analisi microbiologiche effettuate nel corso della terza prova di caseificazione Cagliata gg 7 gg 1 gg 1 gg gg 3 gg Stafilococchi (ufc/ml) < Coliformi totali (ufc/ml) E.Coli (ufc/ml) < <1 Lattococchi (ufc/ml) 1 1,x1 x1 3,5x1,5x1 7 9x1 7 3,7x1 7 Lattobacilli (ufc/ml) 1 1,5x1 x1 5 x1 5,1x x1 5 1,x1 Enterococchi (ufc/ml) <5 x1 5,5x1 1x1 1,1x1 1x1 x1 5 Lieviti (ufc/ml) <1 <1 Muffe (ufc/ml) 1 < <1 <1 ph,55 5,7 5,5 5,3 5, 5,1 5,1

6 Grafico 1 Valori ph,7,55,7,,5,57 5,7 5,5 5,3 5, 5,1 5,1 5,7 5,35 5,5 5, 5,1 5 5, 5,3 5, 5,1 5 5,5 Latte Cagliata Lotto Lotto 3 Lotto Grafico 1 Lotto 1 Latte Cagliata Lattococchi Lattobacilli Enterococchi Grafico 3 Lotto Latte Cagliata Lattococchi Lattobacilli Enterococchi

7 Grafico 3 Lotto Latte Cagliata Lattococchi Lattobacilli Enterococchi Grafico 5 Lattococchi Latte Cagliata Lotto Lotto 3 Lotto Grafico Lattobacilli Latte Cagliata Lotto Lotto 3 Lotto

8 Enterococchi Latte Cagliata Lotto Lotto 3 Lotto Le specie di batteri lattici identificate mediante Api System, isolate sia a partire dal latte che dai campioni di formaggio, sono state le seguenti: Lactobacillus paracasei, Lactobacillus plantarum, Lactococcus lactis lactis, Lactococcus cremoris ed Enterococcus faecalis. CONCLUSIONI Dalla valutazione dei risultati degli esami microbiologici eseguiti sui campioni prelevati nei tre cicli di produzione si evidenzia una buona qualità del latte di partenza in relazione alla CBT, alla colimetria ed al numero di stafilococchi coagulasi positivi. Nei campioni di formaggio si osserva sostanzialmente un buon andamento delle cariche batteriche riconducibili a coliformi ed a stafilococchi coagulasi positivi, le quali subiscono fluttuazioni durante i vari stadi di maturazione rientrando però nei valori previsti per le produzioni lattiero casearie a latte crudo; si evidenzia come sia molto contenuta anche la presenza di lieviti e muffe. Pertanto i risultati conseguiti ci permettono di affermare che in questa azienda si adempie correttamente alle BPL (Buone Pratiche di Lavorazione) sia nella fase di mungitura e stoccaggio del latte, sia all interno del laboratorio di trasformazione, durante tutte le fasi del processo di caseificazione. Per quanto concerne i batteri lattici si evidenziano cariche elevate relative ai lattobacilli che mantengono valori relativamente alti a partire dalla prima settimana fino alla quinta mentre i lattococchi presentano un picco elevato al secondo giorno contribuendo notevolmente all acidificazione, fatta eccezione per il secondo lotto di produzione nel quale hanno avuto un comportamento anomalo. L andamento delle cariche relative agli enterococchi è molto simile a quello dei lattobacilli con cariche massime nella seconda e quarta settimana. La spiccata prevalenza, sia nel latte che nel formaggio, di specie omofermentanti, quali i lattococchi, e di specie eterofermentanti facoltative quali i lattobacilli ha sicuramente importanza durante l acidificazione della cagliata (Dellaglio et al.,1995). Il loro metabolismo infatti provoca una diminuzione del ph tale da demineralizzare la caseina, primo importante passo verso la caseificazione. Questo ha condotto ad un buon processo globale di acidificazione del formaggio, raggiungendo a 35 giorni di stagionatura valori di

9 ph compresi tra 5 e 5,1. Non meno importante risulta il ruolo svolto dagli enterococchi, ben rappresentati nella caciotta caprina, i quali possono avere funzione significativa durante il periodo di maturazione del prodotto in relazione al loro potere proteolitico. Questi microrganismi, essendo molto resistenti al sale e diffusi nell ambiente, vengono spesso isolati da produzioni casearie artigianali (Rossi et al., 199; Macedo et al.,1995; Pedonese et al,(1). ). Gli enterococchi non possono però essere considerati dei meri contaminanti tanto che alcuni Autori riconoscono loro un ruolo filo-caseario e li impiegano, come starter, per la produzione di formaggi diversi (Cenci Goga et al., 1995). Concludendo possiamo affermare che le specie identificate in questa indagine dimostrano tutte un ruolo ben preciso durante la caseificazione e la maturazione della caciotta prodotta da latte crudo caprino, senza aggiunta di starter. I lattococchi mesofili, probabilmente assieme ai lattobacilli avviano l acidificazione della cagliata e, quindi, il processo di caseificazione. Durante la maturazione del formaggio, gli stessi lattococchi, i lattobacilli e in particolare gli enterococchi, manifestano la loro azione proteolitica che contribuisce a conferire sapore al prodotto. Alcuni tra i ceppi isolati potrebbero dunque venire impiegati per l allestimento di uno starter autoctono da utilizzare per la caciotta a base di latte crudo di capra dell Isola di Capraia, al fine di ottenere una produzione con caratteristiche igienico-sanitarie, organolettiche e merceologiche molto più costanti nel tempo. Ovviamente per poter far questo saranno necessari step fondamentali inerenti ai ceppi dei batteri lattici isolati, a partire dalla conferma della identificazione fenotipica mediante identificazione genotipica (PCR specie-specifica), biotipizzazione genotipica (REP-PCR e RAPD-PCR) ed infine gli esami relativi alle caratteristiche metaboliche dei ceppi così identificati: il potere acidificante, la determinazione dell attività proteolitica, aminopeptidasica, glutammato-deidrogenasica, nonché il dosaggio di acetaldeide e diacetile. BIBLIOGRAFIA Cenci Goga B.T, Clementi F., Di Antonio E., 1995 Behaviour of lactic e non lactic duringthe production and ripening of farmanufactured Pecorino cheese Annali di Microbiologia e Enzimologia 5: Dellaglio F., Torriani S., Pattarini F., Ricci C, Di Bucchiarico R., 1995 Identificazione e caratterizzazione tecnologica della microflora lattica naturale del formaggio Pecorino d Abruzzo Scienza e tecnica lattiero casearia : -97 Innocenti E., Pedonese F., Nuvoloni R., Gerardo B., Giraffa G., Cerri D.1 Identificazione fenotipica e genotipica di batteri lattici isolati da formaggio pecorino a latte crudo. Atti A.I.V.I., XI Macedo A.C, Malcata F.X, Hogg T.A., 1995 Microbiological Profile in Serra ewes cheese during ripening. Journal of Applied Bacteriology 79: 1-11 Pedonese F., Nuvoloni R., D'Ascenzi C., Innocenti E., Cerri D.,Rindi S. Caratterizzazione microbiologica di formaggio artigianale prodotto da latte crudo di pecore di razza massese. Atti VIII Congresso Fe. Me. S.P.Rum Pedonese F., Innocenti E., Nuvoloni R., Gerardo B., Cerri D., Rindi S., Sensibilità agli antibiotici,attività emolitica ed attività termonucleasica di enterococchi isolati da formaggi pecorini tradizionali a latte crudo. Atti A.I.V.I. Vol. XII, , (1) Pedonese F., Innocenti E., Nuvoloni R., D'Ascenzi C., Giraffa G., Neviani E., Rindi S., Cerri D., Caratterizzazione delle microflore autoctone del formaggio tradizionale

10 ovino prodotto nel Parco Regionale Migliarino, San Rossore, Massaciuccoli, Scienza e Tecnica Lattiero-casearia, n.. 3, vol. 53, 13-3, () Rossi J., Durant C., Gobetti M., 199 Indagine preliminare sull impiego di enterococchi nella produzione di Pecorino Umbro Industria del Latte 3: 1-53 Salvatori Del Prato O., 1 Trattato di tecnologia casearia Edagricole Bologna Cap.(3,5,9,11,1,)