Analisi Chimico Farmaceutica e Tossicologica con Laboratorio

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1 Analisi Chimico Farmaceutica e Tossicologica con Laboratorio corso di Laurea in Farmacia canale A-L anno accademico Dr. Antonio Coluccia Dipartimento di Chimica e Tecnologie del Farmaco Sapienza Università di Roma Piazzale Aldo Moro 5, I-00185, Rome, Italy antonio.coluccia@uniroma1.it 16

2 Analisi qualitativa inorganica Ca, Ba, Sr Si ricercano al quinto gruppo analitico quegli elementi i cui carbonati sono insolubili in ambiente debolmente alcalino (ph = 9), quali calcio, stronzio ed il bario. Se la dissoluzione del campione è stata effettuata con la tecnica dell attacco solfonitrico, lo stronzio ed il bario precipitano sotto forma di solfati e vanno pertanto cercati nel residuo insolubile anziché al quinto gruppo analitico. Tracce di stronzio e bario, possono, tuttavia, essere ancora presenti.

3 Analisi qualitativa inorganica Ca, Ba, Sr Dissoluzione del campione Attacco solfonitrico (accortezze) L acido solforico usato nell attacco solfonitrico trasforma in solfati insolubili i sali di bario e stronzio; questi due elementi andranno perciò ricercati nel residuo insolubile che si ottiene al termine dell attacco. L acido nitrico ossida quantitativamente i sali mercurosi a mercurici pertanto la ricerca del mercurio andrà effettuata esclusivamente al secondo gruppo.

4 Analisi qualitativa inorganica Ca, Ba, Sr PRIMO GRUPPO ed RESIDUO INSOLUBILE RESIDUO INSOLUBILE BaSO 4 (bianco); SrSO 4 (bianco); Questi cationi possono essere ricercati tramite via secca In particolare tramite il saggio alla Fiamma Accortezza: i solfuri sono poco volatili

5 Analisi qualitativa inorganica Ca, Ba, Sr Si tenga presente che quello che definiamo residuo insolubile viene ripreso con HCl 2N. Il CaCO 3 è invece solubile in HCl

6 Analisi qualitativa inorganica Ca, Ba, Sr Come reattivo precipitante del gruppo viene usato (NH 4 ) 2 CO 3 in ambiente ammoniacale, tamponato con NH 4 Cl per evitare la precipitazione del magnesio. Il precipitato sarà costituito da carbonato di calcio, con eventuali tracce di carbonato di stronzio e di bario, entrambi di colore bianco.

7 Analisi qualitativa inorganica Ca, Ba, Sr 1) La soluzione dalla quale è stato precipitato il quarto gruppo analitico viene centrifugata allo scopo di eliminare le ultime particelle di precipitato. 2) viene trasferita in crogiuolo ed evaporata fino quasi a secchezza. 3) Dopo raffreddamento si aggiungono 1-2 gocce di HNO 3 concentrato e si evapora a secchezza. 4) Successivamente si calcina sino ad eliminazione completa dei sali di ammonio. (Perché?)

8 Analisi qualitativa inorganica Ca, Ba, Sr L eliminazione dei sali di ammonio è necessaria in quanto un loro eccesso farebbe retrocedere la dissociazione di (NH 4 ) 2 CO 3. La concentrazione degli ioni CO 2, che dipende dall alcalinità dell ambiente, diminuirebbe sino a rendere incompleta la precipitazione dei carbonati. Dopo raffreddamento, si riprende il contenuto del crogiuolo con 1-2 ml di HCl 2N, scaldando dolcemente per favorire la dissoluzione del residuo.

9 Analisi qualitativa inorganica Ca, Ba, Sr Alla soluzione cloridrica così ottenuta si aggiunge goccia a goccia ammoniaca concentrata sino a ph = Si aggiungono quindi 1-2 punte di spatole di (NH 4 ) 2 CO 3 solido e si lascia reagire per minuti. Se (NH 4 ) 2 CO 3 stenta a sciogliersi si tenga a bagnomaria appena tiepido (un bagnomaria bollente decompone il reattivo). Si formerà lentamente un precipitato bianco cristallino di CaCO 3, eventualmente contaminato da tracce di SrCO 3 (bianco) e BaCO 3 (bianco).

10 Analisi qualitativa inorganica Ca, Ba, Sr Ca 2+ +(NH 4 ) 2 CO 3 CaCO 3(s) +2NH 4 + Dopo centrifugazione e verifica della completezza della precipitazione sulla soluzione (su cui si cercheranno i cationi del VI gruppo), il precipitato viene lavato con una soluzione di NH 4 Cl cui stata aggiunta 1 goccia di NH 3 concentrata. Preventivamente, il precipitato dei carbonati può essere saggiato alla fiamma.

11 Analisi qualitativa inorganica Analisi del Ca ed eliminazione di Ba ed Sr Prima di procedere alla ricerca del calcio, occorre eliminare lo stronzio ed il bario eventualmente presenti nel precipitato. Stronzio e bario sono sicuramente presenti se si è disciolto il campione in esame in acido cloridrico.

12 Analisi qualitativa inorganica Analisi del Ca ed eliminazione di Ba ed Sr A tale scopo, il precipitato dei carbonati viene disciolto in CH 3 COOH 2N tenendolo in bagnomaria bollente per 10 minuti, in modo da eliminare completamente l anidride carbonica che si sviluppa: CaCO 3 + 2CH 3 COOH Ca CH 3 COO + CO 2 + H 2 O Dopo raffreddamento, si divide la soluzione acetica limpida in 2 porzioni: in una si cercherà il calcio e nell altra lo stronzio ed il bario.

13 Analisi qualitativa inorganica Analisi del Ca ed eliminazione di Ba ed Sr Ad una porzione della soluzione acetica si aggiungono circa 10 gocce di una soluzione di (NH 4 ) 2 SO 4, e si scalda a bagnomaria per 5 minuti. Dopo raffreddamento, si centrifuga la sospensione e si scarta il precipitato, costituito dai solfati di stronzio e bario oltre ad una piccola quantità di quello di calcio. La concentrazione di Ca 2+ che resta in soluzione è, tuttavia, sufficiente a consentirne l identificazione.

14 Analisi qualitativa inorganica Saggio del Ca A) Saggio con ossalato ammonico Alla soluzione limpida si aggiungono 3-4 gocce di una soluzione di (NH 4 ) 2 C 2 O 4, ossalato ammonico e si scalda a bagnomaria per qualche minuto. In presenza di calcio si forma un precipitato bianco cristallino, finemente suddiviso, di ossalato di calcio: Ca 2+ + OOC COO CaC 2 O 4(s)

15 Analisi qualitativa inorganica Saggio del Ca B) Saggio alla fiamma Dopo raffreddamento, si centrifuga la sospensione ottenuta, si scarta la soluzione e si conferma la presenza del calcio mediante saggio alla fiamma sul precipitato.

16 Analisi qualitativa inorganica Saggio del Ba ed Sr A 10 gocce di una porzione della soluzione acetica poste in una provetta da centrifuga si aggiungono altrettante gocce di reattivo di Caron ((NH 4 ) 2 Cr 2 O 7 e NH 3 concentrata in CH 3 COOH). In presenza di bario, si ha la formazione di un precipitato giallo di BaCrO4: CrO Ba 2+ BaCrO 4 Si centrifuga la sospensione ottenuta, si separa la soluzione e si conferma la presenza del bario mediante saggio alla fiamma sul precipitato.

17 Analisi qualitativa inorganica Ricerca del Ba Centrifughiamo la soluzione alla quale abbiamo aggiunto il reattivo di Caron eliminiamo l eventuale precipitato e riprendiamo con NH 4 OH 2N fino a colorazione gialla e gocce di CH 3 CH 2 OH, e si scalda a bagnomaria. In presenza di stronzio, si ha la formazione di un precipitato giallo di SrCrO4: CrO Sr 2+ SrCrO 4 Dopo raffreddamento, si centrifuga la sospensione ottenuta, si scarta la soluzione e si conferma la presenza dello stronzio mediante saggio alla fiamma sul precipitato.

18 Ca, Ba, Sr Ci sono due modi per analizzare il quinto gruppo analitico. Uno consiste nel far precipitare i cationi di questo gruppo come carbonati (CO 3 2- ), mentre l'altro consiste nel ricercarli come acetati. (CH 3 COO - )

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20 Ca, Ba, Sr Reattivo precipitante Acetato Nel caso della ricerca degli acetati la soluzione alcalina deve essere acidificata con acido cloridrico. Ricordiamo che l'acidificazione è funzionale all'eliminazione dello ione carbonato dalla soluzione sotto forma di anidride carbonica (CO 2 ). CO H + H 2 CO 3 = CO 2(g) + H 2 O

21 Ca, Ba, Sr Reattivo precipitante Acetato La reazione procede quindi con sviluppo di effervescenza dovuta all'allontanamento di anidride carbonica. Proprio l'effervescenza è un indicatore dal punto di vista pratico. Si deve continuare ad aggiungere acido, possibilmente a caldo (per allontanare meglio CO 2 ) finchè non si smette di osservare l'effervescenza. Così possiamo essere sicuri di aver allontanato in modo pressochè quantitativo lo ione carbonato. Questi deve essere eliminato perchè interferirebbe con saggi di riconoscimento successivo.

22 Ca, Ba, Sr Reattivo precipitante Acetato Il bario viene separato dallo stronzio e ricercato per utilizzo del reattivo di Caron - Raquet. Il reattivo di Caron - Raquet è un reattivo molto specifico per la precipitazione del bario. Si tratta di bicromato di ammonio in acetato di ammonio ((NH 4 ) 2 Cr 2 O 7 in CH 3 COONH 4 ). Alcune gocce di questo reattivo vengono aggiunte alla nostra soluzione acetica (ph 4-5). La soluzione dovrebbe assumere un colore leggermente aranciato (bicromato).

23 Ca, Ba, Sr Reattivo precipitante Acetato Il reattivo lascia disponibile solo la quantità minima di cromato necessario a far precipitare il cromato di bario. Le concentrazioni relative di cromato e bicromato sono legate da un equilibrio ph dipendente: 2CrO H + 2HCrO 4 - Cr 2 O H 2 O Man mano che precipita il cromato di bario, l'equilibrio si sposta a sinistra, con sviluppo di acidità (2H + ). L'eccesso di acidità farebbe retrocedere l'equilibrio nella direzione del dicromato, ma viene tamponato da CH 3 COO -. Si mantiene così sempre una concentrazione di cromato sufficiente per la precipitazione del solo cromato di bario.

24 Ca, Ba, Sr Reattivo precipitante Acetato 2CrO H + 2HCrO 4 - Cr 2 O H 2 O Si mantiene così sempre una concentrazione di cromato sufficiente per la precipitazione del solo cromato di bario. Il cromato di bario tra l'altro, è nettamente meno solubile del cromato di stronzio (il cromato di calcio può essere considerato solubile) Kps BaCrO4 = 2, Kps SrCrO4 = 3,6 10-5

25 Ca, Ba, Sr Reattivo precipitante Acetato Ricapitolando, la reazione che avviene è: 2Ba 2+ + CH 3 COO - + Cr 2 O H 2 O 2BaCrO 4 + 2CH 3 COOH Precipitato giallo

26 Ca, Ba, Sr Reattivo precipitante Acetato Il precipitato viene centrifugato e separato. Sulla soluzione sovranatante bisogna verificare se la precipitazione del cromato di bario è stata quantitativa o meno. Si aggiungono altre 2-3 gocce di reattivo. Se si ottiene nuovamente del precipitato si centrifuga e separa di nuovo. Si ripete l'operazione fintanto che si ottiene del precipitato. E' importante la rimozione totale del bario dalla soluzione. Questo perchè nella soluzione sovranatante andremo a cercare lo stronzio facendolo precipitare proprio come cromato di stronzio, anch'esso giallo.

27 Calcio CaCl 2, cloruro di calcio. Usato come reintegratore in casi di ipocalcemia; ha anche potere emostatico in quanto astringente. Ca(CH 3 COO) 2, acetato di calcio. Usato come reintegratore, anche in soluzioni per emodialisi. CaHPO 4, idrogeno fosfato di calcio. Usato come antirachitico e anticarie. Ca(OH) 2, idrossido di calcio. Impiegato come astringente per uso esterno ed antiacido per via orale.

28 Calcio CaCO 3, carbonato di calcio, e Ca(HCO 3 ) 2, idrogeno carbonato di calcio. Impiegati come astringente per uso esterno ed antiacidi per via orale. CaBr 2, bromuro di calcio. Ha azione sedativa. CaSO 4, solfato di calcio. Usato nelle ingessature. Ca 3 (PO 4 ) 2, fosfato di calcio. Eccipiente e diluente in preparazioni farmaceutiche solide. Ca(ClO) 2, ipoclorito di calcio. Usato come disinfettante di acque di piscine.

29 Calcio Na 2 CaEDTA. Detossificante di cationi metallici bivalenti. Quali reintegratori contro la ipocalcemia si usano, inoltre, vari composti Ca-organici, quali Ca-pantotenato, Ca-lattato, Cagluconato, Ca-glicerofosfato, ecc. L organismo umano contiene circa 1 Kg di calcio, distribuito nelle ossa (90%), nei denti e nei liquidi biologici.

30 Calcio Il calcio svolge nel nostro organismo funzioni di vitale importanza: è essenziale per il normale funzionamento delle membrane eccitabili, per l attività cardiaca, per l attività di numerosi enzimi, per la coagulazione del sangue, ecc. Il metabolismo del calcio è regolato da 3 fattori: paratormone, calcitonina (secreti entrambi dalle paratiroidi) e vitamina D (antirachitica). Un alterazione del suo metabolismo può generare stati di ipocalcemia o ipercalcemia.

31 Calcio L ipocalcemia di tipo cronico è caratterizzata da rachitismo, malattie ossee, predisposizione alla carie dentaria e alle emorragie. L ipocalcemia acuta porta a ipereccitabilità nervosa e muscolare con conseguente aritmia cardiaca e tachicardia. L ipercalcemia è caratterizzata, al contrario, da ipofunzionalità nervosa e muscolare con conseguente bradicardia, astenia, atonia; si può anche osservare l insorgenza di calcolosi renale per formazione di sali poco solubili.

32 Bario BaSO 4, solfato di bario. Sale molto insolubile è largamente usato come radiopaco nelle radiografie ai raggi X dell apparato gastroenterico grazie alle proprietà di assorbimento che il bario possiede nei confronti di queste radiazioni elettromagnetiche. Esistono alcuni sali di bario che trovano impiego come bruchicidi nelle coltivazioni da tabacco (BaSiF 6 ). Il meccanismo dell azione tossicologica è da ricondursi alla sua capacità di essere catione chemio-antagonista dello ione calcio e di provocare stati acuti di ipocalcemia.

33 Bario Il quadro sintomatologico, nell avvelenamento da bario, comprende progressivamente vomito, diarrea, crampi muscolari, spasmi, vasocostrizione, aritmia cardiaca fino all arresto cardiaco. Classici antidoti negli avvelenamenti da derivati solubili del bario sono i solfati alcalini che provocano la precipitazione di BaSO 4, altamente insolubile a livello gastrico.

34 VI GRUPPO ANALITICO Si ricercano al sesto gruppo analitico tutti gli elementi i cui cationi non sono stati precipitati nei gruppi precedenti: magnesio, litio, potassio. Non esiste per questo gruppo un reattivo precipitante: la ricerca dei vari cationi va fatta direttamente sulla soluzione da cui è stato precipitato il quinto gruppo.

35 VI GRUPPO ANALITICO Il magnesio viene ricercato con i seguenti saggi: A) Saggio con fosfato bisodico B) Saggio con chinalizarina. A) Saggio con fosfato bisodico. Una porzione della soluzione in esame viene addizionata di 2-3 gocce di NH 3 concentrata e di 0,5 ml di una soluzione di Na 2 HPO 4. In presenza di magnesio si forma lentamente un precipitato bianco di fosfato ammonico-magnesiaco: Mg 2+ + NH 3 + HPO 4 2- Mg(NH 4 ) 2 PO 4(s)

36 VI GRUPPO ANALITICO Il magnesio viene ricercato con i seguenti saggi: B) Saggio con chinalizarina. Saggio con chinalizarina. Ad una porzione della soluzione in esame si aggiungono 3-4 gocce di soluzione di chinalizarina e 0,5 ml di NaOH 6N. In presenza di magnesio si forma un precipitato gelatinoso di colore blu, sospeso nella soluzione dello stesso colore, ma nettamente visibile se si guarda la provetta contro uno sfondo bianco.

37 VI GRUPPO ANALITICO Il magnesio viene ricercato con i seguenti saggi: B) Saggio con chinalizarina. Scaldando per qualche minuto a bagnomaria il precipitato coagula, mentre la soluzione si decolora per effetto della decomposizione del colorante. Poiché questo saggio è molto sensibile è consigliabile effettuare una prova in bianco su acqua distillata. L aggiunta di NaOH 6N deve provocare il viraggio della chinalizarina dal rosso cupo al blu violetto, senza che abbia luogo la formazione del precipitato blu.

38 VI GRUPPO ANALITICO Il magnesio viene ricercato con i seguenti saggi: B) Saggio con chinalizarina. L intensa colorazione in blu è dovuta ad un fenomeno di adsorbimento simile a quello dell idrossido di alluminio con l alizarina S.

39 VI GRUPPO ANALITICO ricerca litio, sodio e potassio Una porzione della soluzione in esame viene portata a secco in crogiuolo e successivamente calcinata sino ad eliminazione completa dei sali di ammonio. Dopo raffreddamento si inumidisce il fondo del crogiuolo con 2-3 gocce di acido cloridrico 2N e si scalda lievemente. Sulla soluzione così ottenuta si ricercano litio, sodio e potassio mediante saggio alla fiamma.

40 Magnesio Esiste un gran numero di composti del magnesio che sono impiegati in campo terapeutico, soprattutto quali antiacidi e lassativi: MgO (ossido di magnesio), Mg(OH) 2 (idrossido di magnesio), MgCO 3 (carbonato di magnesio), 4MgCO 3 Mg(OH) 2 5H 2 O (carbonato basico di magnesio), Mg 3 (PO 4 ) 2 (fosfato di magnesio). MgSO 4 7H 2 O, solfato di magnesio eptaidrato o sale inglese, Usato come purganti.

41 Magnesio 2MgO 3SiO 2 nh 2 O, trisilicato di magnesio. Ad azione antiacida, antigastritica e antiulcera, adsorbente intestinale. 3MgO 4SiO 2 H 2 O, talco. Aspersorio, antiperspirante, lubrificante solido. Mg-stearato. Lubrificante solido. MgCl 2, cloruro di magnesio, e Mg(CH 3 COO) 2, acetato di magnesio. Usati come reintegratori, anche in soluzioni per emodialisi.

42 Magnesio Sotto forma di fosfato entra nella costituzione delle ossa e dei denti; come ione Mg2+ è essenziale per il metabolismo cellulare ed in particolare per le reazioni a cui partecipa l ATP catalizzate da enzimi Mg-dipendenti. A livello biologico esiste un attività competitiva tra Ca2+ e Mg2+, così come risulta dal fatto che un alterazione del metabolismo di uno di questi ioni si riflette nel metabolismo dell altro

43 Magnesio Il magnesio deprime il sistema nervoso centrale ed induce ipotensione; alte concentrazioni ematiche possono produrre effetti ipnotici, analgesici ed anestetici con diminuzione della frequenza cardiaca. L attività purgativa e/o lassativa è dovuta da un lato alla forte capacità di Mg2+ a idratarsi e produrre quindi idratazione delle masse fecali, dall altro ad un azione irritante che lo ione causa a livello delle mucose intestinali inducendo un aumento della peristalsi.

44 VI GRUPPO ANALITICO Litio Li 2 CO 3, carbonato di litio. Usato in terapia nel controllo dei disturbi bipolari o sindromi maniaco-depressive. Li-glutammato, Li-gluconato, Li-citrato, Li 2 SO 4, LiCl e LiBr possono sostituire Li 2 CO 3 nelle stesse indicazioni terapeutiche. LiClO, ipoclorito di litio. Usato come disinfettante delle acque di piscine. In commercio esistono acque minerali litiache e iperlitiache a contenuto di Li+ particolarmente alto.

45 VI GRUPPO ANALITICO Litio A causa del frequente uso come psicofarmaco il litio ha evidenziato notevoli azioni tossiche, di tipo cronico, quali disfunzioni tiroidee, gastro-enteriti, obesità e lesioni cutanee. Nell intossicazione acuta da litio, i sintomi sono rappresentati da sonnolenza, atassia muscolare, vomito, diarrea, danni renali sino ad un interessamento, nei casi più gravi, del sistema nervoso centrale. Evidenze sperimentali hanno messo in luce le potenzialità teratogene del litio, dovute probabilmente alla sua capacità di sostituirsi a Mg2+ a livello dei gruppi fosfato del DNA

46 VI GRUPPO ANALITICO Litio Sebbene non esista uno specifico antidoto per l intossicazione da litio, l impiego di diuretici aiuta, tuttavia, a ridurre la sua concentrazione. E stato ipotizzato che Li+ è in grado di competere con Na+ e Mg2+ a livello di vari siti biologici, con alterazione degli equilibri elettrolitici di membrana e ritenzione di acqua. Il litio è in grado di permeare le membrane in forma di anione LiCO 3 (simile a HCO 3 ) e per interazione con l inositolo, presente nei fosfolipidi di membrana.

47 VI GRUPPO ANALITICO Sodio NaCl, cloruro di sodio, e Na 2 HPO 4 12H 2 O, idrogeno fosfato di sodio. Reintegratori sodici. Na 2 SO 4 10H 2 O, solfato di sodio, sale di Glauber. Purgante con azione irritante sulle mucose intestinali. Na 2 CO 3 xh 2 O, carbonato di sodio idrato. Debole alcalinizzante in preparazioni farmaceutiche. NaHCO 3, idrogenocarbonato di sodio. Debole alcalinizzante in preparazioni farmaceutiche, antiacido per via orale.

48 VI GRUPPO ANALITICO Sodio Na 3 citrato 2H 2 O. Alcalinizzante e solubilizzante di calcoli a base di calcio. NaCH 3 COO, acetato di sodio. Componente elettrolitico per dialisi, antiacido nelle acidosi metaboliche del sangue. Molti sali inorganici hanno notevole interesse farmaceutico ma la loro bioattività è legata alla specie anionica.

49 VI GRUPPO ANALITICO Sodio l sodio è un elemento essenziale per l organismo umano, come per tutti gli organismi viventi, animali e vegetali. E l elemento predominante nei liquidi biologici extracellulari, come il siero sanguigno, il liquido cerebrospinale, ecc., così come è l elemento più abbondante delle acque marine-oceaniche. Sebbene le membrane cellulari siano permeabili sia allo ione Na+ che allo ione K+, la loro differente distribuzione ai due lati della membrana è mantenuta dalla ATPasi Na-K-dipendente.

50 VI GRUPPO ANALITICO Sodio Il gradiente di concentrazione che si viene così a creare ai 2 lati della membrana cellulare viene sfruttato dall organismo umano per numerosi scopi, quali il controllo della pressione osmotica, la trasmissione dell impulso nervoso, ecc. Una diminuzione (iponatremia) o un aumento (ipernatremia) della concentrazione ematica dello ione Na+ sono caratterizzate da un alterazione della pressione sanguigna, della diuresi e della funzionalità dei tessuti eccitabili.

51 VI GRUPPO ANALITICO Sodio Un avvelenamento acuto da Na+, iniettato per via endovenosa, può produrre un arresto del cuore in sistole; nelle stesse condizioni lo ione K+ produce l arresto del cuore in diastole.

52 VI GRUPPO ANALITICO Potassio KCl, cloruro di potassio. Usato come reintegratore potassico. K 3 -citrato. Alcalinizzante e solubilizzante di calcoli a base di calcio. KCH 3 COO. Reintegratore, anche in soluzioni per emodialisi. Analogamente al sodio, molti altri sali potassici hanno interesse farmaceutico grazie alla bioattività dell anione. Il potassio è un catione essenziale per gli organismi viventi con localizzazione endocellulare.

53 VI GRUPPO ANALITICO Potassio Quantità superiori al fabbisogno giornaliero per via orale non provocano sensibili danni perché non assorbite e rapidamente escrete. Al contrario, la somministrazione di ioni K+ per endovena può produrre seri effetti di tossicità acuta (iperkalemia) con aritmia e fibrillazione cardiaca, fino all arresto cardiaco in diastole. L antidoto all avvelenamento da K+ può essere costituito da sali sodici ed acqua, che ripristinano il rapporto fisiologico fra i 2 ioni, le cui bioattività sono strettamente correlate.

54 VI GRUPPO ANALITICO Potassio Essendo il potassio un elemento essenziale, una sua deficienza (ipokalemia) può portare a conseguenze patologiche che si manifestano con astenia, anoressia, paresi, fino all arresto cardiaco.