LE SOLUZIONI MACS. Cover Story LAB. Vicino al ricercatore dalla preparazione del campione all analisi cellulare. 22 maggio 2010 DEL LABORATORIO

Transcript

1 Cover Story LE SOLUZIONI MACS Vicino al ricercatore dalla preparazione del campione all analisi cellulare Dalla sua fondazione nel 1989, Miltenyi Biotec ha sviluppato prodotti innovativi e di alta qualità per la ricerca biomedica internazionale, rintracciabili in oltre pubblicazioni scientifiche. Negli ultimi anni Miltenyi Biotec ha aumentato significativamente la propria gamma di prodotti aggiungendo sistemi semplici ed affidabili per migliorare l isolamento di differenti sottopopolazioni di cellule sempre più specifiche, mantenendone intatta la vitalità e garantendo il consolidato standard di purezza. L introduzione delle MACSiBead permette di ottenere un efficiente attivazione ed espansione delle cellule T e delle cellule NK e sarà a breve commercializzato un nuovo kit per l espansione delle cellule Treg. Al fine di incrementare la standardizzazione delle colture cellulari e la loro differenziazione, Miltenyi Biotec ha lanciato una nuova linea di citochine e fattori di crescita disponibili come qualità Research Grade, Premium Grade (con attività biologica definita e disponibile per ogni singolo lotto) ed anche come GMP grade per supportare le ricerche traslazionali. Altri prodotti innovativi sono i PepTivator Peptide Pool che coprendo diversi antigeni provenienti da CMV, EBV e AdV, pongono le basi per incrementare la ricerca sulle cellule T antigene specifiche, trasferendole anche in Clinica grazie al rilascio dei primi peptide pools GMP grade, che permettono lo stimolo di cellule T antigene specifiche (ad esempio verso CMV o Adenovirus) da poter reinfondere nel paziente immunocompromesso in seguito a trapianto, in cui si siano verificate complicanze di tipo infettivo. La gamma di prodotti per l analisi cellulare, che comprende anticorpi unici come il CD133, il BDCA1-4 o il mouse- 22 maggio 2010

2 Head Quarter PDCA-1, è stata implementata con l introduzione di numerosi anticorpi coniugati al nuovo fluorocromo Vioblue. Questi anticorpi forniscono una soluzione ideale per un analisi citofluorimetrica multicolore tramite il MACSQuant Analyzer. Nel corso degli anni, grazie al costante lavoro dell R&D, reparto in cui lavora circa il 30% del personale Miltenyi, la tecnologia MACS è stata costantemente integrata da sistemi automatizzati che affiancano il ricercatore dalla preparazione ottimale del campione, alla separazione cellulare con auto- MACS Pro Separator fino all analisi cellulare con MACSQuant Analyzer. La qualità del prodotto cellulare generato con i sistemi MACS ha permesso la traslazione in ambito clinico del portfolio di reagenti e realizzazione del CliniMACS CELL SEPARATION SYSTEM per applicazioni quali il trapianto di cellule emopoietiche in ambito onco-ematologico o la preparazione di cellule staminali adulte per la rigenerazione tissutale. Miltenyi Biotec in pillole: 1989 Nasce la MACS Technology 1993 Stem Cell Research: CD34 MicroBead Kit 1997 CE CliniMACS Cell Separation System CD133 MicroBead Kit 1999 automacs Separator 2000 primo prodotto di biologia molecolare: µmacs mrna isolation kit 2001 CE-marked CD 133 reagent 2003 Linea MACS Molecular: µmacs Protein Isolation Kits 2006 automacs Pro Separator a-hyb Hybridization Station Anti-Prominin-1 MicroBeads, La MACS Technology entra nelle neuroscienze 2007 PepTivator Peptide Pool 2008 MACSQuant Analyzer gentlemacs Dissociator MACS Cytokines and Growth factors 2009 IL-17 Secretion Assay Anticorpi coniugati a Vioblue CD133/2-PE, human, il primo anticorpo IVD (in vitro diagnostic) Mitochondria Isolation Kit, human 2010 Diamond CD34+Lin- Isolation Kit e Diamond CD133+Lin- Isolation Kit per la purificazione delle cellule staminali progenitrici Treg expansion kit maggio

3 Cover Story La preparazione del campione: chi ben comincia La qualità e riproducibilità di un esperimento dipende in larga misura dalla qualità del campione di partenza. La formazione di aggregati in una sospensione cellulare può condurre ad un arricchimento non specifico di cellule indesiderate oppure ad una insufficiente marcatura. Da qui la necessità riconosciuta di ottenere sospensioni di singole cellule da campioni di tessuto come fattore discriminante per la buona riuscita di tutte le analisi successive. Il gentlemacs Dis - so ciator con il suo unico sistema di gentlemacs Tube permette una preparazione ottimale dei campioni da sottoporre alle successive fasi sperimentali (separazione immunomagnetica, analisi, coltura, etc) in quanto la dissociazione dei tessuti avviene in pochi secondi e con programmi ottimizzati per le diverse applicazioni. La standardizzazione delle procedure di omogeneizzazione e dissociazione garantisce un elevato recupero di cellule vitali del campione di partenza e consente di ottenere risultati riproducibili operando in sterilità e sicurezza all interno di un sistema chiuso. Lo strumento è dotato di due differenti set di tubi: i gentlemacs C tube sono stati specificamente concepiti per ottenere una sospensione di singole cellule in modo delicato a partire da tessuti, mentre i gentlemacs M tube sono stati sviluppati per omogeneizzare in modo completo e veloce tessuti e cellule per analisi molecolari come l isolamento dell RNA totale, dell mrna o l estrazione di proteine. Lo strumento consente di processare un campione singolo o due campioni in parallelo. Il gentlemacs Dissociator dispone di programmi generici (definiti dalle lettere che vanno d A ad E) e di programmi e protocolli specifici per la dissociazione di tessuti murini, quali: milza con o senza Collagenasi D, polmone con Collagenasi D, fegato con Collagenasi IV, cuore, tumori impiantati, cervello in combinazione con MACS Neural Tissue Dissociation Kit. Sono stati validati protocolli anche per la dissociazione di tessuti provenienti da tumori umani. Quest ultimo protocollo permette di ottenere in meno di un ora, un elevato numero di cellule neuronali vitali, grazie a una delicata procedura di dissociazione enzimatica in due passaggi. La sospensione di singole cellule così ottenuta pùò essere direttamente sottoposta a separazione cellulare con la Tecnologia MACS oppure può venire utilizzata per altre applicazioni in vivo e in vitro. Ultimamente è stato validato il protocollo per l isolamento di linfociti infiltrati nel tessuto tumorale e di cellule tumorali provenienti da tessuto di melanoma primario o di metastasi. Questo protocollo è stato utilizzato con successo anche nella dissociazione di carcinoma mammario primario umano e di carcinoma ovarico. Miltenyi Biotec sta continuamente espandendo la propria gamma di possibili applicazioni, tutte le ultime novità possono essere consultate direttamente sul sito: Man mano che nuovi protocolli vengono standardizzati, lo strumento può venire aggiornato grazie all uso di schede contenti il software con i nuovi programmi. La memoria del gentlemacs Dissociator può contenere ben 99 programmi. gentlemacs Dissociator MACS TECHNOLOGY La MACS Technology consente virtualmente di separare, sia per applicazioni di ricerca sia in ambito clinico, ogni tipo o sottotipo di cellula di interesse, come le cellule T, le cellule Natural Killer, le dendritiche, i monociti e le cellule B, comprese quelle molto rare come le cellule staminali. Ad oggi sono disponibili più di 250 reagenti MACS per la separazione cellulare. Il principio: Marcatura magnetica Le cellule target sono marcate magneticamente con le MACS MicroBead (particelle superparamagnetiche coniugate con un anticorpo). In figura le cellule viola sono state marcate. Separazione magnetica In una selezione positiva le cellule target marcate con le MACS MicroBead sono trattenute sulle Colonne MACS grazie alla presenza di un forte campo magnetico, mentre le cellule non marcate eluiscono nella frazione di scarto. In una procedura di deplezione sono le cellule non marcate (arancioni, blu e verdi) che si trovano nel primo eluato a rappresentare la frazione di interesse. Eluizione della frazione con cellule marcate La colonna viene allontanata dal campo magnetico e le cellule trattenute sono eluite come frazione cellulare arricchita e positivamente selezionata. In una procedura di separazione positiva queste sono le cellule di interesse. Marcatura magnetica Le cellule di interesse sono marcate magneticamente con MACS MicroBead. Principi della MACS Technology Separazione magnetica Le cellule sono separate in una colonna MACS e inserite in un separatore MACS. L eluato può essere raccolto come frazione negativa priva di cellule marcate. Eluizione della frazione contenente le cellule marcate La colonna viene rimossa dal Separatore. Le cellule trattenute sono eluite come frazione arricchita mediante selezione positiva. 24 maggio 2010

4 Separazione cellulare automatica: versatile, semplice e flessibile automacs Pro Separator La Tecnologia MACS permette una separazione cellulare di alta qualità sia mediante sistemi manuali sia con apparecchiature automatizzate processando fino a 10 milioni di cellule per secondo, con una purezza spesso prossima al 100%. L automacs Pro Separator è il sistema automatizzato che è in grado di separare potenzialmente qualsiasi tipologia cellulare da qualunque specie. Questo strumento rappresenta l evoluzione della tecnologia auto- MACS introdotta nel 1999 in quanto consente di processare fino a 6 campioni in serie partendo dalla marcatura e arrivando alla separazione cellulare. Un computer integrato regola la fluidica nel sistema e permette di monitorare l andamento delle separazioni mediante un originale sistema di sensori, collegati a led luminosi. Lo strumento è in grado di eseguire automaticamente tutti i passaggi elencati: marcatura, con dizionamento delle colonne, caricamento del cam pione, eluizione della frazione positiva e negativa, lavaggio dello strumento, manutenzione giornaliera e periodica dello strumento. Le colonne all interno dello strumento sono riutilizzabili per un periodo di 2 settimane o per un massimo di 100 separazioni, grazie ad una serie di programmi di lavaggio da attuare prima di ogni nuova separazione ed al termine di ogni giornata lavorativa. Lo strumento è, inoltre, dotato di un campionatore, fornito di tre diversi portaprovette, che permette di processare fino a 6 campioni uno di seguito all altro. Il campionatore e i diversi tipi di portaprovette vengono riconosciuti automaticamente dallo strumento. Oltre alla convenienza in termini di riproducibilità e risparmio di tempo in caso di moli di lavoro cospicue, l automacspro Separator risulta particolarmente utile per ulteriori applicazioni come: -PRE-SORTING: l automacspro Separator è lo strumento ideale come pre-sorter. La possibilità di processare fino a 10 milioni di cellule al secondo consente di effettuare un primo arricchimento in modo da passare alla fase di sorting vera e propria velocizzando il processo e soprattutto salvaguardando la vitalità cellulare. -ANALISI DI CHIMERISMO: grazie all uso combinato dell automac- SPro Separator e delle Whole Blood Microbead (CD3, CD4, CD8, CD56, CD19, CD15, CD33, CD45) è possibile arricchire le principali sottopopolazioni cellulari a partire da sangue intero. Nel monitoraggio del chimerismo (quindi dell attecchimento delle cellule di un donatore in un paziente sottoposto a trapianto) può essere una metodica particolarmente utile in quanto, a partire da prelievi di pochi ml di sangue periferico, si riescono ad isolare le cellule di interesse su cui poter effettuare indagini molecolari in modo più sensibile ed accurato. -ANALISI CITOGENETICA: l uso del kit Whole Blood CD138 Microbeads in associazione all automacspro Separator permette di ottimizzare l arricchimento di plasmacellule, a partire da sangue intero o da midollo osseo. Ciò permette di migliorare i recuperi e, soprattutto, di effettuare una più accurata analisi citogenetica in caso di patologie a carico di plasmacellule CD138 positive, come ad esempio il Mieloma Multiplo. Le MACS Whole Blood MicroBead stanno riscontrando sempre più interesse, consentendo una separazione magnetica di specifiche popolazioni cellulari direttamente dal sangue intero o da midollo osseo. Il prearricchimento delle cellule del sangue della serie bianca che, solitamente, viene effettuato tramite centrifugazione con gradiente di densità non è più necessario. Le Whole Blood MicroBead vengono semplicemente aggiunte a campioni di sangue non coagulato e le sottopopolazioni leucocitarie possono venire successivamente purificate usando l auto- MACS Pro Separator. Le cellule così isolate sono immediatamente disponibili per successive analisi citofluorimetriche, studi di biologia molecolare o studi funzionali. Riassumendo,i benefici dell utilizzo dell automacs Pro Separator sono: - eliminazione della centrifugazione con gradiente di densità e della lisi dei globuli rossi - riduzione delle tempistiche - riduzione al minimo di perdite di cellule - elevata riproducibilità insieme ad un elevata purezza L automacspro Separator, permette inoltre una gestione semplice e sicura anche di campioni biologicamente pericolosi, poichè, grazie alle dimensioni compatte, può essere posizionato in una cappa a flusso laminare. L utilizzo di una specifica soluzione di lavaggio a base di detergenti (automacspro Washing Solution) previene inoltre rischi di cross-contaminazione. TERRENI E CITOCHINE Miltenyi Biotec offre sia terreni per colture cellulari standard sia prodotti e protocolli specifici per colture di cellule staminali. In particolare gli HSC-CFU media sono ottimizzati per favorire la crescita delle colonie delle cellule staminali ematopoietiche, mentre gli NH Expansion e gli NH Differentiation media sono stati ideati per promuovere l espansione e la differenziazione di cellule staminali non ematopoietiche in adipociti, condrociti e osteoblasti. Sono inoltre disponibili terreni base ottimizzati per la crescita in vitro delle cellule eucariotiche come il DMEM o l RPMI 1640 (con o senza glutamina),a cui aggiungere citochine o fattori di crescita. A questo scopo, Miltenyi Biotec ha recentemente introdotto la nuova linea MACS Cytokines da utilizzare in colture cellulari, in studi di differenziazione e in saggi biologici. Le citochine sono disponibili in diversi gradi di qualità, a seconda della stringenza dei controlli effettuati - Research Grade : livelli di endotossine inferiori a 0.1 ng/µg(< 1EU/µg) e purezza superiore al 95%. - Premium Grade :attività biologica particolarmente elevata e definita per ogni singolo lotto. La purezza è superiore al 97%. - GMP Grade : per applicazioni cliniche, nell ambito della terapia cellulare. Di recente è stato immesso in commercio il MACS Neuro Medium studiato appositamente per le colture di cellule neurali ottenute in seguito a isolamento magnetico. MACS Media MACS Cytokines maggio

5 Cover Story MACSQuant Analyzer La nuova pietra miliare dell analisi cellulare Il MACSQuant Analyzer è un citofluorimetro da banco ideato da Miltenyi Biotec per l analisi rapida, semplice e automatizzata di cellule di qualunque specie. Lo strumento è stato concepito per soddisfare le esigenze di tutte le tipologie di utilizzatori, dai più esperti a quelli che hanno una minore familiarità con l analisi citofluorimetrica. L analizzatore opera grazie ad un software di nuova concezione che unisce un interfaccia intuitivo alla potenza necessaria per utilizzare efficientemente le numerose funzioni dello strumento. Le principali caratteristiche del MAC- SQuant Analyzer sono: - 3 LASER, 7 canali di fluorescenza: il MACSQuant Analyzer è dotato di 3 laser (blu, rosso e violetto) raffreddati ad aria e di 9 fotomoltiplicatori, 2 per il rilevamento dei parametri fisici (FSC e SSC) e 7 per il rilevamento delle fluorescenze. - Dimensioni ridotte: il MACSQuant Analyzer è il citofluorimetro più compatto nella sua categoria. Il suo design ( cm) lo rende perfetto per effettuare analisi multiparametriche sul bancone da laboratorio. Il computer e le bottiglie dei buffer sono integrate nel sistema, quindi lo strumento non necessita di alcun componente accessorio. - Conta cellulare assoluta: il MACSQuant Analyzer sfrutta un sistema non pressurizzato di prelevamento del campione che consente, attraverso l aspirazione tramite una pompa a siringa, di calcolare esattamente il volume del campione analizzato. Al termine di ogni acquisizione, si ottiene la conta assoluta (volumetrica) delle cellule contenute nel campione di partenza senza la necessità di utilizzare biglie per la conta. - Calibrazione automatica: è il processo che consente di verificare e, qualora necessario, modificare i parametri di voltaggio dei fotomoltiplicatori in modo da ottenere sempre la massima sensibilità dello strumento; nel MACSQuant Analyzer viene effettuata mediante l utilizzo di biglie fluorescenti ed è basata su un processo totalmente automatizzato. - Compensazione automatica: si basa su una matrice 7 7, e può essere effettuata con un processo automatizzato utilizzando sia cellule marcate con i singoli fluorocromi che biglie. La compensazione può essere effettuata anche dopo l acquisizione. - Acquisizione programmabile di più campioni in serie: il supporto robotizzato MACS MiniSampler permette di alloggiare diverse tipologie di provette e piastre da 96 pozzetti. Il software del MACSQuant è in grado di controllare la marcatura, il prelevamento e il processamento dei diversi campioni in modo totalmente automatizzato. I singoli campioni possono comunque essere programmati individualmente variando qualunque parametro di acquisizione. - MACS Cell Enrichment Unit: consente di arricchire le cellule marcate magneticamente prima dell analisi citofluorimetrica. L unità di pre-arricchimento è utile principalmente per l analisi di popolazioni rare, ad esempio sottopopolazioni di cellule staminali o cellule tumorali circolanti. Cytokine Secretion Assay: metodi per l analisi e l isolamento di cellule secernenti I comuni metodi per l analisi di cellule secernenti citochine non consentono di isolare cellule vitali per successive analisi funzionali o per studi in vitro o in vivo. Miltenyi Biotec ha ideato un sistema di analisi ed arricchimento cellulare proprio per ovviare a questo limite: il Cytokine Secretion Assay. Questo tipo di saggio consente non solo un approfondita analisi fenotipica, ma anche l isolamento di cellule vitali, sulla base delle citochine da esse secrete. Il principio del Cytokine Secretion Assay è illustrato schematicamente in figura: le cellule in seguito a ristimolazione (con antigeni proteici o peptidici, che inducono una risposta monoclonale oppure con reagenti stimolatori generici quali CytoStim o SEB) iniziano a secernere. La citochina di interesse viene catturata sulla superficie dei leucociti da cui è stata rilasciata mediante il Cytokine Catch Reagent e successivamente riconosciuta da un anticorpo coniugato a PE che consente l analisi citofluorimetrica. Per l isolamento delle cellule secernenti, qualora necessario, è sufficiente utilizzare microbiglie dirette contro il fluorocromo e procedere con una classica separazione immunomagnetica tramite la Tecnologia MACS. Le cellule così isolate sono utilizzabili per esperimenti in vitro o in vivo, data la biocompatibilità e biodegradabilità delle microbiglie MACS. Il saggio è compatibile non solo con l analisi immunofenotipica multiparametrica ma anche con la marcatura simultanea di cellule T antigene specifiche mediante complessi tetramerici. Il Cytokine Secretion Assay rende possibile l analisi citofluorimetrica di cellule molto rare, aumentando la MACS Cytokine Secretion Assay sensibilità del saggio mediante l arricchimento immunomagnetico; Attualmente sono disponibili kit per l analisi e l arricchimento di diverse citochine umane e murine, tra cui: IFN-γ, IL-2, IL- 4,IL-5, IL-10 IL-12, IL-17, TNF-α. 26 maggio 2010

6 Innovazione nella ricerca molecolare La tecnologia MACS si presta ad esigenze d isolamento di molecole e strutture cellulari di vario significato funzionale. Nel caso dell RNA, la tecnologia MACS consente di purificare con ottima resa e purezza RNA messaggero totalmente integro. MACS mrna Isolation Kit è un prodotto che basa il suo innovativo principio sulle microbead coniugate a sequenze oligo(dt) da utilizzare manualmente su µcolumn e separatore ThermoMACS o in modalità automatizzata grazie al MultiMACS M96 thermo Separator. L intero procedimento si completa in meno di quindici minuti partendo direttamente da cellule, tessuti o sangue intero. MicroRNA, RNA ribosomale ed RNA di trasporto, possono comunque essere opportunamente recuperati dall eluato che fluisce dalla µcolumn ed essere a loro volta purificati. Con pochi e semplici passaggi quindi è possibile ottenere cdna purissimo, utilizzando un massimo di 10 milioni di cellule. MACS One-step cdna Synthesis Kit contiene una mix di reagenti per la sintesi di cdna da poter effettuaredirettamente sulla µcolumn. µmacs Factor Finder Kit permette di isolare qualsiasi fattore di trascrizione o molecola in grado di identificare specifiche sequenze di DNA genomico. MACSelect è il kit ideale per il rapido isolamento di cellule transfettate senza bisogno di utilizzare antibiotici. MACSelect è compatibile con tutti i sistemi di transfezione. La possibilità di esprimere sulla superficie cellulare uno specifico marcatore da utilizzare per la separazione magnetica oltre alla proteina desiderata si pone come una soluzione elegante e rapida. Miltenyi Biotec offre inoltre diversi dispositivi per l automazione dei propri sistemi di separazione: il già citato Multi- MACS M96 thermo Separator è un dispositivo magnetico da banco che offre la possibilità di rendere automatiche le applicazioni descritte precedentemente, anche su 96 posizioni contemporaneamente e consentendo di realizzare reazioni enzimatiche in colonna per applicazioni di IP, CoIP e ChIP. Mitochondria Isolation Kit, human è il prodotto che sfrutta la tecnologia MACS per l isolamento di mitocondri umani intatti e vitali da cellule o tessuti in meno di due ore. A seguito di una lisi cellulare con opportuni buffer, la traslocasi TOM 22 presente sulla superficie della membrana esterna del mitocondrio viene utilizzata per il legame con specifiche microbeads che consentono la separazione magnetica dell intera unità mitocondriale. Miltenyi Biotec produce e commercializza anche ahyb Hybridization Station, un dispositivo di ibridazione di acidi nucleici per applicazioni in analisi di microarray, ibridazione in situ e CGH. E inoltre possibile utilizzare anticorpi o proteine per test di marcatura su tissue macroarray. Sono disponibili diversi servizi e prodotti per l'analisi di espressione genica come l innovativo SuperAmp Kit per un amplificazione a partire da singola cellula e compatibile con piattaforme AFFIMETRIX, AGILENT o ILLUMINA. PIQOR Microarrays rappresentano dei supporti topic defined contenenti una serie limitata e definita di sequenze per analisi di espressione genica disponibili per oncologia, tossicologia, dermatologia normale e patologica, immunologia, cellule staminali, morte cellulare e pathway dell ubiquitina. mirxplore TM, è una piattaforma per l'analisi di micro RNA. Si tratta di un supporto sul quale sono disposte sonde corrispondenti a sequenze di microrna maturi per consentire la co-ibridazione di microrna di campioni biologici con sonde sintetiche a titolo noto: Universal Refrence. Quest ultimo prodotto rappresenta uno standard quantitativo assoluto contro il quale misurare le intensità di segnale prodotte dal campione biologico. I service di bioinformatica, disponibili per singoli moduli, consentono di effettuare analisi per geni discriminatori, clustering, raggruppamento funzionale o l individuazione di specifiche pathway, integrando gli studi di analisi di espressione genica. Purificazione di Proteine La tecnologia MACS è in grado di fornire uno strumento pratico ed efficace per la separazione di proteine con un altissimo grado di purezza. La proteina target contenuta nel lisato cellulare, legata ad uno specifico anticorpo primario, viene a formare un immunocomplesso magnetizzabile con le microbiglie coniugate alle proteine A e G. Le microbiglie coniugate alle proteine A e G o ad anticorpi primari specifici possiedono dimensioni di 50 nm di diametro, permettono delle veloci cinetiche di reazione e consentono efficaci step di lavaggio per minimizzare le contaminazioni. Dopo una breve incubazione l immunocomplesso viene fatto passare in una colonna collocata in un separatore MACS e ciò consente di evitare l utilizzo di una centrifuga. La proteina viene così trattenuta dal campo magnetico sulla matrice della colonna mentre i detriti cellulari, con la restante frazione proteica, vengono eluiti ed allontanati. La proteina target, così purificata, può essere eluita per analisi su SDS gel; nel caso sia invece necessario effettuare reazioni enzimatiche, queste possono essere allestite direttamente in colonna. Il GentleMACS Dissociator garantisce un idonea preparazione del campione per applicazioni molecolari: recentemente, a questo scopo, è stato sviluppato uno specifico programma da eseguire per l estrazione di proteine. Una ampia gamma di tessuti murini sono stati testati con la finalità di ottenere proteine citoplasmatiche da un massimo di 4g fino ad un minimo di 20 mg di tessuto. maggio