Biofilm microbici e Igiene degli alimenti

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1 Biofilm microbici e Igiene degli alimenti Un tempo gli alimenti erano molto più freschi e poco manipolati Valerio Giaccone Dipartimento di Sanità pubblica, Patologia comparata e Igiene veterinaria, Università Padova Oggi i prodotti alimentari sono quasi sempre molto manipolati La qualità igienico-sanitaria dei moderni prodotti alimentari L inquinamento che proviene dalle superfici di lavoro può essere costituito da è legata in larga misura all igiene delle superfici a contatto con gli alimenti flore microbiche saprofite (batteri Gram positivi, lieviti e muffe) L inquinamento che proviene dalle superfici di lavoro può essere costituito da Visto al contrario, nell igiene degli alimenti hanno importanza determinante agenti patogeni di malattia alimentare (Listeria, Staphylococcus, Bacillus, Clostridium) le procedure di detersione e disinfezione delle superfici di lavoro 1

2 Moderna preferenza per materiali quali acciaio inossidabile e materie plastiche Invece, qualunque materiale può essere interessato dalla formazione perché si crede che non offrano adesione ai microrganismi dei biofilm microbici Che cosa sono i biofilm microbici? In natura i batteri possono essere presenti in due differenti stati planctonico (cellule singole e indipendenti che si muovono libere in un substrato acquoso) In natura i batteri possono essere presenti in due differenti stati Nel biofilm gli aggregati di batteri sono immersi e circondati da una matrice amorfa biofilm (aggregati di batteri adesi a una superficie) formata da mucopolisaccaridi che loro stessi sintetizzano 2

3 Questa sostanza amorfa è formata da polimeri extracellulari All interno di questi biofilm i batteri letteralmente cambiano abitudini di vita ed è chiamata EPS (Extracellular Polymeric Substances) entrano in fase di crescita stazionaria (VBNC) diventando più resistenti a stress chimici e fisici All interno di questi biofilm i batteri letteralmente cambiano abitudini di vita All interno di questi biofilm i batteri letteralmente cambiano abitudini di vita variazioni di trascrizione dei geni rispetto alla fase planctonica (aumento o calo di virulenza) aumenta la sintesi di esopolisaccaridi All interno di questi biofilm i batteri letteralmente cambiano abitudini di vita Le cellule batteriche in biofilm sintetizzano oltre 90 proteine in più aumenta la resistenza ai trattamenti detergenti e disinfettanti rispetto alle consimili in stato planctonico 3

4 Molte di queste proteine sono specificamente coinvolte nei meccanismi Molte di queste proteine sono specificamente coinvolte nei meccanismi di resistenza agli stress chimico-fisici esterni che governano la sintesi di proteine protettrici Proteine protettrici Proteine protettrici sono le Acid Shock Protein (ASP) che riparano i danni cellulari degli stress acidi sono le Heat Shock Protein (HSP) che riparano i danni cellulari degli stress termici Le conoscenze sui biofilm sono in fase di attiva acquisizione Definizione di biofilm Ci sono controversie tra i ricercatori su molti concetti, a partire dalla definizione di biofilm 4

5 Prima corrente di pensiero : un biofilm è Seconda corrente di pensiero : un biofilm è un aggregato di batteri sempre immersi in uno strato di EPS un aggregato di batteri adesi a una superficie anche senza la matrice amorfa di EPS Altro punto di contrasto e discussione è costituito dalla architettura dei biofilm Al microscopio ottico un biofilm microbico può apparire come e su come vari fattori agiscono nel definire su questa architettura un insieme di tanti nuclei di aggregazione microbica sparsi irregolarmente sulla superficie Al microscopio ottico un biofilm microbico può apparire come Al microscopio ottico un biofilm microbico può apparire come grandi colonie microbiche a fungo separate fra loro da grandi spazi vuoti un insieme continuo e uniforme ( a tappeto ) di matrice amorfa con colonie interne 5

6 La prima forma è quella tipica delle superfici sottoposte a regolare detersione Un biofilm si forma fisiologicamente, quando sono presenti una superficie e dei batteri Le altre due sono rare e compaiono solo sulle superfici più luride La presenza di nutrienti li favorisce, ma non è determinante per la formazione L importante è che la superficie sia almeno lievemente umida I biofilm si possono anche creare artificialmente in laboratorio, ma Si formano biofilm anche in tubazioni in cui scorre solo acqua pura i risultati che si ottengono non sono del tutto trasferibili alla realtà I biofilm si possono formare praticamente Sono più predisposti a formare biofilm su qualunque tipo di superficie presente in un industria alimentare pavimenti, chiusini di scolo e nastri trasportatori 6

7 Sono lievemente meno predisposti a formare biofilm Più una superficie è scabra e/o irregolare con infossamenti le pareti dei locali e le superfici interne ed esterne degli apparecchi di lavoro maggiore è il rischio che si formino biofilm difficilmente aggredibili Su superfici regolarmente deterse e sanificate la densità microbica di un biofilm Su superfici non regolarmente deterse e sanificate la densità microbica di un biofilm può raggiungere le 10 7 ufc/cm 2 può raggiungere le 10 9 ufc/cm 2 Come si forma un biofilm Tre fasi che si succedono ciclicamente fino a quando non interviene qualcosa che elimina del tutto il biofilm 7

8 Adesione dei batteri alla superficie È necessario uno strato collante inerte per favorire l adesione Fenomeno fisico di interazione di molecole tra le superfici del materiale e del batterio Questo primo strato è costituito da residui di sostanza organica alimentare Dimostrate evidenti correlazioni tra tipo di materiale usato per le superfici di lavoro Materiali idrofobici : respingono tutto ciò che contiene acqua e tipo di alimenti che si lavorano in azienda e attirano con alta affinità tutti i grassi Materiali idrofilici : respingono tutto ciò che contiene grassi In un azienda dove ci sono molti grassi è meglio avere superfici e attirano tutto ciò che si scioglie in acqua (proteine e carboidrati) molto idrofiliche perché almeno non attirano i grassi 8

9 In un azienda dove ci sono solo alimenti poveri di grassi è meglio avere superfici Nella costruzione delle industrie alimentari è consigliabile considerare anche molto idrofobiche perché attirano poco le proteine e gli zuccheri il tipo di alimenti che vi si dovranno produrre I batteri in fase di digiuno o di crescita stazionaria aderiscono alle superfici I batteri che aderiscono alle superfici nei biofilm sono fenotipicamente molto diversi molto più facilmente di quanto facciano le cellule in fase di crescita esponenziale dai loro consimili liberi nel substrato L adesione alle superfici di lavoro stimola l espressione del fattore sigma Risultati possibili : i batteri possono diventare più mobili, Il fattore sigma, a sua volta, attiva la trascrizione di un ampia gamma di geni più resistenti agli stress avversi e/o più virulenti e infettanti 9

10 Colonizzazione della superficie Per raggiungere le massime densità possibili in un biofilm ci possono volere In batteri ormai adesi cominciano a moltiplicare, al riparo del biofilm forse intere settimane, ma comunque alcuni giorni sicuramente Altra ricaduta pratica da considerare : E meno male che all interno di un biofilm si stima che intervenire con la detersione delle superfici ogni 1 2 giorni, regolarmente solo il 10% della popolazione sia, a turno, in fase di moltiplicazione! La popolazione microbica di un biofilm può variare consistentemente Nelle aziende che lavorano carni e latte predominano Pseudomonas e Staphylococcus secondo il tipo di stabilimento alimentare considerato Nelle industrie di prodotti da forno predominano lieviti e batteri coryneformi 10

11 È dimostrato che i biofilm in cui sono presenti le pseudomonadacee Proprietà correlate alla matrice organica (EPS) favoriscono l adesione di L. monocytogenes che da sola non ce la fa a formare biofilm L EPS è formata da acqua, polimeri extracellulari, acidi nucleici Non si conosce ancora con precisione la sua composizione chimica, e una serie di altri composti organici intrappolati nella matrice stessa ma predominano carboidrati e proteine Non è certo che l EPS sia indispensabile per formare un biofilm La EPS però non va confusa con lo strato mucoso della capsula batterica Cloni batterici che non producono EPS sono comunque in grado di formare biofilm L EPS è una struttura ben più spessa e meglio strutturata 11

12 EPS ingloba e trattiene molti nutrienti presenti negli alimenti Alcuni esopolisaccaridi possono adsorbire e legare ioni positivi, ioni di metalli tossici o prodotti dai microrganismi stessi e altre sostanze che entrano in contatto con il biofilm Risultato: le molecole assorbite dal biofilm sono metabolizzate più rapidamente dai batteri L EPS preserva i batteri dall essiccamento perché i polisaccaridi e ciò accelera la purificazione delle acque tendono a formare dei gel con l acqua Se l acqua libera nell ambiente cala, aumenta la sintesi di EPS e questo Se non si riesce a eliminare del tutto l EPS dalla superficie favorisce la sopravvivenza dei batteri Gram negativi, sensibili all essiccazione non si riuscirà mai a staccare del tutto i batteri adesi alla superficie stessa 12

13 Immersi in un biofilm i batteri possono resistere per giorni e anche settimane Una volta «L aumento di resistenza dei batteri anche con regolari operazioni di sanificazione è dovuto all effetto barriera della EPS» FALSO VERO I polisaccaridi e le proteine dell EPS In particolare questo avviene con i composti del cloro e ciò spiega reagiscono con il disinfettante, inattivandolo in misura più o meno consistente la persistenza di batteri su superfici che pure sono regolarmente sanificate Negli strati più profondi del biofilm arrivano meno ossigeno e meno nutrienti Batteri nati da cellule in fase di carenza nutritiva e stressate i batteri passano alla fase di crescita stazionaria, diventando più resistenti sono più resistenti delle altre ai fattori avversi stressanti 13

14 Risultato : negli strati profondi del biofilm È un aumento di resistenza temporaneo che non dà modificazioni genomiche permanenti si seleziona una flora microbica particolarmente resistente ai disinfettanti Tornando liberi nel mezzo gli stessi batteri perdono la loro resistenza Come ridurre la formazione di biofilm Mantenere il più possibile asciutte tutte le superfici di lavoro Preferire per la costruzione materiali non porosi Il legno è poroso, ma ha dei vantaggi Il legno è poroso, ma ha dei vantaggi un effetto frenante sulle lame dei coltelli la capacità di adsorbire batteri lattici che favoriscono la maturazione dei prodotti 14

15 Il legno è poroso, ma ha dei vantaggi I materiali ideali sono lisci, non scabri e senza fessure né pori (anche microscopici) contiene composti naturali bioattivi con effetto batteriostatico e battericida No alle vernici smaltate per i pavimenti (rivelano porosità alla lente di ingrandimento) Effettuare regolarmente detersione e disinfezione dando maggior rilievo alla prima La frequente detersione impedisce ai batteri adesi di consolidare il loro attacco NO alla sola detersione non seguita da disinfezione e di sviluppare una forte resistenza ai disinfettanti Listeria monocytogenes e biofilm È forse il patogeno alimentare più resistente negli ambienti confinati I biofilm spiegano la sua estrema e subdola persistenza nelle industrie alimentari 15

16 È rarissimo che L. monocytogenes formi biofilm in purezza Sovente si associa a Gram negativi quali Pseudomonas e/o Flavobacterium Quasi sempre forma biofilm in coabitazione con batteri saprofiti, che la favoriscono Non è casuale: i saprofiti stimolano l adesività di L. monocytogenes all acciaio Carpentier e Chassaing (2004) isolano e identificano 29 differenti ceppi batterici Creano dei biofilm artificiali e associano al loro interno L. monocytogenes da biofilm presenti su varie superfici di lavoro all interno di industrie alimentari e, a turno, uno dei 29 ceppi di batteri saprofiti isolati in precedenza Risultato: 16 dei 29 ceppi causano un calo della carica microbica complessiva nel biofilm I ceppi di Listeria monocytogenes non sono tutti ugualmente abili 4 ceppi inducono un aumento di adesività di L. monocytogenes alle superfici in acciaio nel formare biofilm e aderire alle superfici di lavoro 16

17 Secondo alcuni Autori queste differenze sono condizionate dal sierotipo del batterio In conclusione, i biofilm secondo altri riguardano i cloni indipendentemente dal sierotipo sono una condizione fisiologica dei batteri (si formano anche su pietre o ghiaccio) In conclusione, i biofilm Formazione di biofilm su roccia e ghiaccio sono una condizione temporanea nella vita dei batteri In conclusione, i biofilm In conclusione, i biofilm consentono ai batteri di acquisire speciali caratteri di resistenza, temporanei costituiscono una comunità microbica organizzata e coordinata 17

18 Per avere una comunità organizzata e coordinata, però, Ci vogliono dei sistemi di comunicazione all interno della comunità bisogna che i singoli individui siano coordinati fra loro e questo sistema c è: è il Quorum Sensing 18