Mantova, 26 novembre 2016 Dr.Raffaele Dall Olio

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1 Mantova, 26 novembre 2016 Dr.Raffaele Dall Olio

2 Evans, 2011 Chauzat, 2011

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4 Almeno 21 di tipi virali identificati dal 1963 Quasi esclusivamente virus RNA+ Molto comuni le infezioni multiple e inapparenti Colpiscono tutti gli stadi di sviluppo dell ape Effetti diversi per tipo e intensità con scarsi indicatori sintomatologici Evoluzione dipendente dal contesto (altre patologie, fattori ambientali )

5 Primo virus (CPV) La maggior parte sono particelle icosaedriche di 30 nm (virus piccoli e nudi a RNA a singolo filamento, polarità positiva) indistinguibili al ME per morfologia Elevata resistenza ambientale ed elevata variabilità

6 Orizzontale Tramite insetti (vector-borne) Per via alimentare (food-borne) - virus in polline, miele, papa reale - alte [ ] virali nell intestino e feci Per via venerea - virus in fuchi, seme, spermateca Verticale Trasmissione transovarica - Regine positive per più virus, presenza di virus in ovari - Virus (es. DWV) in uova, anche con superficie sterilizzata - Virus in ogni stadio di sviluppo, anche in assenza di varroae di virus in pappa reale

7 coxshoney.com

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9 Nelle colonie in salute e vitali,ivirus si mantengono con trasmissione per via verticale rimangono allo stato di latenza/persistenza non causano episodi clinici evidenti Nelle colonie stressate e poco vitali (per carenze alimentari, varroasi, altre patologie ), i virus abbandonano lo stato di latenza si riproducono in modo massivo si trasmettono per via orizzontale causano morte degli individui e spopolamento della famiglia

10 ssrna caratterizzato sierotipo Europeo diagnosi sintomatologica attendibile provoca mortalità della covata infezione asintomatica delle api adulte trasmissione per via alimentare (diretta o mediata dal polline)

11 Malattia della covata (covata irregolare, larve non pupano, celle disopercolate o parzialmente opercolate) Diffusione limitata in apiario Persistente negli anni Incidenza stagionale (inizio estate) Autolimitante per intervento api adulte (rimozione larve infette) Replica anche in soggetti adulti, può dare latenza Virus trasmesso dalla varroa, ma anche dalla nutrici (secrezione delle ghiandole ipofaringee)

12 Mortalità delle pro-pupae con formazione del sacchetto e scaglie Sx) Larve infette (liquido) Dx) Larve sane

13 Spiccato tropismo per il tessuto nervoso (cervello, gangli ipofaringei, mandibolari, addominali e toracici) Infetta tutti gli stadi larvali Normalmente infezione allo stato latente: replicazione lenta, l ape compie il suo ciclo vitale Virulenza di CBPV: potenziata in presenza di Varroadestructor(abbassamento delle difese immunitarie nell ape replicazione virale) Insieme ad ABPV, determina la mortalità invernale delle famiglie

14 Unica virosi che colpisce le api adulte con 2 differenti sintomatologie (sierologicamente indistinguibili.. 2 agente???) Effetti sulle colonie Indebolimento Collasso Perdite invernali

15 Paralisi ( mal della foresta ) Api tremanti, incapaci di volare, cluster di api. Addome rigonfio. Ali divaricate COLLASSO

16 Mal nero Api piccole e glabre con l addome lucido e scuro, tremanti e, in fase tardiva, incapaci di volare

17 Incidenza del virus correlata ad alta densità di api: * cattive condizioni meteo (abrasioni) * troppe colonie rispetto alle risorse nettarifere Andamento stagionale: perdite severe nella stagione attiva (latente e asintomatico in autunno/inverno) Faucon & Ribeire, 2004

18 Chiara correlazione tra livelli di infezione e sintomatologia Due soglie diagnostiche: <10^8 copie virali/ ape infezione latente >10^10 copie virali/ ape infezione con sintomatologia clinica (5gg p.i.)

19 Per iniezione nell emolinfa (presente anche in larve e pupe) A.woodi L ape regina mostra stesso decorso di infezione Per contatto (cibo, feci) e per ingestione (trofallassireplicazione favorita)

20 Vi sono evidenze sperimentali che CBPV possa agire in sinergia con N.ceranae (ma studi in pieno campo ancora danno risultati ambigui)

21 Ubiquitario, molto diffuso in Europa e Sud America; forte andamento stagionale Sintomatologia di difficile diagnosi (simile CBPV): mortalità api e pupae, effetti subclinici comportamentali e longevità. la compresenza ABPV/Varroa guida la colonia al collasso (Kevan, 2006) associato a perdite invernali (Genersh, 2010; ZKBS, 2012) Pupae infette muoiono prima di emergere (Moore, 2015) Se veicolato per via orale 10^7 copie, tramite varroa 10^2 copie risultano letali (Genersh & Aubert, 2010) 100 nm

22 le femmine adulte di Varroa sono vettore (Wiegers, 1986) inoculo in emolinfa (5090% efficacia) mancano evidenze che il virus si replichi in Varroa Altre vie di trasmissione poco chiare: -alle larve giovani per via alimentare -se la regina è infetta non trasmette alle larve -alimentazione con polline infetto non genera infezione

23 Infezione diffusa a livello latente Bakonyi et al., 2002 Varroa destructor Infezione manifesta Collasso

24 Non c è attivazione di peptidi antimicrobici (hymaenoptaecyn, defensin, nor melanised nodules); ridotta attivazione in infezioni miste con E.coli.

25 Tra gli ultimi identificati, molto frequente, pressochè ubiquitario in Europa può causare infezioni latenti Ali deformi e ridotta dimensione delle api emergenti, dovuti al virus e non a Varroa (Allen & Ball, 1996; Genersh, 2006) strettamente associato a V.destructor (Ball 1989; Nordström 1999), principale vettore (Tentcheva 2004) evidenze di replicazione in Varroa

26 mortalità pupe api nascenti deformi (*) affetti subclinici sulle api adulte (longevità) (*) la deformità pare associata alla presenza del virus nel capo dell ape (Yue, 2005)

27 Infezione diffusa a livello latente Varroa destructor Infezione manifesta Impatto elevato sulle colonie!

28 Possibile spiegazione sul perché alcune colonie, sebbene infestate da Varroa e alti tassi di DWV, non collassano variante non letale (tipo-b), immunizza contro l infezione da variante letale (tipo-a)

29 L infestazione da varroa aumenta la recettività delle api verso patologie secondarie Esiste una correlazione diretta con la comparsa di virosi (ABPV, DWV,KBVeIAPV) Ruoloemodalitàditaleinterventononancoradeltuttochiari Ipotesi: - attivazione della moltiplicazione di virus presenti in forma latente a seguito di attività alimentare e successiva localizzazione in organi bersaglio (effetto traumatico-meccanico) - azione inibitoria per rilascio di enzimi digestivi, sui meccanismi di inibizione e difesa che normalmente limitano la replicazione virale (immunodepressione)

30 Lavarroaèveicolodiviruscon2modalità - attraverso l attività alimentare, causando una riattivazione di virus latenti, anche a seguito di soppressione dell immunità dell ape - come vettore passivo trasportando i virus con la saliva o contenuto intestinale La varroa può acquisire il virus da api infette, ma anche da altre varroe infette per via orizzontale Ci sonopiù probabilità che un ape nasca deformata omuoiase la varroa si è precedentemente alimentata su un ape deformata Alla diffusione della varroa in un area si associa spesso la comparsa più o meno immediata di patologie secondarie incluse le virosi

31 L esito dell infestazione dipende da numerosi fattori: Legati alla varroa il numero di varroe(infette) la prevalenza e titolo virale nella popolazione di varroe Legati al virus la presenza (quali virus) e il livello (quale titolo) di infezione virale la virulenza del ceppo virale Legati alle api la suscettibilità delle api(e forse della varroa) al virus la quantità di covata presente nella colonia

32 Qualsiasi saggio diagnostico idealmente deve essere: SENSIBILE per poter fare una diagnosi prima di vedere i sintomi! SPECIFICO evitare falsi positivi e falsi negativi RIPETIBILE anche con minime variazioni di ambiente/protocollo UNIVERSALE diagnosi possibile ad ogni stadio del ciclo vitale dell ospite SEMPLICE ridurre le variabili riduce la possibiltà di errore RAPIDO diagnosi in poco tempo per consentire intervento tempestivo ECONOMICO per giustificare costi/benefici e per praticarlo su larga scala

33 Spesso difficoltosa per mancanza di reagenti(antisieri) AGAR GEL IMMUNODIFFUSIONE: metodica rapida, poco costosa e specifica, anche se poco sensibile. E adeguata per svelare infezioni massive. MICROSCOPIA ELETTRONICA (ME/IEM): sensibilità variabile in rapporto al metodo usato (goccia, Airfuge). E costosa e dispendiosa in termini di tempo per indagini su larga scala. IMMUNOCROMATOGRAFIA: on side test WESTERN BLOT: identificazione proteica ELISA: molto sensibile, svela anche infezioni latenti PCR in tutte le sue varianti (multiplex - real time - immunocapture PCR) ha risolto di fatto il problema della diagnosi. Metodi molto sensibili: il risultato va interpretato!!

34 Scelta matrice: Api, Larve, miele, polline, cera, Api intere/teste (??) Prelievo campione: Mantenere lo status quo sino al processamento (api vive) Alternativamente, congelate vive e mantenute congelate Se non possibile conservare in soluzioni sature di Sali caotropici, onde prevenire degradazione acidi nucleici Processamento: Qualità ed integrità del RNA (DNA) di partenza

35 impossibile allevare colture pure di Virus; no linee cellulari di Apis per studi in vitro difficoltà ad ottenere standard quantitativi già in uso standard per DWV (IZS Prof. Lavazza) ambito Beenet sviluppati standard per altri virus ABPV e CBPV (IZS-PD Dr.ssa Granato)

36 Negativi C=0 Basso titolo C<10^3 Medio titolo 10^3<C<10^7 Sintomatiche C>10^7

37 Apicoltore deve: segnalare gli episodi all ASL con la massima tempestività * In Regione Lombardia ASL effettua: immediato sopralluogo presso l apiario interessato compilando il verbale / questionario eventuale campionamento di api, sia morte, che moribonde e possibilmente anche vive da inviare all IZS trasmissione in Regione di copia del verbale/questionario.

38 Tenere controllata l infestazione da Varroa Minimizzare scambi si favi Evitare postazioni ad elevata densità Adeguato ricambio dei favi Igienizzazione dei favi

39 Non esistono farmaci efficaci contro le virosi delle api: Distruzione delle famiglie colpite Distruzione dei favi; messa a sciame per diminuire la carica virale; sostituzione delle api regine Lavaggio e disinfezione delle arnie (soda caustica; sali quaternari di ammonio o ipoclorito di sodio + fiamma azzurra) Quarantena delle regine di nuova introduzione Allo studio l uso di probiotici

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42 Le manifestazioni cliniche in corso di patologie delle api solo raramente sono patognomoniche ovvero molti sintomi sono comuni a molte malattie Sono sempre necessarie analisi di laboratorio per individuare le cause eziologiche Alcune situazioni patologiche sono probabilmente la conseguenza di una compromissione generale della colonia, dovuta a disordini di varia natura (tossica, genetica, biochimica, metabolica etc), in associazione ad agenti infettivi, tra cui i virus, corresponsabili della rottura dell'equilibrio di forza delle famiglie (Sindrome da spopolamento?)

43 I virus sono agenti complicanti, che trovano in altri patogeni, e segnatamente nella varroa, il fattore scatenante il loro sviluppo, contribuendo a determinare il collasso e la morte della famiglia La prevenzione delle malattie virali dipende principalmente dal controllo della varroa con interventi appropriati e con programmi territoriali

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