Strumenti della Genetica Molecolare Umana (2) Capitoli 6-7-8

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1 Strumenti della Genetica Molecolare Umana (2) Capitoli 6-7-8

2 BAC, Bacterial Artificial Chromosome Caratteristiche: 1. Lungo 7-8kb 2. Resistenti al cloramfenicolo (marcatore di trasformazione) 3. puc-link rimosso durante il clonaggio e sostituito dal DNA esogeno 4. Sistema selezione SacBII (marcatore DNA ricombinante). Se si forma il gene integro nella cellula si sintetizza un composto tossico Vantaggi: 1. Possibilita di clonare frammenti molto grandi (fino a 200Kb) 2. Stabilita dei cloni. Gene parb e il basso numero di copie del vettore nella cellula limitano il verificarsi di riarrangiamenti inter ed intracromosomici e la formazione di cloni chimerici (tipico degli YAC) ESSENZIALI PER IL PROGETTO GENOMA UMANO

3 PAC, P1 Artificial Chromosome Caratteristiche: 1. Possono sopportare frammenti genomici piu piccoli (fino a Kb) 2. Resistenti alla kanamicina ESSENZIALI PER IL PROGETTO GENOMA UMANO

4 BANCHE DI DNA RICOMBINANTE Collezione di cloni contente almeno una copia di ogni sequenza di DNA del genoma che si vuole clonare. Si distinguono in relazione al materiale che si vuole clonare in: - genomiche se si utilizza il DNA genomico totale di un organismo (particolarmente utilizzate nel Progetto Genoma Umano) - cromosomiche si usa come DNA da clonare il DNA di un cromosoma e si ottiene una libreria cromosoma-specifica - cdna/geniche si utilizza come acido nucleico da clonare il DNA ricavato da una serie di molecole di mrna per trascrizione inversa

5 BANCHE DI DNA RICOMBINANTE Collezione di cloni contente almeno una copia di ogni sequenza di DNA del genoma che si vuole clonare. Si distinguono in relazione al materiale che si vuole clonare in: - genomiche se si utilizza il DNA genomico totale di un organismo (particolarmente utilizzate nel Progetto Genoma Umano) - cromosomiche si usa come DNA da clonare il DNA di un cromosoma e si ottiene una libreria cromosoma-specifica - cdna/geniche si utilizza come acido nucleico da clonare il DNA ricavato da una serie di molecole di mrna per trascrizione inversa

6 1. Il DNA viene digerito parzialmente con opportuni enzimi di restrizione (in relazione al motivo e al vettore di clonaggio) 2. La scelta del vettore e cruciale (dipende dalla grandezza dei frammenti che si vogliono ottenere) 3. E importante definire la ridondanza o complessita (definita in termini di Genomi Equivalenti, GE) di una libreria BANCHE GENOMICHE Per una libreria di genomico umano con inserti di dimensioni medie di 40kb: 1GE = 3000 Mb (DNA totale)/ 40 kb (grandezza inserto medio) = cloni Se dopo clonaggio otterro cloni la libreria sara ridondante 4 volte IMPORTANTE PER EVIDENZIARE LE DUPLICAZIONI GENOMICHE 4. Quelle piu recentemente costruite, utilizzano i BAC o PAC come vettori di clonaggio (per indicare un BAC si indica il nome della plate e le coordinate nella plate. Es. 143(plate)b2(coordinate))

7 Sistemi di clonaggio progettati per l espressione genica Finora metodi per lo studio del genoma dal punto di vista strutturale, ma come si fa per studiare l espressione di un gene? Sono utilizzati gli stessi sistemi? NO! E NECESSARIO OPERARE UN CLONAGGIO DI ESPRESSIONE Ma ATTENZIONE alle proteine eterologhe!!!!

8 COME SI TROVA IL CLONE CORRISPONDENTE AD UN GENE? Esistono diversi metodi per screenare la libreria di cdna, uno in particolare si adatta alla selezione di un clone di cdna che codifichi una particolare proteina. Si il cdna in un vettore di espressione in questo modo si induce l espressione del gene e se ne puo ricavare la proteina corrispondente. Promotore inducibile (in genere di origine batterica) Polylinker VETTORE Trascrizione Proteina estranea prodotta nella cellula batterica Promotore inducibile (in genere di origine batterica)

9 VETTORI DI ESPRESSIONE INDUCIBILE I plasmidi della serie pet-3 contengono il promotore del batteriofago T7. Sono utilizzati in ceppi di E. Coli geneticamente modificati che portano il gene per la rna polimerasi del fago t7, posto sotto controllo trascrizionale inducibile del promotore lac.

10 Uso delle proteine di fusione La serie di vettori pgex-4t ha un promotore tac (Ptac), un ibrido costituito da elementi del promotore trp e di lac. La sua espressione è normalmente repressa dalla proteina codificata da LacI, ma e indotta dall IPTG. Immediatamente a valle del promotore tac, è situato il gene per la glutatione S-transferasi (GST), seguito da un sito di clonaggio multiplo (MCS). L obiettivo è quello di produrre una proteina di fusione fra la GST e la sequenza codificante inserita nell MCS, che si troverà quindi ad avere al suo N-terminale la proteina GTS stessa. Sfruttando la sua capacita di legare il glutatione. La proteina di fusione può essere purificata facilmente facendo passare gli estratti proteici su colonnine con affinità per il glutatione. Nel sito MCS è anche inserita una piccola proteina (trombina) in modo tale che la proteina nella sua forma nativa può essere purificata dopo la rimozione del glutatione.

11 Banche di cdna Le molecole clonate, cdna, sono derivate da molecole di mrna (presenti in un dato momento in una popolazione di cellule) Le molecole di mrna estratte e purificate su colonna mediante catene oligo(dt) sono trattate con trascrittasi inversa per ottenere le sequenze di cdna mrna 5 Trascrittasi inversa + dntp AAAAA TTTTT 5 Appaiamento primer mrna cdna 5 AAAAA TTTTT 5 RNAsiH + DNApolI + DNA ligasi cdna 5 AAAAA TTTTT 5 I frammenti di RNA degradato sono i primer della nuova sintesi cdna cdna 5 AAAAA TTTTT 5 cdna a doppia elica

12 Ma le estremita sono inclonabili? E se nella molecola di cdna c e un sito di restrizione BamHI? Al posto del linker spesso si preferisce un adattatore di cui e nota la sequenza GATCCAGAC GTCTG ADATTATORE GTCTG CAGACCTAG ADATTATORE TRATTAMENTO CON LIGASI GATCCAGAC GTCTG GTCTG CAGACCTAG

13 Saggio di una banca di cdna di espressione La banca dati riflette l attivita genica di quel tipo cellulare al momento in cui sono stati isolati gli mrna (mrna maturi!) Si possono confrontare le attivita geniche in diversi tipi cellulari dello stesso organismo o dello stesso tipo cellulare in momenti diversi (durante lo sviluppo ed il differenziamento) Il clone di cdna puo essere utilizzato per screenare librerie genomiche per ottenere un clone genomico del gene (con gli introni e tutto cio che non e presente nell mrna) COME SI TROVA IL CLONE CORRISPONDENTE AD UN GENE?

14 COME SI TROVA IL CLONE CORRISPONDENTE AD UN GENE? Vettore di espressione cdna Trasformazione di E.coli con cloni di cdna in vettori di espressione Piastramento su terreno di crescita in cui il vettore e indotto ad aprimere la proteina Stampa su membrana Lavaggio dall eccesso di anticorpo Autoradiografia per evidenziare i cloni positivi Ibridazione con anticorpo marcato che interagisce solo con le proteine prodotte per cui c e una specifica interazione 1. Si deve possedere un anticorpo per la proteina 2. Marcare l anticorpo 3. Screenare la libreria di espressione con l anticorpo marcato

15 PCR schema denaturazione Primers antisenso senso annealing Sintesi del DNA fra i primers Denaturazione e annealing Sintesi del DNA fra i primers molecole dopo 2 cicli Dopo 30 cicli ci sono piu di 10 9 molecole della sequenza di interesse 15

16 Gel di agarosio post amplificazione Cosa stiamo vedendo??? A sequence-tagged site (or STS) is a short (200 to 500 base pair) DNA sequence that has a single occurrence in the genome and whose location and base sequence are known. STSs can be easily detected by the polymerase chain reaction (PCR) using specific primers.

17 La stringenza di una PCR Anche la PCR come le ibridazioni puo essere vincolata dalla stringenza che in questo caso e definita dalla capacita dei primer di legarsi al DNA target. In questo caso la temperatura e il principale fattore influenzante la stringenza e quindi specificita della reazione di PCR. Alte temperature implicano maggiore stringenza, basse temperature minore stringenza. A parita di temperatura e possibile avere piu bande... come mai? I primer possono legarsi oltre che al sito per i quali sono stati diseganti anche a minore efficienza in altri loci del genoma e cio comporta che la PCR abbia bande aggiuntive e non sia specifica.

18 PCR per la ricerca di delezioni (ΔF508) PCR di una regione di 100pb che comprende la sequenza deleta e corsa su gel di poliacrilammide controllo ++ ΔF508/+ ΔF508/ ΔF508 ΔF508 18

19 PCR nella tipizzazione dei polimorfismi dei siti di restrizione questo metodo identifica anche SNPs (single nucleotide polymorfisms)

20 SNPs La sostituzione di una base puo provocare la perdita o l insorgenza di un sito di restrizione, utilizzando PCR e digestione dell amplificato si puo rapidamente evidenziare l avvenuto cambiamento senza utilizzare il southern, il radioattivo etc bp 750bp 491bp L allele X T e X C sono distinguibili dopo digestione con TaqI. L amplificato e di 1241 bp dopo digestione se e presente la sostituzione si hanno 2 bande X C X C X C X T X C X C X C X C

21 Utilizzo degli SNPs SNPs nella regione codificante di un gene, alterando la struttura di una proteina, possono essere la causa di disordini monogenici ereditati in maniera dominante sono routinariamente usati a scopo diagnostico SNPs che alterano la struttura primaria di una proteina coinvolta nel metabolismo di un farmaco bersagli dell analisi farmacogenetica SNPs nelle regioni non-codificanti del genoma, quindi senza impatto sul fenotipo dell individuo markers usati in genetica di popolazione e negli studi di evoluzione

22 PCR allele specifica-arms (equivalente a ASO) Trova applicazione per individuare specifiche e NOTE mutazioni patogene in un sistema che nel complesso e detto ARMS, Amplification refractory mutation system) Il sitema differisce dagli ASO per la localizzazione del nucleotide rivelatore IMP. Il test ARMS puo essere inteso semplicemente come la possibilita di amplificare in modo specifico un allele, non necessariamente deve essere inteso come raffronto tra i due prodotti di PCR

23 Test per mutazioni note Ricerca di mutazioni puntiformi: ARMS (Amplification Refractory Mutation System): si eseguono 2 reazioni di PCR in parallelo IN 2 PROVETTE in una i primer sono entrambi per la sequenza normale, nell altra un primer e un ASO specifico per la mutazione. Si ha la banda di amplificazione solo se entrambi i primer si appaiano. Di solito il test e multiplex utilizzando primer che permettano di vedere piccole variazioni nella corsa elettroforetica.

24 PCR allele specifica-arms (equivalente a ASO) Mutazione NOTA (C T) in un gene voglio scoprire lo stato di eterozigosi o omozigosi dei miei samples. Costruisco tre primers: Primer forward G (finisce al 3 con una G); primer forward A (al 3 A) e un primer reverse CON (che si lega in una porzione non mutata del gene). Chiamo PCRG quella con la combinazione dei primer G-CON e PCRA quella con combinazione dei primer A-CON. Sample 1 Sample 2 Sample 3 PCRG PCRA SI SI NO NO SI SI Genotipo C/C C/T T/T IMP. Il test ARMS puo essere inteso semplicemente come la possibilita di amplificare in modo specifico un allele, non necessariamente deve essere inteso come raffronto tra i due prodotti di PCR.

25 Esempio di ARMS (multiplex) per la ricerca delle mutazioni in CF 3 pazienti (1,2,3) Primer normali APOB e OTC (controlli positivi) Primer ASO (11m.puntiformi,1ΔF508wt 1ΔF508m) In un sistema di PCR multiplex Per il paziente1: provetta A con APOB+OTC+DF508m+ 5 mutazioni m1, m2, m3, m4,m5 Per il paziente1: provetta B con APOB+OTC+DF508wt+ 6 missenso m6, m7, m8, m9, m10, m11 quali sono i primer specifici di DF508N e quali quelli di DF508M? 25

26 ARMS per la ricerca delle mutazioni in CF PCR con primer multipli in ogni provetta e controlli per geni non correllati a CF, l amplificato viene caricato su gel di agarosio il DNA proviene da affetti A: 5 alleli + ΔF508 Mutato +OTC +ApoB B: 6 alleli + ΔF508 Normale +OTC +ApoB ApoB Mutaz Mutaz ΔF508 OTC A B A B A B SANO 2 2 ALLELI CON MUTAZIONE PUNTIFORME 3 1 ALLELE DELETO E 1 CON MUTAZIONE PUNTIFORME