Diagnostica molecolare dei disordini genomici

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1 Diagnostica molecolare dei disordini genomici

2 MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) Riconoscimento di variazioni del numero di copie in più di 40 distinte sequenze genomiche mediante un unica reazione di PCR. Campi applicativi: Caratterizzazione di delezioni/duplicazioni o variazioni del numero di copie (aneuploidie) Determinare lo stato di metilazione di promotori o regioni imprinted Riconoscimento di specifiche mutazioni puntiformi o SNPs (single nucleotide polymorphism) Richiede minime quantità di DNA genomico (circa 20 ng).

3 Come funziona l MLPA

4 MLPA probes

5 Hybridization 1. The MLPA probemix is added to denatured genomic DNA 2. The two parts of each probe hybridize to adjacent target sequences

6 Ligation 3. Probes are ligated by a thermostable ligase

7 PCR amplification 4. A universal primer pair is used to amplify all ligated probes The PCR product of each probe has a unique length (range bp)

8 Separation and quantification by capillary electrophoresis Each peak is the amplification product of a specific probe. Samples are compared to a control sample. A difference in relative peak height or peak area indicates a copy number change of the probe target sequence

9 240

10 241

11 Methylation-specific MLPA (MS-MLPA)

12 Sindrome Prader-Willi Sindrome Angelman 243

13 Methylation-specific MLPA (MS-MLPA) Promoter region of SNRPN gene Undigested or Digested with HhaI (GCG C) AS PWS Normal

14 Eredità monogenica 245

15 Un disturbo monogenico è determinato da alleli mutanti in un solo locus/gene. Il genotipo di un individuo, per un determinato locus, corrisponde all assetto genetico di entrambi gli alleli per quel locus sui due cromosomi omologhi. Il fenotipo è l espressione del genotipo in termini di caratteristiche morfologiche, cliniche, biochimiche, cellulari Rispetto ai due alleli per uno stesso locus un individuo sarà: Omozigote se presenta una coppia di alleli identici Eterozigote se un solo allele è diverso e l altro è wild-type Eterozigote composto se presenta due diversi alleli mutanti del gene. Queste malattie seguono uno dei classici meccanismi dell eredità mendeliana. 246

16 Trasmissione mendeliana dei caratteri ereditari L assortimento indipendente degli omologhi e la ricombinazione sono i meccanismi biologici che spiegano, oggi, le osservazioni fatte da Gregor Mendel nel 1865, considerato tra i padri della genetica. Le leggi di Mendel regolano le modalità di trasmissione dei caratteri fenotipici dipendenti da un singolo locus (gene). Nell uomo si conoscono più di caratteri ereditabili mendeliani, raccolti in un database on-line (OMIM, Online Mendelian Inheritance in Man), da cui è possibile ottenere informazioni sui caratteri mendeliani umani, patologici e non patologici. 247

17 OMIM ( (*) before an entry number indicates a gene. (#) before an entry number indicates that it is a descriptive entry, usually of a phenotype, and does not represent a unique locus. (+) before an entry number indicates that the entry contains the description of a gene of known sequence and a phenotype. (%) before an entry number indicates that the entry describes a confirmed mendelian phenotype or phenotypic locus for which the underlying molecular basis is not known. 248

18 Trasmissione mendeliana dei caratteri ereditari Il gene è un unità definita ereditabile, responsabile di un determinato fenotipo o carattere. Gli alleli sono forme alternative di un gene. Il locus è una localizzazione cromosomica unica, che definisce la posizione di un singolo gene. Per ciascun locus autosomico, un individuo possiede due alleli di origine paterna e materna. Un carattere è dominante se esso si manifesta in eterozigosi. Alleli diversi per uno stesso locus sui due cromosomi omologhi. Un carattere è recessivo se si manifesta in omozigosi. Alleli uguali per uno stesso locus sui due cromosomi omologhi. I caratteri autosomici o legati all X possono essere dominanti o recessivi. Non esiste il problema della dominanza o recessività per i geni del cromosoma Y. I maschi sono emizigoti per i geni dei cromosomi X e Y (di cui hanno una sola copia). 249

19 Penetranza ed Espressività Per una condizione genetica il fenotipo può essere già completamente espresso alla nascita, ma è anche osservabile una variabilità clinica o dell età d insorgenza, talora anche tra consanguinei che presentano lo stesso genotipo. La penetranza indica la frequenza con cui un allele si manifesta fenotipicamente all'interno di una popolazione. Completa Incompleta L espressività è il grado di gravità con cui si esprime il fenotipo in individui portatori dello stesso genotipo. Variabile 250

20 251

21 Ectrodattilia (SPLIT-HAND/FOOT MALFORMATION 3; SHFM3) Duplicazione di geni contigui a 10q

22 Schemi di eredità mendeliana La simbologia utilizzata nel disegnare gli alberi genealogici, consente di definire i rapporti di parentela tra gli individui e le modalità di trasmissione di una malattia genetica nella famiglia. I caratteri mendeliani possono essere ereditati secondo cinque schemi principali che dipendono da: Localizzazione del locus genico implicato su autosomi o cromosomi sessuali Fenotipo dominante o recessivo 253

23 Eredità autosomica dominante Una persona affetta ha almeno un genitore affetto. Sono colpiti entrambi i sessi. E trasmessa ad entrambi i sessi. Il figlio dell unione tra un affetto e un non affetto ha il 50% di probabilità di essere affetto 254 (ciò presume che il genitore sia eterozigote).

24 Eredità autosomica dominante Dominanza completa o semplice - in una condizione autosomica dominante, gli individui omozigoti o eterozigoti composti per un allele mutante mostrano lo stesso fenotipo dell eterozigote. D d Dominanza incompleta o semidominanza - in una condizione autosomica dominante, gli individui omozigoti o eterozigoti composti per un allele mutante mostrano un fenotipo più severo rispetto all eterozigote. Codominanza un individuo eterozigote composto manifesta fenotipicamente entrambi gli alleli per quel locus (gruppi ABO) 255

25 Eredità autosomica recessiva Gli individui affetti sono di solito figli di individui non affetti. I genitori degli individui affetti sono di solito portatori asintomatici. C è una maggiore incidenza di consanguineità tra genitori. Sono colpiti entrambi i sessi. Dopo la nascita di un figlio affetto ciascun figlio successivo ha il 25% di probabilità di essere affetto. 256

26 Eredità autosomica recessiva Gli alleli mutanti responsabili di un fenotipo recessivo sono generalmente rari. La stima di alleli mutati nel nostro genoma è di ~ A causa della rarità degli alleli mutati, in una condizione autosomica recessiva gli individui affetti sono spesso eterozigoti composti. L omozigosi è spesso legata alla consanguineità o ad un effetto fondatore. Tra cugini primi il rischio di un figlio affetto di una qualsiasi condizione su base genetica è del 3-5%, circa il doppio di una qualsiasi coppia non correlata. 257