I GLUCIDI. Tecniche di Anatomia Patologica Dott. Giorgio Bettarelli

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1 I GLUCIDI Tra i costituenti organici fondamentali sono i più abbondanti Sono sostanze organiche di interesse biologico ampiamente diffusi nei tessuti animali con molteplici attività fisiologiche Chimicamente sono composti ternari formati da C, H, O.

2 I GLUCIDI Chimicamente sono composti ternari formati da C, H, O. Anche chiamati «idrati di carbonio» Svolgono principalmente funzioni energetiche e di risrva.

3 I GLUCIDI Monosaccaridi Disaccaridi Polisaccaridi Eteropolisaccaridi Mucine epiteliali neutre Mucine epiteliali acide Mucopolisaccaridi mesenchimali

4 GLUCIDI MONOSACCARIDI Glucidi più semplici, ternari, con molti gruppi alcolici e proprietà aldeidiche o chetoniche. La formula empirica (CH 2 O)n dove n= 3 o un numero maggiore va formare triosi - tetrosi - pentosi - esosi ecc.

5 GLUCIDI MONOSACCARIDI Si differenziano in aldosi o chetosi a seconda del gruppo in essi presente: H R C O Aldeideidico R R C O Chetonico

6 GLUCIDI DISACCARIDI Formati dall unione di due molecole di monosaccaridi con l eliminazione di una molecola d acqua mediante legame mono o di-glicosidico

7 POLISACCARIDI Formati dall unione di molte molecole di zuccheri semplici, contrariamente ai mono e disaccaridi non sono solubili in acqua e devono essere scissi per venire utilizzati. OMOPOLISACCARIDI: AMIDO, GLICOGENO E CELLULOSA

8 ETEROPOLISACCARIDI Mucopolisaccaridi costituiti da molecole di Monosaccaridi diversi. Molti di essi sono presenti come gruppo prostetico di proteine coniugate (gruppi sanguigni e anticorpi): Neutri: esosi o pentosi (gr.sanguigni) Acidi: ac. uronici o sialici possono essere solforati Eparina,,condroitin solfati e non solforati come l ac. ialuronico

9 MUCINE EPITELIALI NEUTRE MUCINE EPITELIALI NEUTRE O ACIDE con funzione protettiva e lubrificante per le mucose. Localizzazione: - prodotto di secrezione delle cellule delle ghiandole situate nel fondo e nel corpo dello stomaco (PAS +, PASd +) -nello scheletro degli artropodi (chitina) - nella parete di funghi patogeni - nella capsula dello Pneumococco

10 MUCINE EPITELIALI ACIDE SIALOMUCINE (carbossilate): Formate da esoso o esosammina + ac.sialico Sono PAS+, PASd+ e Alcian+ - Ghiandole salivari - Ghiandole intestino tenue -Cripte del colon parte superiore SOLFOMUCINE (esteri solforici): - Ghiandole del colon (PAS+, PASd+ e Alcian+)

11 MPSa MESENCHIMALI Polimeri ad alto P.M. formati prevalentemente: - Ac. glicuronico + glucosammina (- COOH) -Ac. glicuronico + glucosammina solforata (- SO 4 ) (uno o più gruppi -OH sono esterificati con acido solforico) Sono complessi macromolecolari che costituiscono la sostanza fondamentale del mesenchima. Sono PAS -.

12 ACIDO IALURONICO (-COOH): Umor vitreo, membrane sinoviali, cordone ombelicale, cartilagine sostanza fondamentale connettivi. Sensibili alla jaluronidasi batterica e testicolare. CONDROITINA (-COOH): Cornea di bue. IALURONSOLFATO (- SO 4 ): Estere solforico dell'acido jaluronico cornea di bue e cute umana. CHERATOSOLFATO (- SO 4 ): cornea e cartilagine. CONTROITINSOLFATI A-B-C (SO 4 ): cartilagine, ossa, cute, valvole cardiache, tendini, sost. fondamentale dei connettivi sintetizzati dai fibroblasti. EPARINA (SO 4 ): anticoagulante prodotto dalle Mast-cells

13 GLICOGENO: E il solo polisaccaride semplice che riveste interesse nella patologia umana. Ha la funzione di riserva energetica e si accumula nel fegato e nel muscolo (PAS+, PASd -) Molto solubile nei solventi acquosi, il suo comportamento dipende dal grado di polimerizzazione e del rapporto con strutture proteiche, con cui può formare complessi o venire immobilizzato nel reticolo proteico I migliori fissativi sono soluzioni alcooliche, che precipitano i substrati proteici, come il liquido di Carnoy.E ben conservato nei tessuti congelati.

14 PAS PERIODIC ACID SHIFF I componenti maggiormente evidenziati da questa tecnica sono quelli glucidici del glicocalice, della membrana basale, della mucina e dell'eparina. Tuttavia alcuni glucidi (in particolare alcuni mucopolisaccaridi acidi o solforati) non vengono evidenziati poiché la presenza di gruppi carbossilici o solforici può bloccare la reattività dei gruppi glicolici nella reazione PAS (per evidenziare questi composti è in genere utilizzato l Alcian blu ).

15 PAS PERIODIC ACID SHIFF Ossidazione con ac.periodico e colorazione con reattivo di Schiff Ossidazione ad aldeidi, da parte dell'acido periodico, dei gruppi: α- glicolici: -CHOH (l ossidazione si blocca a questo livello) dei gruppi ossidrilici e altri gruppi: CHNH2 CHNH-R CHO CO

16 REATTIVO DI SCHIFF: PAS Si ottiene trattando con acido solforoso in eccesso la FUCSINA BASICA. L ac. blocca il gruppo cromoforo Si ottiene un liquido incolore generalmente chiamato LEUCOFUCSINA che non è un leucoderivato della fucsina ma dell ac. parafucsino-leuco-c-sulfonico-n-sulfinico (ac.4-4 -amminosulfintrifenil-metanosulfonico)

17 PAS Questo reattivo in presenza di aldeidi in ambiente acido e in presenza di SO 2 da luogo alla sintesi di un nuovo composto colorato, basico come la fucsina.

18 PAS OH H C C H OH O H C Gruppi aldeidici C H Ac. periodico PAS+ O

19 REATTIVO DI SCHIFF: Pestare finemente in un mortaio 1,5gr di fucsina basica discioglierli in 200 ml di di H 2 O distillata e aggiungere 1,5 gr di metabisolfito di potassio. Aggiungere 3ml di HCl concentrato e 30 ml di HCl 1N (8,25%) la soluzione si decolora lentamente fino a 12 ore e la completa decolorazione avviene aggiungendo 0,25gr di carbone vegetale per 100 ml di soluzione. Filtrare. Si conserva al buio in contenitori pieni.

20 PAS (Acido Periodico - Schiff) - Sezioni fino all'acqua distillata - Acido periodico 0,5% x min. - Acqua distillata - Reattivo di Schiff x 8 min. - Acqua corrente x 5 min. - Acqua dist. - Ematossilina di Mayer x 5 min. - Acqua dist. - Acqua corrente x 10 min. - Acqua dist. - Disidratare, chiarificare e montare.

21 PAS d (PAS digerito) Digestione enzimatica con α-amilasi -Sezioni fino all'acqua distillata - α-amilasi x 10 min. - Acido periodico 0,5% x min. - Acqua distillata - Reattivo di Schiff x 8 min. - Acqua corrente x 5 min. - Acqua dist. - Ematossilina di Mayer x 5 min. - Acqua dist. - Acqua corrente x 10 min. - ecc..

22 RISULTATI Sostanze PAS + ROSSO MAGENTA NUCLEI BLU

23 PAS POSITIVA Glicogeno mucopolisaccaridi neutri mucoproteine glicoproteine glicolipidi sfingolipidi proteine (debole) NEGATIVA mucopolisaccaridi acidi

24 PAS TEST DI SPECIFICITA' PER GLICOGENO: Controllo enzimatico con diastasi o amilasi: rompe i legami a, 1-4 liberando glucosio. FALSI POSITIVI: Possono essere dovuti alla presenza di gruppi aldeidici liberi nel tessuto (fibre elastiche). Si può procedere con il blocco di questi gruppi mediante trattamento con Dimedone 5 a 60.

25 PAS FALSI POSITIVI: Alcuni fissativi come la gluteraldeide e l acroleina le false positività possono essere evidenziate dal confronto di due metodiche PAS una senza ac. periodico.

26 PAS APPLICAZIONI: Studio di accumulo di glicogeno PAS+ diastasi sensibile -Stati infiammatori o neoplastici -Disordini metabolici congeniti (glicogenosi) Evidenziazione di -MPSn (tiroide,gh.gastriche) PAS+, Alcian -MPSa (gh. intestinali) PAS+, Alcian+

27 PAS

28 PAS

29 PAS

30 PAS

31 ALCIAN Ftalocianina di rame: colorante basico con 4 gruppi cationici per ogni molecola. Il colorante ha forte affinità per le strutture acide del tessuto (legame salino) Si esegue la reazione a differenti valori di ph per differenziare le sostanze acide di diversa natura.

32 ALCIAN La colorazione è condizionata dal ph: - a ph>pk prevalgono i gruppi ionizzati - a ph < pk prevalgono i gruppi non ionizzati I gruppi acidi del tessuto hanno differenti valori di pk. I gruppi -COOH ionizzano circa a ph>2,5 (MPSa carbossilati) I gruppi -HSO4 ionizzano circa a ph 1 (MPSa solforati)

33 APPLICAZIONI DIAGNOSTICHE Studio di tumori scarsamente differenziati o metastasi: Colorazione PAS+ diastasi sensibile: origine epatica Colorazione PAS+ diastasi resistente / Alcian - : origine gastrica Colorazione PAS+ diastasi resistente / Alcian+ : origine intestinale (determinare il distretto con Alcian)

34 ALCIAN ( Mucopolisaccaridi Acidi ) - Sezioni fino all' acqua distillata - Sol. ALCIAN BLUE 8GS ph 2,5 filtrata x 30 min. - Acqua corrente x 10 min. - Acqua dist. - Ematossilina di Mayer x 25 min. - Acqua corrente x 10 min. - Acqua dist. - Disidratare, chiarificare e montare. SOLUZIONI OCCORRENTI ALCIAN BLUE 8GS: Alcian 1 gr. in 100 cc. di Acido Acetico 3% Controllare il ph della soluzione (ph 2,5).

35 ALCIAN PH 1 (x Mucopolisaccaridi solfati) - Sez. fino all' acqua distillata - ALCIAN BLUE 8GS 1% in Hcl 0,1N x 30 min. - Lavare velocemente in Hcl 0,1N - Lavare velocemente in acqua dist. - Asciugare con carta da filtro - Disidratare in Alcool, chiarificare e montare.

36 ALCIAN dopo JALURONIDASI - Sezioni fino all' acqua distillata - Trattare le sez. nella seguente soluz.: x 3 h a 37 JALURONIDASI 0,02 gr TAMPONE FOSFATO 0,1M PH 6,7 10 ml - Acqua corrente x 5 min. - Acqua dist. -Segue colorazione Alcian blue 8GS. TAMPONE FOSFATO 0,1M PH 6,7 SOL. A : Fosfato monobasico di Sodio (Na H 2 PO 2 ) 25,58 gr. in 1000 ml di H 2 O dist. SOL. B : Fosfato bibasico di Sodio (Na 2 HPO 4 ) 28,38 gr. in 1000 ml di H 2 O dist. Per l'uso: SOL. A 56,5 ml SOL. B 43,5 ml

37 ALCIAN - PAS Mucosostanze non reattive al periodato e acidofile - BLU Altri glucidi e mucopolisaccaridi - ROSSO MAGENTA Nuclei BLU scuro

38 VAN GIESON ( Connettivo - Collagene ) (tricromica) - Sez. fino all' acqua distillata - EMATOSSILINA FERRICA DI WEIGERT x 10 min. - Lavaggio rapido in acqua distillata - Acqua corrente x 10 min. - Sol. VAN GIESON x 30'' - 1 min. - Lavare rapidamente in acqua distillata - Lavaggio rapido in Alcool 95 - Disidratare in Alcool assoluto, chiarificare e montare.

39 SOLUZIONI VAN GIESON EMATOSSILINA FERRICA DI WEIGERT SOL. A : Ematossilina 1 gr. Alcool ml. SOL. B : Cloruro ferrico in sol. acquosa 30% 4 ml Acqua distillata 100 ml Hcl concentrato 1 ml SOL. VAN GIESON Fucsina acida sol. acquosa 1% sol satura in acqua di ac. picrico 10 ml 100 ml Risultati: nuclei, nero citoplasma fibre muscolari ed eritrociti,giallo fibre collagene rosso porpora

40 VERHOEFF ( Fibre Elastiche ) - Sez. fino all' acqua distillata - Sol. di Lavoro VERHOEFF x 10 min. - H2O dist. - H2O corrente x 10 min. - Differenziare in una sol. di Cloruro Ferrico al 2% finchè le fibre elastiche appaiono nere su sfondo grigio - H2O corrente x 2-3 min. - H2O dist. - Contrastare con la sol. Van Gieson x 30'' -Lavare rapidamente in H2O dist. -Passaggio veloce in alcool 95 - Disidratare, chiarificare e montare.

41 SOL. di LAVORO VERHOEFF SOL. A : Ematossilina 5 gr. Alcool Assoluto 100 ml SOL. B : Cloruro Ferrico al 10% in H 2 O dist. SOL. C : Lugol : Iodio 1 gr. Ioduro di Potassio 2 gr. H 2 O dist. 100 ml Per l' uso: SOL. A 20 ml SOL. B SOL. C 8 ml 8 ml

42 PICRO MALLORY tricromica (Connettivo) - Sez. fino all' acqua dist. - Celestin Blue x 5 min. - H2O dist. - Ematossilina x 10 min. - H2O dist. - H2O corrente x 10 min. - H2O dist. - Lavare in Alcool 95 - Sol. A fino all'inizio della cristallizzazione (circa 2 min.) - Alcuni cambi di H2O dist. - Sol. B filtrata x 5 min. - H2O dist. - Differenziare in Acido Fosfomolibdico 1% x 10 min. - H2O dist. - Sol. C filtrata x 1 min. - H2O dist. - Disidratare, chiarificare e montare.

43 PICRO MALLORY (Connettivo) SOL. A Alcool etilico 80 Saturare con Acido Picrico Aggiungere Orange G 200 ml 0,2 gr. SOL. B Fucsina Acida Ponceau 2R (o Ponceau di Xilidina) Acido Acetico Glaciale 1% 2 gr. 0,5 gr. 100 ml SOL. C Sciogliere 2-3 gr. di Blu di Anilina in 100 ml di H2O dist. bollente. Aggiungere 2,5 ml di Acido Acetico Glaciale. Raffreddare filtrare. Risultati:

44 PICRO MALLORY (sol. occorrenti) CELESTIN BLUE Celestin Blue Ferro Ammonio Solfato Glicerina H2O dist. 2,5 gr. 25 gr 70 ml 500 ml Sciogliere il Ferro Ammonio Solfato in H2O dist. calda, aggiungere il Celestin Blue e lasciare bollire per qualche minuto. Raffreddare, filtrare la soluzione ed aggiungere la Glicerina. Si conserva per oltre 6 mesi. RISULTATI: Nuclei bruno scuro Fibre di collagene......blu scuro Sostanza fondamentale della cartilagine e dell osso, muco, granuli basofili dell ipofisi e amiloide...blu in varie tonalità Nevroglia, cilindrassi e fibrina, muslo......rosso Granuli acidofili dell ipofisi arancio Mielina e eritrociti... rosa pallido-giallo Fibre elastiche...da rosa pallido a giallo, o incolori

45 FERRO - Sez. fino all' H2O dist. - SOLUZ. di LAVORO x 1 h HCl 1% 50 ml Ferrocianuro di Potassio 20 ml - H2O dist. - Rosso Nucleo x 10 min. - H 2O dist. - Disidratare, chiarificare e montare. Ferro ferrico + ferrocianuro di K= ferrocianuro ferrico (blu di prussia)

46 FERRO COLLOIDALE (metodo di Hale) Metodo selettivo non specifico per i mucopolisaccaridi acidi che hanno la proprietà di assorbire l idrossido di Fe colloidale acidificato il Fe si colora poi con il blu di prussia. - Sez. fino all' H 2 O dist. - Sol. di Ferro Colloidale 100 ml + 10 ml di Ac. Acetico Glaciale x 10 min. - Lavare in 4-5 cambi di H 2 O dist. - Sol. preparata al momento di Ferrocianuro di Potassio 1% in Acido Cloridrico 1% x 10 min. - Lavare bene in H 2 O dist. - Contrastare in Rosso Nucleo -Disidratare e montare. SOL. di FERRO COLLOIDALE Portare ad ebollizione 750 ml di H 2 0 dist. e aggiungere 12 ml di una soluz. di Cloruro Ferrico al 32%. Si ottiene una soluz. di colorito rosso scuro. Al momento dell'uso a 100 ml della sol. aggiungere 10 ml di Ac. Acetico Glaciale.

47 GRAM ( sia positivo che negativo ) - Sez. fino all' acqua distillata - GOOD PASTURE x 10 min. - H2O dist. - Differenziare in alcuni cambi di Formalina 40% - H2O dist. - Sol. satura di Acido Picrico x 3-5 min. - H2O dist. - Alcool 95 - VIOLETTO di GENZIANA x 3 min. - H2O corrente x 5 min. - LUGOL ( Gram Iodio ) x 1 min. - Asciugare il vetrino con carta da filtro - 2 passaggi in Xilolo - Anilina ( una parte - una parte ) - Xilolo e montare. Risultati batteri gram - blu batteri gram + rossi fibrina blu Altri elementi rosso porpora

48 GOOD PASTURE Fucsina Fenica 0,59 gr. Anilina (Amminobenzene) 1 ml Cristalli di Fenolo 1 gr. Alcool etilico ml VIOLETTO DI GENZIANA Violetto di Genziana 5 gr. Alcool etilico Assoluto 10 ml Anilina 2 ml H2O dist. fino a 100 ml Sciogliere il Violetto di Genziana in Alcool. Aggiungere l' Anilina e portare a 100 ml con H2O distillata. LUGOL Jodio Joduro di potassio H2O dist. 1 gr. 2 gr. 300 ml Scioglier lo Joduro di K in una piccola quantità d' acqua dist. Sciogliervi poi lo Jodio e diluire fino a 300 ml con H2O dist.

49 ROSSO CONGO ( Amiloide ) - Sez. fino all' acqua distillata - ROSSO CONGO 1% in H2O dist. x 30 min. - H2O dist. - H2O corrente x 10 min. - H2O dist. - Ematossilina di Mayer x 30 min. - H2O dist. - Immergere 2-3 volte in Alcool Acido ( HCl 1% in Alcool 70 ) - H2O corrente x 10 min. - Immergere 2-3 volte in Ammoniaca 1% in H2O dist. - H2O corrente x 10 min. - H2O dist. -Disidratare, chiarificare e montare. Risultati: Amiloide nuclei rosso blu

50 TIOFLAVINA T (Amiloide in fluorescenza) - Sez. fino all' acqua distillata - Ematossilina di Mayer x 30 min. - H2O dist. - H2O corrente x 10 min. - H2O dist. - TIOFLAVINA T 1% in H2O dist. al buio x 5 min. - H2O dist. - Acido Acetico 1% al buio x 20 min. - Lavare bene in H2O dist. -Montare in Glicerina Tamponata e tenere al buio. Risultati: Amiloide fluorescenza giallo verde nuclei blu

51 FOUCHET ( Pigmenti biliari ) - Sez. fino all' acqua dist. - REATTIVO di FOUCHET x 10 min. - Lavare in H2O dist. - Contrastare con la sol. VAN GIESON x 30' - 1 min. - Lavare rapidamente in H2O di fonte - Disidratare, chiarificare e montare. REATTIVO di FOUCHET Acido Tricloroacetico 25% Cloruro Ferrico Anidro 10% 25 ml 25 ml

52 semplici gliceridi ceridi steridi zoosteroli fitosteroli fungisteroli LIPIDI glicolipidi Cerebrosidi Solfatidi gangliosidi complessi fosfolipidi glicerofosfolipidi sfingofosfolipidi

53 OIL RED O ( x Grassi ) - Fette al congelatore - TEP x 1-2 min. - Sol. O.R.O. x 30 min. - Differenziare in TEP x 1-2 min. - H2O dist. - Ematossilina di Mayer x 25 min. - H2O corrente x 10 min. - H2O dist. -Montare in Glicerina TEP Alcool Isopropilico H2O dist. 60 ml 40 ml SOL. OIL RED O Saturare il Tep con Oil Red O a 56 C per un notte ( 1 gr. in 100 ml ). Raffreddare e filtrare. RISULTATI: Lipidi Rossi; nuclei Blu

54 SUDAN BLACK B ( x Grassi ) - Fette al congelatore - H2O dist. - SUDAN BLACK B x 5-7 min. - GLICOLE PROPILENICO 85% 2 passaggi - H2O dist. - Contrastare con Rosso Nucleo - Montare in Glicerina. SUDAN BLACK B Sudan Black B 0,5 gr. Glicole Propilenico 100 ml Aggiungere un po' di Glicole Propilenico al Sudan Black B agitando. Aggiungere gradatamente in restante Glicole riscaldando e agitando continuamente fino a 95 C. Filtrare la sol. ancora calda. La sol. si mantiene indefinitamente. RISULTATI: Lipidi Blu nero ; nuclei Rosso

55 ZIEHL - NIELSEN ( Basofilia Acida e Alcool resistente ) - Sez. fino all' acqua distillata - FUCSINA FENICA a 60 C x 3 h - Raffreddare nella sol. e quindi lavare in H 2 O dist. - H 2 O corrente x 10 min. -Differenziare in Alcool Acido (HCl 1% in Alcool 70 ) finchè i globuli rossi appaiono rosa - H 2 O corrente x 2min. - H 2 O dist. - Ematossilina di Mayer x 30 min. - H 2 O dist. - H 2 O corrente x 10 min. - H 2 O dist. - Disidratare, chiarificare e montare.

56 FUCSINA FENICA Fucsina Basica H 2 O dist. Acido Fenico cristalli Alcool 95 3 gr. 300 ml 15 gr. 30 ml Sciogliere la Fucsina nell' Alcool 95, aggiungere l' Acido Fenico e quindi a poco a poco l' H 2 O dist., infine filtrare. La soluzione si mantiene per un anno. Filtrare prima dell' uso.

57 RETICOLO - GORDON SWEET (fibre reticolari) - Sez. fino all' acqua distillata - Ossidare in Permanganato di K 1% x 3 min. - H 2 O dist. - Decolorare in Acido Ossalico 1% - H 2 O dist. - Mordenzare in Allume Ferrico 2,5% x 3 min. - 2 cambi di H 2 O dist. - Sol. Argento ammoniacale filtrata x 5 min. - 2 cambi di H 2 O dist. - Ridurre in Formalina al 10% x 2 min. - H 2 O dist. - Fissare in Tiosolfato di Na 5 % x 2 min. - H 2 O dist. - Sfumare in Cloruro d' Oro 0,1% x pochi secondi - H 2 O dist. - Disidratare, chiarificare e montare.

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59 ELEMENTI MINERALI Il calcio si trova sottoforma sia di Sali solubili che insolubili la parte insolubile è la quota più abbondante. Il metodo si basa su una reazione di sostituzione che consiste nel trattare il tessuto con una sol contenente un metallo pesante che possa sostituire il calcio formando un sale meno solubile e che può essere evidenziato. Nella reazione Von Kossa si verifica il seguente scambio: Ca 3 (PO 4 ) AgNO 3 2 Ag 3 PO Ca(NO3) 2 Il fosfato d argento viene evidenziato come argento metallico utilizzando come riducente una sorgente luminosa

60 VON KOSSA ( x sali di Calcio ) - Sez. fino all'acqua distillata -Trattare le sez. con la sol. di NITRATO di ARGENTO 5% alla luce splendente (sole) x min. oppure si può usare una lampada con filamento di tungsteno-luce U.V. x 5-10 min. N.B. : Le comuni vasche di vetro non fanno filtrare la luce U.V., quindi vasche di quarzo o si fa piovere la luce dall'alto, mettendo il vetrino in una capsula di Petri. si usano - Lavare bene in H2O dist. - Fissare in TIOSOLFATO di SODIO 3% x 5 min. - Lavare bene in H2O dist. - Contrastare con Rosso Nucleo - H2O dist. - Disidratare, chiarificare e montare. Risultati : Sali di Ca insolubili - MARRONE o NERO Altre strutture - ROSA ROSSO

61 GRIMELIUS (x Cellule alfa2 pancreatiche) Reazione argentofila - Sez. fino all'acqua distillata - SOL. d' ARGENTO a 60 C x 3 h - H2O dist. - SOL. RIDUCENTE a 60 C x 2 min. - Lavare in H2O dist. (Controllare l'intensità dell'impregnazione al microscopio che dovrebbe essere marrone-nero. Se questa fosse debole, ritornare nella sol. di Ag. a temp. ambiente x 15 min., poi di nuovo nella sol. riducente a 60 C x 1 min.) - Disidratare, chiarificare e montare.

62 SOLUZIONE d' ARGENTO In 100 ml di Tampone Acetato 0,2 M ph 5,6 * sciogliere 0,5 gr. di Nitrato di Argento (Ag NO 3 ). * TAMPONE ACETATO 0,2 M ph 5,6 SOL. A : Sol. 0,2 M di Sodio Acetato: 16,4 gr. in 1000 ml di H 2 O dist. SOL. B : Sol. 0,2 M di Acido Acetico: 11,45 ml in 100 ml di H 2 O dist.. ( 12 ml in 1000 ml) Per l'uso: SOL. A 45,2 ml SOL. B 4,8 ml Portare a 100 ml con H 2 O dist. SOLUZIONE RIDUCENTE Idrochinone ( C 6 H 4 NH 2 ) Solfito di Sodio H 2 O dist. 1 gr. 5 gr. 100 ml Nell' H 2 O dist. sciogliere un pizzico di Solfito di Sodio e l' Idrochinone; quindi aggiungere il restante Solfito di Sodio.

63 MASSON FONTANA Reazione argentaffine (Melanina) - Sez. fino all' acqua distillata - Soluzione di MASSON FONTANA al buio e al coperto x 1 notte - Lavare bene in H2O dist. - Fissare in TIOSOLFATO di SODIO al 5% x 3 min. - Lavare in H2O dist. - Contrastare con Rosso Nucleo x 10 min - H2O dist. -Disidratare, chiarificare e montare. SOLUZIONE DI MASSON FONTANA A 20 ml di Nitrato di Argento al 10% aggiungere Ammoniaca goccia a goccia finchè il precipitato sia quasi del tutto disciolto ( aggiungere eventualmente altro Ag NO3 per riottenere la torbidità biancastra ). Aggiungere 20 ml di H2O dist.. Lasciare decantare in bottiglia scura per un giorno. Filtrare la soluzione prima dell'uso. La soluzione si mantiene per circa 30 giorni e non può essere usata più di 4 o 5 volte.

64 GROCOTT HEXAMINE SILVER ( x Funghi ) - Sez. fino all' acqua dist. - Ossidare in Acido Cromico 5% x 1 h - Lavare velocemente in H 2 O corrente - H 2 O dist. - - Metabisolfito di Sodio 1% x 1 min. - Lavare in H 2 O corrente x 5-10 min. - Lavare bene in H 2 O dist. ( 3-4 cambi ) - Soluz. di Argento posta in un bagno d'acqua a 56 C x circa min. (Controllare la colorazione fno a che le sez. appaiono dal giallo al marrone-oro) - Lavare in una sol. di Hexamine 3% (Funghi dal marrone al nero) - Lavare in 3 cambi di H 2 O dist. - Tonificare in Cloruro d' Oro 0,1% x 1-2 min. - H 2 O dist. - Fissare in Tiosolfato di Sodio 3% x 2 min. - H 2 O dist. - Contrastare in Verde Luce (Diluito 1: 5) x 30''- 1 min. - H 2 O dist.

65 SOL. STOCK HEXAMINE SILVER Nitrato di Argento 5% Sol.acquosa di Hexamine 3% 5 ml 100 ml (Hexamethylentetramine - sost.org. n 16) Unire le 2 soluz. agitando fino alla completa scomparsa del precipitato bianco. SOLUZIONE D' ARGENTO Borace 5% 2 ml H 2 O dist. 25 ml Mescolare e aggiungere: Soluz. Stock VERDE LUCE Verde Luce H 2 O dist. Acido Acetico Per l' uso diluire 1: 5 0,2 gr. 100 ml 0,2 ml 25 ml

66 METODO WARTHIN - STARRY ( Spirocheta Helicobacter pilori ) - Sez. fino all'acqua distillata - Lavare nella sol. TAMPONE W.S. a temp. amb x 5 min. - SOLUZ. d' ARGENTO a 60 C x 1 h - SOLUZ. di SVILUPPO a 60 C x 3 min. circa fino a che le sezioni assumono un colore giallo-marrone. (Lo sviluppo è la parte critica di questa tecnica. Se a occhio nudo le sezioni appaiono giallo-pallide lo sviluppo non è stato sufficiente, mentre con un sovrasviluppo le sezioni appaiono marrone-oro scuro.) - Bloccare la reazione in H 2 O di rubinetto a 60 C - Lavare le sezioni nella soluz. TAMPONE W.S. - H 2 O dist. - Fissare in Tiosolfato di Sodio 5% - H 2 O dist. - Disidratare, chiarificare e montare.

67 TAMPONE WARTHIN - STARRY Acetato di Sodio anidro 8,20 gr. Acido Acetico 12,5 ml H 2 O dist ml Il Tampone si conserva in frigo a 4 C. SOLUZIONE di ARGENTO Nitrato di Argento 0,5 gr. Sol. Tampone W.S. 50 ml Nella preparazione della sol. il Tampone va riscaldato a 60 C. La sol. si può riusare e si conserva a temp. amb. al buio SOLUZIONE di SVILUPPO (La sol, si prepara pochi istanti prima dell'uso). Nitrato di Argento al 2 % in H2O bidistillata 9 ml Gelatina al 5 % in H 2 O bidist. 45 ml Idrochinone al 3 % in Tampone W.S. 3 ml Nella preparazione della sol. è importante rispettare la sequenza dei componenti sopraindicata. La sol. di Gelatina ( 2,25 gr. in 45 ml di H2O bidist.) si prepara per l'uso sciogliendo la Gelatina nell'h 2 O bidist. calda e quindi ponendola in stufa a 37 C.

68 GRIDLEY (x Funghi) - Sez. fino all'h 2 O dist. - Cromizzare in ACIDO CROMICO 4% x 1 h - H 2 O corrente x 5 min. - Reattivo di SCHIFF x 8 min. - H 2 O corrente x 10 min. - H 2 O dist. - ALDEIDE FUCSINA x 30 min. - Lavare in 2 cambi di Alcool 95 - H 2 O dist. x 5 min. - GIALLO METANILE x 1-2 min. - H 2 O dist. -Disidratare, chiarificare e montare. Risultati : Miceti dei funghi, tessuto elastico e mucina - BLU Conidi - ROSSO PORPORA Altri componenti del tessuto - GIALLO

69 GIEMSA - Sez. fino all' acqua distillata - GIEMSA Reattivo x 1 h - Veloce passaggio in H2O dist. + 1 goccia di ac. acetico - Veloce passaggio in Alcool 95 - Alcool Isopropilico - Chiarificare e montare. GIEMSA REATTIVO (soluzione alcolica di eosinato di azzurro) Giemsa H2O dist. Risultati: 20 ml 80 ml batteri Blu sostanze acidofile rosso arancio mucopolisaccaridi acidi - rosso violetto

70 GIEMSA - pronormoblasto

71 LUXOL FAST BLUE ( x Mielina ) Sezioni in paraffina o al congelatore di circa 20 micron - Sez. fino all'alcool 95 - SOL. LUXOL FAST BLUE a 60 C x 1 notte - Lavare in Alcool 95 e poi in H2O dist. -(a) Iniziare la differenzazione immergendo le sezioni in -Carbonato di Litio 0,005% x 10 sec. - (b) Differenziare in Alcool 70 finchè sostanza grigia e bianca siano facilmente distinguibili (x sec. circa) -Lavare bene in H2O dist. e controllare al microscopio -(i nuclei dovrebbero essere decolorati). Ripetere i passaggi (a) e (b) se necessario. - Colorare in Cresyl Violetto 0,1% in Ac.Acetico 1% a 37 C (30 ml di Cresyl + 3 gocce di Ac.Acetico) x 7-10 min. - H2O dist. - Lavare in Alcool 70 - Differenziare in Alcool 95 finchè solo i nuclei e la sostanza di Nissl appaiono colorati in porpora - Lavare rapidamente in Alcool Assoluto, chiarificare e montare. Risultati : Mielina - BLU Nuclei - PORPORA Sost.di Nissl - PORPORA

72 LUXOL FAST BLUE ( x Mielina )