Dott.ssa Formisano Gelsomina

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1 GenHort: Modulo B10 Metodi Dott.ssa Formisano Gelsomina di selezione genomica in zucchino

2 Programma Lo zucchino: origine, gruppi varietali, risorse genetiche, miglioramento genetico e metodi di selezione Strumenti di analisi genomica: analisi della diversità genetica in zucchino usando marcatori molecolari 8; Mappe genetiche e popolazioni di mapping (magic population) Sistema CRISPR/CAS in pianta (Dott. Paolo Ioviene) e lettura paper Discussione paper e test finale Visita azienda la Semiorto Sementi srl e campi /serre di zucchino

3 Strumenti di analisi genomica Un settore di notevole interesse e grandi potenzialità è quello dell analisi del genoma basata sulla rilevazione di marcatori molecolari. Si tratta di un settore in rapida evoluzione che si avvantaggia da una parte dello sviluppo di tecnologie sempre più sensibili ed affidabili e dall altro della conoscenza sempre più approfondita della struttura, organizzazione e funzione degli acidi nucleici. Un MARCATORE MOLECOLARE può essere definito come quel locus genomico che, in virtù della sua presenza, contraddistingue in modo caratteristico ed inequivocabile il tratto cromosomico con il quale si identifica.

4 Strumenti di analisi genomica Vantaggi dei Marcatori molecolari: 1. Non subiscono interferenze da parte dell ambiente 2. Coprono qualsiasi parte del genoma trascritta o non (quindi anche introni e regioni di regolazione), e consentono pertanto di rilevare differenze anche tra individui geneticamente molto simili ma distinguibili fenotipicamente 3. Non presentano effetti epistatici o pleiotropici 4. In molti casi hanno espressione codominante consentendo di distinguere l eterozigote dagli omozigoti

5 Strumenti di analisi genomica Essi si distinguono per il tipo di sequenze analizzate e/o per il tipo di tecnica impiegata Schema sinottico delle principali classi di marcatori molecolari utilizzabili per l analisi del genoma. La classificazione adottata si basa sulla tecnologia utilizzata (SBH-Southern Blot Modulo Hybridization B.10 GENHORT: o PCR, Metodi Polymerase di slezione genomica in zucchino Chain Reaction) e sul numero di loci saggiati (single-locus o multi-locus).

6 Strumenti di analisi genomica L Uso dei Marcatori molecolari in campo vegetale: 1. Caratterizzazione della variabilità genetica 2. Tipizzazione ed identificazione varietale 3. Costruzione di mappe genetiche 4. Mappaggio genetico 5. Selezione assistita (MAS)

7 Strumenti di analisi genomica L Uso dei Marcatori molecolari in campo vegetale: 1. Caratterizzazione della variabilità genetica 2. Tipizzazione ed identificazione varietale 3. Costruzione di mappe genetiche 4. Mappaggio genetico 5. Selezione assistita (MAS)

8 Caratterizzazione della variabilità genetica Per iniziare un lavoro di miglioramento genetico dello zucchino è importante conoscere la natura della diversità genetica all interno e tra i diversi gruppi della specie C. pepo. Tale studio consente: 1. L analisi della variabilità genetica all interno e tra diversi gruppi di cv 2. L identificazione delle stesse 3. L introgressione di geni utili dal germoplasma disponibile alle specie coltivate 4. La ricostruzione della storia evolutiva e del processo di domesticazione delle specie e la definizione delle distanze genetiche tra di esse

9 Caratterizzazione della variabilità genetica 5. Di individuare popolazioni di origine al fine di generare appropriate linee e produrre ibridi superiori massimizzando l espressione di eterosi. Si assume che la superiorità della combinazione ibrida è maggiore se i due genitori sono geneticamente più distanti (Hallauer e Miranda 1988).

10 Caratterizzazione della variabilità genetica in zucchino Per lo studio dei polimorfismi sono stati utilizzati diversi marcatori come RFLP, RAPD, AFLP e SSR.

11 Caratterizzazione della variabilità genetica in zucchino Al fine di identificare e caratterizzare una popolazione utile a generare parentali che potrebbero produrre ibridi superiori 1. Reperimento di una collezione di germoplasma di zucchino e sua caratterizzazione morfologica 2. Analisi molecolare con AFLP, SSR, RAPD

12 Reperimento di germoplasma Sono state reperite 57 cv. di zucchino suddivise in: 10 varietà (Italia) 3 linee (Israele) 13 ibridi commerciali Gruppo Accessione Resistenza/ Ditta sementiera o tolleranza referenza Cocozelle GS2386 F1 PM, ZYMV Syngenta Cocozelle Ortolana di Faenza -- La Semiorto Sementi Cocozelle Lungo Bianco -- La Semiorto Sementi Cocozelle San Pasquale -- La Semiorto Sementi Cocozelle Alberello Sel. Valery -- La Semiorto Sementi Cocozelle Lungo Fiorentino -- La Semiorto Sementi Cocozelle Romanesco -- La Semiorto Sementi Cocozelle Bianca di Trieste -- La Semiorto Sementi Cocozelle Altea F1 -- Syngenta Vegetable Marrow Carisma F1 PM, ZYMV Syngenta Vegetable Marrow Tonya F1 ZYMV Syngenta Zucchini Afrodite F1 CMV, WMV, ZYMV Syngenta Zucchini Giove F1 WMV, ZYMV Petoseed Zucchini Mikonos F1 PM, CMV, WMV, ZYMV Syngenta Zucchini Nano Verde di Milano -- La Semiorto Sementi Zucchini Quine F1 PM, CMV, WMV, ZYMV Syngenta Zucchini True French -- Thompson & Morgan Zucchini Panter F1 PM, CMV, PRSV, ZYMV Peotecseed Zucchini ZU1805 F1 PM, CMV, WMV, ZYMV Peotecseed Zucchini President F1 -- La Semiorto Sementi Zucchini Diamant F1 -- La Semiorto Sementi Zucchini Obsidian F1 PM, ZYMV -- Zucchini 381e ZYMV Paris and Cohen, 2000 Zucchini 968Rb PM Cohen et al., 2003 Pumpkin Tondo di Piacenza -- La Semiorto Sementi Pumpkin Tondo chiaro di Nizza -- La Semiorto Sementi

13 Reperimento di germoplasma Ø Sono state ottenute dal Dott. H.S. Paris del Centro di Ricerca Newe Ya ar, Israele i semi: 1. linea inbred della cv. True French 2. linea isogenica (BC6F4) della cv.true French resistente all oidio (Sf) (968Rb) (Cohen e al. 2003) 3. linea isogenica (BC6F10) della cv.true French resistente allo ZYMV (381e) (Paris e Cohen 2000) di slezione genomica in zucchino

14 Reperimento di germoplasma 31 varietà (Spagna) Gruppo Codice Origine Cocozelle A CU 2 Sarrión;Teruel Cocozelle AN CU 75 Cabra;Córdoba Cocozelle C CU 9 Torelló;Barcelona Cocozelle V CU 74 Valencia Cocozelle V CU 116 Giraba;Castellón Cocozelle V CU 185 Cañada;Alicante Cocozelle PAS viver, castellon Vegetable marrow A CU 12 Quicena;Huesca Vegetable marrow AFR CU 12 Khmelat AN CU 23 Ronda dirección Arriate;Málaga Vegetable marrow AN CU 113 Beires;Almería Vegetable marrow CL CU 19 Hontalbilla;Segovia Vegetable marrow CL CU 21 Simancas;Valladolid Vegetable marrow CM CU 32 Mariana;Cuenca Vegetable marrow CM CU 47 Almodóvar del Campo;Ciudad Real Vegetable marrow V CU 10 Utiel;Valencia Vegetable marrow 949 Mondéjar;Guadalajara Vegetable marrow V 21 / Vegetable marrow AN CU 27\1 algeciras direccion el riconcillo cadiz Zucchini A CU 13 Quicena;Huesca Zucchini E CU 27 Madrigal de la Vera;Cáceres Zucchini MU CU 16 Ñorica.Totana;Murcia Zucchini MU CU 20 Altobordo.Lorca;Murcia Zucchini BBC6 / Zucchini E CU 10 Garganta; caceres Zucchini E CU 227 / Pumpkin PJI / Pumpkin Styrian / Acorn BGU 8238 / Crookneck NSL 5227 / Scallop V CU 196 /

15 Caratterizzazione morfologica 6 Caratteri portamento ramificazioni incisioni fogliari chiazze argentee sulle foglie forma frutto colore frutto

16 Caratterizzazione morfologica cultivar Portamento Ramificazioni Incisioni Chiazze Forma frutto Colore frutto Semi eretto strisciante strisciante assenti presenti lievi medie profonde assenti presenti cilindrica clavata tonda verde crema Italiane + Israeliane Spagnole

17 Caratterizzazione della variabilità genetica in zucchino Al fine di identificare e caratterizzare una popolazione utile a generare parentali che potrebbero produrre ibridi superiori 1. Reperimento di una collezione di germoplasma di zucchino e sua caratterizzazione morfologica 2. Analisi molecolare con AFLP, SSR, RAPD I moderni strumenti della genetica molecolare e della genomica contribuiscono agli studi della diversità genetica, permettendo di affiancare ai dati tradizionalmente usati, quali dati morfologici, quelli dei marcatori molecolari del DNA che sono estremamente informativi.

18 AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism Vantaggi Sono marcatori altamente polimorfici e potenti per studi intraspecifici Sono riproducibili E una tecnica facile ed i primer sono standard Svantaggi La procedura è lunga Spesso i risultati sono difficili da analizzare E una tecnica costosa Procedura per la rilevazione di marcatori AFLP comprendente la digestione del DNA con due distinti enzimi di restrizione, la ligazione di adattatori, la pre-amplificazione e l amplificazione finale con primer aventi una o più basi selettive.

19 RAPD Random Amplified Polymorphic DNA Una semplice PCR con un solo primer (normalmente di 10 basi) di sequenza casuale Vantaggi E una metodica facile e veloce Alto polimorfismo Occorrono solo piccole quantità di DNA Permette di individuare e caratterizzare tramite il sequenziamento utili marcatori a partire dal prodotto RAPD (bande) Svantaggi Sono marcatori dominanti Problemi di riproducibilità Comigrazione di frammenti di slezione genomica in zucchino

20 SSR Simple Sequence Repeat o Microsatelliti Polimorfismo determinato dal diverso numero di basi ripetute Vantaggi degli SSR Altamente polimorfici e particolarmente adatti alla tipizzazione genotipica e all identificazione varietale Codominanti Alta riproducibilità Svantaggi degli SSR Sono necessarie informazioni sulla sequenza per poter disegnare i primer nelle zone fiancheggianti ed i procedimenti per ottenerle sono molto dispendiose e lunghe Di solito è necessario testare librerie genomiche per individuare e caratterizzare i loci microsatellite per quelle specie oggetto di studio di slezione genomica in zucchino

21 Analisi a livello molecolare: AFLP Sono state analizzate 17 linee tra i diversi ibridi, le varietà standard e le tre linee isogeniche con 4 combinazioni di primer Primer N totale di bande % di bande polimorfiche N totale di bande accessionispecifiche E-AGC M-CAG E-AGC M-CAC E-ACT M-CAT E-ACT M-CAC Totale Media I diversi profili AFLP sono stati confrontati e i polimorfismi sono stati designati con 1 (presenza del frammneto) o con 0 (assenza dei frammenti)

22 Analisi a livello molecolare L analisi della variabilità genetica prevede la stima di particolari coefficienti di similarità genetica (SG) o dissimilarità genetica (DG). A tal fine, i dati relativi all insieme dei marcatori molecolari raccolti nel campione di individui in esame sono utilizzati per costruire le matrici di similarità o dissimilarità, calcolando i coefficienti relativi in tutte le possibili combinazioni a coppia tra tutti gli individui di una popolazione I coefficienti di similarità utilizzabili a tale scopo sono molteplici. In tutti i casi, un valore di similarità pari a 1 indica completa identità tra la coppia di individui considerati mentre un valore uguale a 0 completa diversità.

23 Analisi a livello molecolare: AFLP La similarità genetica tra le diverse accessioni è stata ottenuta usando il coefficiente simple matching (SoKal e Michener 1958)

24 Analisi a livello molecolare Le matrici sono necessarie per condurre le analisi di raggruppamento attraverso la costruzioni dei dendrogrammi. I metodi di costruzione dei dendrogrammi si possono classificare in due famiglie: quelli basati su matrici di distanza e quelli basati sulla condivisione dei caratteri. Nel primo caso si calcola separatamente la distanza fra tutte le possibili coppie di specie (i metodi di calcolo della distanza sono molteplici): UPGMA e Neighbor Joining Nel secondo caso i caratteri che sono condivisi da una o più specie vengono inclusi nell analisi uno alla volta e danno luogo ad una gerarchia di ramificazioni senza che si passi attraverso il calcolo di una distanza

25 Analisi a livello molecolare:aflp Nel nostro caso, è stato costruito un albero filogenetico con neighbourjoining usando il programma PHYLIP 3.62 (Felsenstein 1993). Con l approccio dell algoritmo neighbour-joining si inizia con un albero a stella in cui tutte le branche sono della stessa lunghezza, e le diramazioni vengono poi risolte una alla volta. Il risultato finale è un dendrogramma in cui la lunghezza di ciascuna branca è proporzionale alla distanza media di ciascuna specie da tutte le altre. tale algoritmo è considerato un buon compromesso fra velocità di calcolo e accuratezza del risultato

26 AFLP Dendogramma: I codici dei nomi presentano le doppie lettere riferite Modulo al gruppo B.10 GENHORT: di appartenenza Metodi di e le triple riferite all accessione. I numeri ai nodi sono i valori bootstrap slezione (%). genomica in zucchino

27 Analisi a livello molecolare: SSR 1. Sono state analizzate mediante 60 SSR: 10 varietà standard di derivazione italiana 31 varietà di derivazione spagnola 5 ibridi commerciali 2. Sono stati utilizzati 30 SSR-EST e 30 SSR genomici

28 SSRg Primer Gruppo di linkage N alleli attesi N alleli osservati % di alleli polimorfici N di alleli acces. specifici motivo N ripetiz. SSR dimensioni attese (bp) dimensioni osservate + coda (bp) CMTp ga CMTp aag CMTp131 3a ccg CMTp187 3b cag+caa CMTp ttc CMTp tc CMTp gtt CMTp atc CMTp caa CMTp gga CMTp tc CMTp cgt CMTp ga+t CMTp145 10a cat CMTp66 10a gaa CMTp cat CMTp gcg CMTp aac CMTp tatt CMTp tc CMTp gaa CMTp cca CMTp gaa CMTp ag CMTp gtt CMTp gtt CMTp cat CMTp cat CMTp gat CMTp ag Totale Media 3,6 90 0,5

29 SSR-EST Primer N alleli % di alleli polimorfici N di alleli acces. specifici motivo N ripetiz. SSR dimensioni (bp) funzione genica CUTC cag nascent polypeptide-associated complex (NAC) domain containing protein CUTC tct 8 -- eukariotic initiation factor iso4e (cucumis melo) CUTC tgc protein binding CUTC agc aconitate hydratase, cytoplasmatic, putative CUTC ctt Os07g (oryza sativa) CUTC gaa ABC-type Co2+ transport system, permease component (Zea mays) CUTC cgt hypothetical protein (Vitis vinifera) CUTC cct Hypothetical protein CUTC gaa NDH-dependent cyclic electron flow 1 CUTC ggt UV-B-insensitive 4 CUTC ctt Hypothetical protein (Vitis vinifera) CUTC gaa Hypothetical protein CUTC cag RNA binding CUTC caa EIN3- like protein (Cucumis melo) CUTC ctt 6 -- zinc finger (C2H2 Type) family protein CUTC agc glycine-rich protein Totale Media 2,8 83 0,2

30 SSR Dendrogramma derivato dall analisi di 48 accessioni di Cucurbita, basata su 193 bande SSR. I numeri ai nodi sono i valori bootstrap.

31 Analisi a livello molecolare: RAPD Sono state analizzate 17 linee tra i diversi ibridi, le varietà standard e le tre linee isogeniche con 7 primer Primer N totale di bande % di bande polimorfiche N di bande accessioni specifiche OPAA OPG OPK OPN OPV OPAJ OPM Totale Media ,4

32 Analisi a livello molecolare: RAPD codici linee codici linee M M 1kb M M 1Kb OPAA17 OPAJ03 Profilo elettroforetico RAPD

33 Analisi a livello molecolare: AFLP-SSR-RAPD Marker N totale di bande % di bande polimorfiche N di bande accessioni specifiche AFLP SSR 3,2 87 0,3 RAPD ,4

34 Analisi a livello molecolare: AFLP-SSR-RAPD Il valore informativo di ogni marcatore può essere valutato basandosi sul suo valore PIC (Polymorphic Information Content). Si basa sul calcolo del numero di alleli (o bande) che un marcatore ha e la frequenza di ciascuno di questi alleli nel germoplasma studiato. I marcatori con pochi alleli (o bande) hanno meno potere di distinguere i diversi genotipi che costituiscono il germoplasma Sono preferiti i marcatori che posseggono un elevato valore PIC.

35 Analisi a livello molecolare: PIC La formula è :

36 Analisi a livello molecolare: AFLP-SSR-RAPD L analisi con i marcatori molecolari ha permesso di valutare la variabilità genetica e le relazioni genetiche presenti tra le diverse accessioni ma anche lo stadio di introgressione di caratteri di interesse e fornire possibili vie per superare le difficoltà di introgressione Confrontando le potenzialità dei tre metodi molecolari: gli AFLP e gli SSR sono più efficienti nel rilevare polimorfismi, nell automazione del sistema, nell interpretazione dei dati e nella loro riproducibilità