PAOLO CORRADINI - ROBIN FOÀ

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1 PAOLO CORRADINI - ROBIN FOÀ M. BOCCADORO - M.D. CAPPELLINI - C. CARLO-STELLA M. CATTANEO - A.B. FEDERICI - C. GAMBACORTI-PASSERINI G. LAMBERTENGHI DELILIERS - P.M. MANNUCCI - F. PANE F. PEYVANDI - E.M. POGLIANI Manuale di EMATOLOGIA II edizione EDIZIONI MINERVA MEDICA

2 2008 I edizione 2015 II edizione ATTENZIONE La medicina è un campo in continuo divenire. Occorre seguire precauzioni di sicurezza standard, ma con l ampliamento delle conoscenze determinato dalla ricerca e dall esperienza clinica, possono diventare necessari cambiamenti nella terapia e nell approccio farmacologico. Si consiglia al lettore di verificare le informazioni più aggiornate fornite dalla casa farmaceutica sul prodotto che deve essere somministrato allo scopo di controllare dose, metodo e durata della somministrazione raccomandata e controindicazioni. È responsabilità del medico prescrivente determinare, sulla scorta dell esperienza e della conoscenza del paziente, i dosaggi e il miglior trattamento per ciascun singolo paziente. Né la casa editrice né gli autori si assumono la responsabilità di ogni lesione e/o danno a persone o derivanti da questa pubblicazione. Le fotocopie per uso personale del lettore possono essere effettuate nei limiti del 15% di ciascun volume/fascicolo di periodico dietro pagamento alla SIAE del compenso previsto dall art. 68, commi 4 e 5, della legge 22 aprile 1941 n Le fotocopie effettuate per finalità di carattere professionale, economico o commerciale o comunque per uso diverso da quello personale possono essere effettuate a seguito di specifica autorizzazione rilasciata dal CLEARedi, Centro Licenze e Autorizzazioni per le Riproduzioni Editoriali, Corso di Porta Romana 108, MILANO, autorizzazioni@clearedi.org e sito web Le fotocopie per uso personale del lettore possono essere effettuate nei limiti del 15% di ciascun volume/fascicolo di periodico dietro pagamento alla SIAE del compenso previsto dall art. 68, commi 4 e 5, della legge 22 aprile 1941 n Le riproduzioni effettuate per finalità di carattere professionale, economico o commerciale o comunque per uso diverso da quello personale possono essere effettuate a seguito di specifica Autorizzazione rilasciata da AIDRO, Corso di Porta Romana n. 108, Milano 20122, segreteria@aidro. org e sito web www. aidro. org ISBN: EDIZIONI MINERVA MEDICA S.p.A. Corso Bramante 83/ Torino Sito Internet: / minervamedica@minervamedica.it I diritti di traduzione, memorizzazione elettronica, riproduzione e adattamento totale o parziale, con qualsiasi mezzo (compresi microfilm e copie fotostatiche), sono riservati per tutti i Paesi.

3 EDITOR E AUTORI EDITOR Paolo Corradini Cattedra di Ematologia Università degli Studi di Milano, Dipartimento di Ematologia, Fondazione IRCCS Istituto Nazionale dei Tumori, Milano Robin Foà Cattedra di Ematologia, Dipartimento di Biotecnologie Cellulari ed Ematologia, Università Sapienza di Roma AUTORI Claudio Annaloro U.O. di Ematologia I e Centro Trapianti di Midollo, IRCCS Fondazione Ospedale Maggiore Policlinico Mangiagalli e Regina Elena, Dipartimento di Scienze Mediche, Università degli Studi di Milano Mario Boccadoro Divisione Universitaria di Ematologia, Azienda Ospedaliero-Universitaria S. Giovanni Battista di Torino, Ospedale Molinette, Torino Antonino Cannavò Centro Emofilia e Trombosi A. Bianchi Bonomi, Fondazione IRCCS Ca Granda Ospedale Maggiore Policlinico, Milano Maria D. Cappellini Dipartimento di Medicina Interna e Specialità Mediche, IRCCS Fondazione Ospedale Maggiore Policlinico Mangiagalli e Regina Elena, Milano Carmelo Carlo-Stella Dipartimento di Oncologia ed Ematologia, Humanitas Cancer Center, Istituto Clinico Humanitas, Università degli Studi di Milano Cristiana Carniti Dipartimento di Ematologia, Fondazione IRCCS Istituto Nazionale dei Tumori, Università degli Studi di Milano Marco Cattaneo Unità di Medicina III - Ematologia e Trombosi, Azienda Ospedaliera San Paolo, Università degli Studi di Milano Chiara Cerrato Divisione Universitaria di Ematologia, Azienda Ospedaliero-Universitaria S. Giovanni Battista di Torino, Ospedale Molinette, Torino

4 IV MANUALE DI EMATOLOGIA Sabina Chiaretti Divisione di Ematologia, Dipartimento di Biotecnologie Cellulari ed Ematologia, Università Sapienza di Roma Agostino Cortelezzi U.O. di Ematologia I e Centro Trapianti di Midollo, IRCCS Fondazione Ospedale Maggiore Policlinico Mangiagalli e Regina Elena, Dipartimento di Scienze Mediche, Università degli Studi di Milano Ilaria Del Giudice Divisione di Ematologia, Dipartimento di Biotecnologie Cellulari ed Ematologia, Università Sapienza di Roma Elena M. Elli Divisione di Ematologia e Unità Trapianto di Midollo Osseo, Ospedale San Gerardo, Università Milano- Bicocca, Monza Lucia Farina Dipartimento di Ematologia, Fondazione IRCCS Istituto Nazionale dei Tumori, Università degli Studi di Milano Augusto B. Federici UOC di Ematologia e Medicina Trasfusionale, Azienda Ospedaliera e Polo Universitario Luigi Sacco; Dipartimento di Scienze Cliniche e Comunità, Università degli Studi di Milano Eti Alessandra Femia Unità di Medicina III - Ematologia e Trombosi, Azienda Ospedaliera San Paolo, Università degli Studi di Milano Barbara Ferrari Fondazione IRCCS Ca Granda Ospedale Maggiore Policlinico, Milano Nicola S. Fracchiolla U.O. di Ematologia I e Centro Trapianti di Midollo, IRCCS Fondazione Ospedale Maggiore Policlinico Mangiagalli e Regina Elena, Dipartimento di Scienze Mediche, Università degli Studi di Milano Carlo Gambacorti-Passerini Divisione di Ematologia e Unita Trapianto di Midollo Osseo, Ospedale San Gerardo, Università Milano- Bicocca, Monza Giorgio Lambertenghi Deliliers IRCCS Fondazione Ospedale Maggiore Policlinico Mangiagalli e Regina Elena, Milano Valeria Magarotto Divisione Universitaria di Ematologia, Azienda Ospedaliero-Universitaria S. Giovanni Battista di Torino, Ospedale Molinette, Torino Pier Mannuccio Mannucci Direttore Scientifico, IRCCS Fondazione Ca Granda Ospedale Maggiore Policlinico, Milano Francesca R. Mauro Divisione di Ematologia, Dipartimento di Biotecnologie Cellulari ed Ematologia, Università Sapienza di Roma

5 EDITOR E AUTORI V Roberto Mina Divisione Universitaria di Ematologia, Azienda Ospedaliero-Universitaria S. Giovanni Battista di Torino, Ospedale Molinette, Torino Antonio Palumbo Divisione Universitaria di Ematologia, Azienda Ospedaliero-Universitaria S. Giovanni Battista di Torino, Ospedale Molinette, Torino Fabrizio Pane Unità di Ematologia e Trapianti di Midollo, Azienda Ospedaliera Universitaria, Università degli Studi Federico II, Napoli Flora Peyvandi Centro Emofilia e Trombosi A. Bianchi Bonomi, Fondazione IRCCS Ca Granda Ospedale Maggiore Policlinico, Dipartimento di Patofisiologia e dei Trapianti, Università degli Studi di Milano e Fondazione Luigi Villa, Milano Gian Marco Podda Unità di Medicina III - Ematologia e Trombosi, Azienda Ospedaliera San Paolo, Università degli Studi di Milano Enrico M. Pogliani Divisione di Ematologia e Unità Trapianto di Midollo Osseo, Ospedale San Gerardo, Università Milano- Bicocca, Monza Raffaella Rossio Fondazione IRCCS Ca Granda Ospedale Maggiore Policlinico, Milano Mariangela Scavone Unità di Medicina III - Ematologia e Trombosi, Azienda Ospedaliera San Paolo, Università degli Studi di Milano Luca Tagliabue Unità di Medicina Nucleare, Azienda Ospedaliera San Paolo, Università degli Studi di Milano Lilj Uziel Azienda Ospedaliera San Paolo, Università degli Studi di Milano Antonella Vitale Divisione di Ematologia, Dipartimento di Biotecnologie Cellulari ed Ematologia, Università Sapienza di Roma

6 ai miei figli Matteo, Chiara e Giulia Paolo Corradini

7 PrefazIOne Questo volume è stato redatto pensando espressamente agli studenti del corso di laurea in Medicina e Chirurgia e a quelli del corso di Laurea in Biotecnologie, che si cimentano in modo specifico con l ematologia. Quindi non un altro libro di ematologia, ma un manuale per studenti che fornisca loro le informazioni necessarie per affrontare in modo esauriente questa complessa, articolata e sempre più affascinante disciplina. Per cercare di spiegare il fascino dell ematologia ricordiamo alcuni tra i molti capisaldi che ormai fanno parte della storia della medicina, con particolare attenzione per gli avanzamenti ottenuti nel campo delle neoplasie ematologiche, che in tempi passati erano sinonimo di prognosi infausta. Il trapianto allogenico di midollo osseo, ora più propriamente definito di cellule staminali ematopoietiche, ha portato alla consegna del premio Nobel per la medicina a Donnall Thomas (Seattle) nel Il trapianto allogenico si è sempre più diffuso in ematologia, per le patologie neoplastiche, l aplasia midollare, le emoglobinopatie (un esempio per tutte: la talassemia). La ricerca ha permesso negli ultimi anni di estendere tale procedura anche a donatori parzialmente incompatibili. La scoperta, lo sviluppo e l utilizzo clinico dei fattori di crescita. Due su tutti hanno avuto un fondamentale impatto in ematologia: il G-CSF e l eritropoietina. Lo sviluppo del G-CSF ha rivoluzionato i trapianti e permesso il recupero di cellule staminali (CD34+) nel sangue periferico. Oggigiorno quasi tutti i trapianti autologhi vengono effettuati utilizzando cellule staminali periferiche e la stessa opzione è offerta anche ai donatori allogenici. La dimostrazione che il sangue di cordone ombelicale è ricco di cellule staminali. Queste ricerche hanno portato all uso del sangue cordonale per il trapianto di cellule staminali e allo sviluppo delle banche di cordone. I continui miglioramenti nella cura delle leucemie linfoblastiche acute del bambino, che oggi guariscono nel 75-80% dei casi. La prognosi progressivamente migliorata nei linfomi di Hodgkin con guarigioni nell ordine dell 80% dei casi. La dimostrazione dell efficacia dell interferone alpha (IFN) in oncologia nasce dai risultati ottenuti in un raro disordine linfoproliferativo a cellule B, la hairy cell leukemia. Ciò ha cambiato la storia naturale di questa malattia e anche la storia dell IFN in medicina. La dimostrazione del difetto specifico associato alla leucemia acuta promielocitica e la prima applicazione di una terapia specifica ( intelligente ) mirata a correggere il difetto in oncologia. Attraverso tale strategia è cambiata la storia naturale dei pazienti affetti da questa patologia, che oggi rappresenta il sottogruppo di leucemie acute a prognosi più favorevole. La scoperta nel 1960 del cromosoma Ph (Philadelphia) in casi di leucemia mieloide cronica (LMC) ha aperto una nuova epoca nella medicina contemporanea rappresentando la prima anomalia cromosomica associata a una neoplasia. Ciò ha aperto la strada all identificazione in cellule di LMC del gene di fusione BCR-ABL e della sua relativa proteina. Queste scoperte hanno condotto negli anni a identificare sempre più frequentemente alterazioni genetiche nelle neoplasie ematologiche permettendo nuove e più precise classificazioni, il monitoraggio della malattia e lo sviluppo di terapie mirate. Proprio per il trattamento di pazienti con LMC sono stati sviluppati inibitori delle tirosino-chinasi (TK) di 1, 2 e 3 generazione (imatinib, dasatinib, nilotinib, bosutinib, ponatinib) che hanno radicalmente cambiato la cura e la prognosi di questa malattia. Un altro esempio di terapia specifica in ematologia che deriva dalle acquisizioni della ricerca.

8 VIII MANUALE DI EMATOLOGIA Questo stesso approccio è stato esteso con grande successo ai pazienti affetti da leucemia acuta linfoblastica (LAL) Ph+ presente nei bambini, negli adulti e negli anziani, con percentuali crescenti e che prima dell avvento degli inibitori delle TK rappresentava in assoluto la neoplasia ematologica a prognosi più sfavorevole. Con gli inibitori oggi si raggiunge una remissione completa praticamente in tutti i casi. Lo sviluppo della tecnologia per produrre anticorpi monoclonali (premio Nobel per la medicina a G. Kohler e C. Milstein nel 1984) ha rivoluzionato le strategie diagnostiche in ematologia, permettendo altresì di monitorare la malattia minima durante il decorso clinico. Infine, sono stati sviluppati anticorpi monoclonali umanizzati per uso clinico che hanno profondamente modificato la terapia di diverse patologie. Ricordiamo la strategia combinata di chemio-immunoterapia per i linfomi non-hodgkin a cellule B, oggi diventata la terapia standard, l uso di anticorpi monoclonali in patologie quali la trombocitopenia autoimmune e l emoglobinuria parossistica notturna (un altro esempio di terapia mirata), e l utilizzo di diversi anticorpi monoclonali nel trattamento della leucemia linfatica cronica (LLC). La disponibilità di un vasto armamentario terapeutico oggi per due patologie importanti e in aumento la LLC e il mieloma multiplo per le quali per diversi lustri gli unici farmaci attivi erano praticamente solo due agenti alchilanti, il clorambucile per la LLC e il melfalan per il mieloma. Ciò ha rivoluzionato l approccio terapeutico per queste malattie. Lo studio del profilo genomico e l utilizzo del sequenziamento rapido di ampie aree del genoma ha visto applicazioni importanti in ematologia più che in ogni altra disciplina medica, aprendo nuove strade classificative, prognostiche e di individuazione di nuovi bersagli per terapie molecolari. Un esempio recente sono le mutazioni di BRAF nella hairy cell leukemia. Lo sviluppo di farmaci diretti verso il signaling pathway del B-cell receptor, quali ibrutinib e idelalisib stanno modificando il nostro approccio terapeutico verso alcuni disordini linfoproliferativi cronici B, in primis la LLC. Questi sono solo alcuni tra i tanti esempi che si potevano fare per illustrare quali sono stati e quali sono gli avanzamenti in ematologia osservati negli anni. Non si può non ricordare agli studenti come l ematologia, più forse di tante altre discipline, è materia che coniuga costantemente il laboratorio con la clinica. Non si può fare una buona ematologia oggi senza il supporto di molti laboratori integrati che garantiscano diagnosi rapide e precise, accurate stratificazioni prognostiche, l implementazione di terapie specifiche (impossibili senza l ausilio del laboratorio), il monitoraggio della malattia minima residua, ecc. A ciò consegue che il costante progredire delle tecnologie si traduce in un progressivo raffinamento delle tecniche utilizzate in ematologia, un miglioramento delle conoscenze, nuovi farmaci e biofarmaci diretti non solo verso il clone neoplastico, ma anche verso le cellule accessorie, il microambiente, ecc. La cosiddetta ricerca traslazionale (from the bench to the bedside) è in ematologia una realtà da molti anni e i tempi di trasferimento dal laboratorio alla clinica sono sempre più rapidi. Ciò sta progressivamente conducendo a terapie sempre più personalizzate sulla base delle caratteristiche biologiche e cliniche non solo delle diverse patologie, ma anche di sottogruppi di pazienti nell ambito di una determinata patologia. Un esempio su tutti è rappresentato dalla possibilità oggi di decidere se continuare, sospendere o modificare la terapia alla luce della presenza, assenza o quantificazione della malattia residua minima sulla base di tecniche citofluorimetriche e molecolari. Questo volume è stato reso possibile grazie all impegno di molti colleghi e amici, tutte persone che nei loro specifici campi di interesse sono personalità riconosciute a livello internazionale. Non si può infatti non sottolineare come l ematologia italiana brilli di luce propria nel contesto internazionale. Molte delle realizzazioni riportate sopra hanno visto gli ematologi italiani come assoluti protagonisti, e molti sono tra gli autori di questo volume. A tutti loro, e ai loro collaboratori, che hanno seguito le istruzioni intese a realizzare un testo quanto più possibile uniforme e armonico va quindi il nostro più sentito apprezzamento e ringraziamento. Il nostro desiderio è che gli studenti possano apprezzare fin dal loro primo impatto la profondità dell ematologia nelle sue diverse componenti cliniche e biologiche. Abbiamo cercato di limitare la trattazione ai concetti che uno studente di medicina e di biotecnologie dovrebbe conoscere. Abbiamo voluto altresì aggiungere degli approfondimenti su punti specifici di particolare interesse. L ultima speranza è che molti studenti, ematologi potenziali, possano desiderare di perseguire una carriera ematologica e contribuire a un futuro sempre luminoso del nostro Paese nel panorama dell ematologia internazionale. Paol o Corradini Robin F oà

9 INDICE IX INDICE EDITOR E AUTORI...III PREFAZIONE...VII 1. FISIOLOGIA DELL EMOPOIESI...1 P. Corradini, C. Carniti 2. DIAGNOSTICA DI LABORATORIO IN EMATOLOGIA F. Pane 3. MICROARRAYS E TECNICHE DI NEXT GENERATION SEQUENCING (NGS) IN EMATOLOGIA S. Chiaretti, R. Foà 4. DIAGNOSTICA PER IMMAGINI IN EMATOLOGIA L. Tagliabue, L. Uziel 5. ANEMIE M.D. Cappellini 6. APLASIE MIDOLLARI P. Corradini 7. ALTERAZIONI QUANTITATIVE E QUALITATIVE DEI LEUCOCITI G. Lambertenghi Deliliers, C. Annaloro 8. LEUCEMIA MIELOIDE ACUTA A. Cortelezzi, N.S. Fracchiolla 9. LEUCEMIA ACUTA LINFOIDE R. Foà, A. Vitale 10. NEOPLASIE MIELOPROLIFERATIVE CRONICHE E.M. Pogliani, C. Gambacorti-Passerini, E.M. Elli Leucemia mieloide cronica (LMC) C. Gambacorti-Passerini Policitemia vera E.M. Pogliani, E.M. Elli Trombocitemia essenziale E.M. Pogliani, E.M. Elli Mielofibrosi con metaplasia mieloide E.M. Pogliani, E.M. Elli 11. SINDROMI IPEREOSINOFILE E.M. Pogliani, E.M. Elli 12. SINDROMI MIELODISPLASTICHE F. Pane 13. LINFOADENOPATIE P. Corradini, L. Farina 14. LINFOMI P. Corradini, C. Carniti, L. Farina Linfomi non-hodgkin Linfoma di Hodgkin MALATTIE LINFOPROLIFERATIVE CRONICHE LEUCEMICHE R. Foà, I. Del Giudice, F.R. Mauro 16. GAMMOPATIE MONOCLONALI M. Boccadoro, C. Cerrato, R. Mina, V. Magarotto, A. Palumbo Gammopatie monoclonali di incerto significato Mieloma multiplo Amiloidosi sistemica Macroglobulinemia di Waldenström P. Corradini, L. Farina Crioglobulinemie TRAPIANTO DI CELLULE STAMINALI EMOPOIETICHE P. Corradini 18. CELLULE STAMINALI EMOPOIETICHE E MEDICINA RIGENERATIVA C. Carlo-Stella

10 X MANUALE DI EMATOLOGIA 19. PATOLOGIA DELLE PIASTRINE M. Cattaneo, G.M. Podda, E.A. Femia, M. Scavone 20. MALATTIE EMORRAGICHE E TROMBOTICHE CONGENITE E ACQUISITE A.B. Federici, P.M. Mannucci, F. Peyvandi Malattie emorragiche congenite e acquisite A.B. Federici, P.M. Mannucci, F Peyvandi Trombofilie congenite e acquisite e principi di terapia antitrombotica A.B. Federici 21. MICROANGIOPATIE TROMBOTICHE F. Peyvandi, B. Ferrari, A. Cannavò, R. Rossio 22. EMOCOMPONENTI, EMODERIVATI, FATTORI RICOMBINANTI E MEDICINA TRASFUSIONALE P. Corradini, A.B. Federici 23. EMERGENZE E URGENZE IN EMATOLOGIA P. Corradini, L. Farina, A.B. Federici Indice ANALITICO RISPOSTE ALLE DOMANDE DI AUTOVALUTAZIONE...390

11 1 FISIOLOGIA DELL EMOPOIESI P. Corradini, C. Carniti INDICE Microambiente midollare... 1 Fattori di crescita emopoietici... 3 Eritropoiesi... 4 Granulocitopoiesi... 5 Piastrinopoiesi o trombocitopoiesi... 6 Monocitopoiesi... 7 Linfocitopoiesi... 7 Bibliografia... 9 Le cellule del sangue hanno una vita limitata in circolo e vengono continuamente rinnovate mediante il processo detto emopoiesi. Nel soggetto adulto l emopoiesi si realizza all interno del midollo osseo, con attività preponderante a livello di alcuni segmenti scheletrici: coste, sterno, ossa del bacino, scapole, cranio ed estremità prossimali del l omero e del femore. Nella vita intrauterina le prime cellule emopoietiche si osservano nel sacco vitellino poi, dal secondo mese, inizia l emopoiesi epatica e successivamente quella splenica che diviene preponderante fino al settimo mese. Tale processo avviene a partire da un unico tipo di cellula (cellula staminale emopoietica o progenitore pluripotente), che presenta da un lato la capacità di mantenersi in numero costante, dall altro quella di fornire elementi cellulari che, attraverso successivi processi di differenziazione e maturazione, daranno origine agli elementi maturi. Tutte le cellule del sangue derivano dalle cellule staminali emopoietiche che oltre a mantenere la loro popolazione possono produrre due tipi di cellule staminali emopoietiche pluripotenti: (colony-forming unit) CFU-S e CFU-Ly. Il tipo CFU-S è precursore della linea mieloide: eritrociti, granulociti, monociti e piastrine; il tipo CFU-Ly è precursore delle cellule della linea linfoide (cellule B e T). Le cellule progenitrici che derivano dalle CFU (colony-forming unit) sono unipotenti, cioè formano una sola linea cellulare. Le cellule precursori che derivano dalle progenitrici perdono la capacità di autoriprodursi. La proliferazione e la differenziazione della cellula staminale sono sotto la diretta influenza dei fattori di crescita emopoietici, ma dipendono anche dall interazione con le cellule stromali e le altre cellule che costituiscono il microambiente midollare. L emopoiesi cessa qualora il compartimento midollare venga depleto delle cellule staminali indifferenziate (Fig. 1.1). σσmicroambiente MIDOLLARE Le trabecole della spongiosa delimitano lacune midollari in cui si annidano i progenitori emopoietici. Il microambiente midollare è costituito da vari elementi. I sinusoidi midollari caratterizzati da cellule endoteliali prive di membrana basale, le cellule reticolari che fanno da sostegno ai sinusoidi, adipociti, fibre reticolari che formano l impalcatura e una matrice extracellulare costituita da collagene, proteine di adesione e proteoglicani. Nelle sezioni istologiche, gli elementi delle principali filiere midollari occupano uno spazio ben preciso rispetto alle trabecole ossee e rispetto ai sinusoidi. I precursori eritroidi si trovano in prossimità dei

12 2 MANUALE DI EMATOLOGIA σσfigura 1.1. Emopoiesi. sinusoidi, formando isolotti costituiti da un macrofago centrale e da eritroblasti disposti in modo centrifugo con gli elementi più maturi alla periferia. I megacariociti, occupano anch essi lo spazio parasinusoidale e con le loro propaggini citoplasmatiche, aggettano nel lume vasale per permettere la formazione delle piastrine. Le cellule mieloidi occupano lo spazio centrale delle lacune ossee, con i precursori più immaturi disposti in sede paratrabecolare e gli stadi intermedi localizzati in zona inter-sinusoidale. La capacità di raggiungere la circolazione sinusoidale è dovuta alla perdita di adesività alle cellule stromali e allo sviluppo della motilità di queste cellule. APPROFONDIMENTO La maggiore evidenza dell esistenza della cellula staminale pluripotente deriva da studi in vitro e modelli animali. Tali studi hanno mostrato la capacità rigenerativa del midollo e del sistema emopoietico, mediante l infusione di una determinata popolazione di cellule mononucleate dopo una completa mieloablazione: cellule staminali in coltura su agar crescono e si differenziano in 5-10 giorni, dando origine alle colonie emopoietiche; l infusione di una sospensione di cellule mononucleate midollari in topi letalmente irradiati, causa una proliferazione emopoietica nel midollo osseo e nella milza. Le nicchie emopoietiche Le cellule staminali risiedono in due nicchie differenti, la nicchia osteoblastica e la nicchia vascolare. In quella osteoblastica, le cellule staminali sono associate a un sottotipo di osteoblasti che rivestono la superficie interna delle cavità midollari. In quella vascolare, sono associate alla superficie delle cellule endoteliali che rivestono i sinusoidi del midollo osseo e della milza. Recentemente è stato dimostrato che le cellule reticolari ricche in CXCL12 (chemochina detta anche stromal derived factor-1 SDF-1) si trovano in stretta associazione con le cellule staminali in entrambe le nicchie e potrebbero servire come vie di transito per lo spostamento delle cellule staminali da una nicchia all altra. Le due nicchie sembrerebbero funzionalmente distinte: si pensa che quella osteoblastica mantenga le cellule staminali in fase di quiescenza per lungo tempo, mentre la nicchia vascolare manterrebbe le cellule staminali per un tempo breve e favorirebbe la proliferazione e la differenziazione nelle linee mieloide e megacariocitaria e la circolazione 1. L alterazione delle nicchie delle cellule staminali può portare allo sviluppo di patologie mieloproliferative 2, 3. L emopoiesi è mantenuta dalla cellula staminale che è in grado di dividersi e differenziarsi sotto l influenza di segnali intrinseci ed estrinseci, questi ultimi provenienti dal microambiente midollare. La regolazione del ciclo cellulare può modificare il destino della cellula staminale. Lo studio della proteina del

13 1 FISIOLOGIA DELL EMOPOIESI 3 ginariamente, sono state denominate CSFs (Colony Stimulating Factors). I CSF vengono distinti dal suffisso relativo al tipo di progenitore prevalentemente sensibile all azione della sostanza stessa. Ad esempio il GM-CSF (granulocyte-macrophage-csf) è in grado di stimolare la produzione delle CFU-GM (unità formanti colonie granulo-monocitarie), il G-CSF (granulocyte-csf) stimola le CFU-G (unità formanti colonie granulocitarie), il M-CSF (macrophage- CSF) stimola la crescita delle colonie monocitarie. L interleuchina-3 (IL-3) è in grado in vitro di stimolare la formazione di CFU-GM, BFU-E (unità formanti burst o macrocolonie eritroidi) e CFUMeg (unità formanti colonie megacariocitarie). I CFSs agiscono in maniera endocrina, paracrina, o autocrina. Questi fattori presentano una significativa ridondanza funzionale ed esibiscono un azione pleiotropica, svolgendo diverse funzioni biologiche su vari tessuti e cellule. La ridondanza funzionale dei fattori di crescita è indice del fatto che il sistema emopoietico possiede una certa flessibilità, indispensabile in situazioni di emergenza. In questi casi infatti una famiglia multigenica di citochine cooperanti e capaci di estendere la loro azione a vari livelli permette al sistema di mantenere una corretta funzionalità anche in condizioni non ottimali, sopperendo alla mancanza di un determinato fattore con la presenza di un altra molecola regolatrice. Un approccio sperimentale utile per chiarire il ruolo di questa eterogeneità è stato quello di sopprimere l azione di una specifica citochina attraverso l uso di anticorpi in grado di bloccarne l azione o mediante la generazione di animali portatori di delezione o inattivazione del gene corrispondente. I risultati di alcuni di questi esperimenti indicano, per esempio, che l iniezione di anticorpi anti-epo sopprime l eritropoiesi, suggerendo che l azione di tale molecola non sia ridondante. Sulla base di tali studi, le citochine possono essere classificate secondo il livello differenziativo delle loro cellule bersaglio in: fattori linea-non-specifici, che agiscono su precursori pluripotenti, quali interleuchina 3 (IL-3), GM-CSF (Granulocyte-Macrophage-Colony Stimulating Factor), G-CSF (Granulocyte-Colony Stimulating Factor) e interleuchina 4 (IL-4) che sostengono la proliferazione di progenitori multipotenti dopo la loro uscita dalla fase di quiescenza. IL-3 viene prodotta dai T-linfociti e non è un fattore linea-specifico in grado di stimolare la produzione e il rinnovamento del compartimento staminale pluripotente e di indurre la difretinoblastoma (RB), che svolge un ruolo centrale nella regolazione del ciclo cellulare, ha mostrato in modelli murini, che una diffusa inattivazione di RB, induce un importante stimolo mielo-proliferativo. Inoltre le cellule staminali vengono indotte alla mobilizzazione in sedi extramidollari dove proliferano e si differenziano. Questo fenotipo non è intrinseco alla cellula staminale, ma è il risultato di una interazione RB-dipendente tra le cellule mieloidi e il microambiente midollare. La mieloproliferazione non si osserva se si riproduce l inattivazione di RB nella cellula staminale che viene però mantenuta in un microambiente wild-type, così come non si verifica trapiantando cellule staminali normali in un microambiente RB-depleto. Questo dimostra che la mieloproliferazione può derivare da una alterata interazione tra la cellula staminale e la nicchia emopoietica e che RB è un regolatore essenziale di tali interazioni. La perdita di RB nel microambiente e nelle cellule mieloidi determina la distruzione della nicchia osteoblastica da parte degli osteoclasti. Le cellule staminali vengono spiazzate dalla loro nicchia omeostatica e vanno incontro a mobilizzazione verso la milza e a proliferazione in loco, determinando una patologia mieloproliferativa. σσfattori DI CRESCITA EMOPOIETICI I fattori di crescita emopoietici sono un gruppo eterogeneo di citochine che stimolano i progenitori cellulari del sistema emopoietico e inducono proliferazione e differenziazione. Nella maggior parte dei casi sono glicoproteine a basso peso molecolare sintetizzate ed elaborate da varie cellule nel microambiente midollare (a eccezione dell eritropoietina che è prodotta dal rene). Si legano a specifici recettori di membrana sulla superficie delle cellule del sistema emopoietico e svolgono un ruolo chiave nella regolazione delle cellule emopoietiche sia in condizioni fisiologiche che patologiche. Questi sono stati identificati principalmente utilizzando sistemi di coltura in vitro che costituiscono un sistema adatto a chiarire il processo di formazione delle cellule del sangue e nello stesso tempo utile a comprendere i meccanismi e la regolazione della differenziazione ematopoietica. Le cellule ematopoietiche non sono in grado di sopravvivere in coltura in assenza di stimoli che possono essere prodotti da cellule di supporto o che sono presenti nel terreno di coltura. Lo sviluppo di metodiche di coltura in mezzo semisolido (agar o metilcellulosa) ha consentito l identificazione degli induttori richiesti per la proliferazione e differenziazione di precursori ematopoietici capaci di formare colonie. La caratterizzazione di tali molecole è avvenuta in base al tipo di colonie che si sviluppano in vitro sotto la loro azione: per questo motivo, ori-

14 4 MANUALE DI EMATOLOGIA ferenziazione verso tutte le linee mieloidi. La sua azione è sinergica a quella del GM-CSF e del M- CSF. Il gene che codifica per IL-3 è localizzato sul cromosoma 5(q23-31). GM-CSF viene sintetizzato e secreto da varie cellule del microambiente midollare: cellule stromali, fibroblasti, linfociti-t e cellule endoteliali. Questo fattore stimola la crescita dei progenitori per i granulociti, monociti, eritrociti ed eosinofili. Inoltre attiva i granulociti, i monociti e i macrofagi e promuove la fagocitosi. Il gene che codifica per questo fattore è localizzato sul braccio lungo del cromosoma 5. G-CSF è una potente citochina che stimola la proliferazione e maturazione dei precursori granulocitari. È prodotta da cellule stromali, monociti e macrofagi e cellule endoteliali. Il gene che codifica per questo fattore è localizzato sul cromosoma 17(q11-21). IL-4 deriva dai linfociti T attivati e dalle mast-cells. Il principale effetto è l induzione della proliferazione e differenziazione dei linfociti e dell espressione degli antigeni di classe II del complesso maggiore di istocompatibilità (MHC) sui linfociti B quiescenti. IL-4 può inoltre agire sui linfociti T, monociti, macrofagi, mast-cells, fibroblasti e cellule endoteliali; fattori specifici per una linea maturativa, capaci di commissionare cellule unipotenti già commissionate, come eritropoietina (Epo), M-CSF (Macrophage-Colony Stimulating Factor) e l interleuchina 5 (IL-5). Epo è un regolatore fisiologico dell eritropoiesi che viene sintetizzata dalle cellule peritubulari del rene in risposta all ipossiemia. Il gene che codifica per questa glicoproteina è localizzato sul cromosoma 7 (q11-22). Circa il 10% dell eritropoietina endogena è secreta dal fegato. M-CSF è un fattore di crescita specifico della linea monocito/macrofagica ed è secreto dalle cellule stromali, dai macrofagi e dai fibroblasti. È una glicoproteina molto glicosilata, è in forma dimerica e il gene che la codifica è localizzato sul cromosoma 5(q33). È un potente stimolatore dell attivazione e attività dei macrofagi. Induce un incremento dell espressione degli antigeni di classe II del MHC sui macrofagi e promuove la citotossicità. IL-5 è unicamente un fattore di differenziazione selettivo per gli eosinofili ed entro questi limiti mima l azione del GM-CSF e dell IL-3. La proteina, di kd, forma un omodimero biologicamente attivo e viene prodotta in seguito ad attivazione da parte dei linfociti Th0 e Th2 e in maniera autocrina dai granulociti eosinofili. L effetto pro-eosinofilo dell IL-5 si esercita solo su elementi precursori in avanzato stadio maturativo conseguito per azione della IL-3 e del GM-CSF; fattori che inducono il reclutamento nel ciclo cellulare di progenitori primitivi cineticamente e funzionalmente inerti come interleuchina 6, (IL-6), 11 (IL-11), 12 (IL-12) e SCF (stem cell factor) che sostengono la formazione di colonie a partire da progenitori ematopoietici in quiescenza. IL-11 è un fattore che incrementa il numero, le dimensioni e la ploidia delle colonie megacariocitarie, in vitro. Ha un effetto sinergico con IL-3 e IL-4 nelle fasi precoci dell emopoiesi e con la trombopoietina inducendo la proliferazione e la maturazione dei megacariociti. Tutti i fattori di crescita danno avvio alla trasduzione del segnale, attivando fattori di trascrizione che a loro volta attivano geni che determinano il differenziamento delle cellule del sangue. Sono stati isolati numerosi fattori di trascrizione che regolano la differenziazione lungo le linee cellulari più importanti tra cui: PU1 avvia il differenziamento mieloide; GATA-1 ha un ruolo essenziale nel differenziamento eritropoietico e magacariocitico mentre Ikaros, Ailos e Helios svolgono un ruolo importante nello sviluppo linfatico. I fattori di trascrizione rappresentano un punto nodale del controllo dell emopoiesi ed eventuali aberrazioni di tale stato di funzionamento sono alla base di molte malattie tra cui leucemie e linfomi. La perturbazione dell espressione dei fattori di trascrizione può tradursi in alterazioni dell attività proliferativa e differenziativa delle cellule ematopoietiche producendo serie conseguenze per il sistema sanguigno. σσeritropoiesi L eritrocita maturo deriva dalla cellula staminale che si differenzia nelle cellule formanti colonie eritroidi e poi nel pro-eritroblasto che è il precursore eritroide più precoce che si riesca a riconoscere nel midollo osseo. È una cellula di grossa taglia con citoplasma basofilo e un nucleo ampio. Nel processo di maturazione il nucleo diventa più denso e più piccolo e alla fine viene estruso dalla cellula, la cellula diventa più piccola e il citoplasma diventa più eosinofilo, per la crescente quantità di emoglobina sintetizzata dai ribosomi. Negli stadi intermedi di maturazione il citoplasma diviene policromatofilo, per la presenza di proteine citoplasmatiche basofile insieme con l emoglobina. Nelle fasi più mature, invece il citoplasma diventa interamente eosinofi-

15 1 FISIOLOGIA DELL EMOPOIESI 5 lo. Nello stadio finale di maturazione, eritroblasto ortocromatico, l emoglobina è abbondante, nel citoplasma ci sono pochi ribosomi e mitocondri, il nucleo è piccolo con cromatina molto addensata. Quando il nucleo viene estruso, la cellula diviene un reticolocita, che è la fase che precede l eritrocita maturo. I reticolociti rimangono circa 1 o 2 giorni nel midollo prima di essere rilasciati in circolo. Gli eritrociti maturi hanno una emivita in circolo di circa 120 giorni. La differenziazione eritroide nel midollo richiede, in condizioni fisiologiche circa 5-7 giorni. Solo gli stadi precoci e intermedi possiedono la capacità mitotica (proeritroblasto, eritroblasto basofilo, eritroblasto policromatofilo). In condizioni fisiologiche, la linea eritroide occupa nel midollo circa il 25% della cellularità totale (Fig. 1.2). σσgranulocitopoiesi La cellula staminale a indirizzo mieloide si differenzia in tre tipi di cellule granulocitarie: neutrofili, eosinofili, basofili. Gli stadi di maturazione della linea neutrofila, eosinofila e basofila sono simili. Per i neutrofili gli stadi maturativi sono i seguenti: mieloblasto: la cellula mieloide più precoce riconoscibile nel midollo osseo. È una cellula di grossa taglia con un nucleo di grosse dimensioni; promielocita: caratterizzato da un nucleo eccentrico, talora con nucleoli evidenti e numerosi granuli citoplasmatici azzurrofili (granuli primari che contengono molti enzimi); mielocita: di dimensioni inferiori, nucleo centrale, presenza di una doppia popolazione di granuli, sia quelli azzurrofili che eosinofili (secondari che contengono numerose sostanze battericide); metamielocita: i granuli secondari diventano prevalenti, il nucleo diviene indentato; neutrofilo: abbondante citoplasma con granuli secondari prevalenti, nucleo polilobato. Il neutrofilo va incontro a numerosi cambiamenti sia fisici che funzionali, acquisendo la capacità di adesione, la motilità e la capacità fagocitica. Una volta dismesso in circolo, il granulocita maturo ha una emivita di circa 8-12 ore. Molti granulociti neutrofili rimangono adesi all endotelio vasale (compartimento marginato), altri, mediante il processo di diapedesi attraverso la parete vasale, vanno a localizzarsi nei tessuti (pool tissutale) svolgendo una σσfigura 1.2. Eritropoiesi.

16 6 MANUALE DI EMATOLOGIA importante attività fagocitica e nella risposta infiammatoria. Infine una piccola percentuale dei neutrofili rimane nel midollo (pool di scorta midollare). Il processo di maturazione dalla cellula staminale mieloide al neutrofilo maturo richiede circa 10 giorni. Solo gli elementi più immaturi hanno capacità mitotiche, mentre dal metamielocita in poi la mitosi non è più possibile. Le cellule mieloidi costituiscono circa il 40-80% della cellularità midollare (Fig. 1.3). σσpiastrinopoiesi O TROMBOCITOPOIESI I megacariociti sono le cellule midollari specializzate nella produzione delle piastrine. Derivano da un precursore mieloide. Le piastrine sono frammenti citoplasmatici dei megacariociti e come tali non possono essere considerate elementi cellulari. La maturazione dei megacariociti avviene in tre stadi: stadio basofilo (megacarioblasto): citoplasma basofilo privo di granulazioni, nucleo unico o bilobato; stadio granulare (pro-megacariocita): il nucleo è polilobato e il citoplasma è più eosinofilo e presenta fini granulazioni; stadio maturo o fase piastrinopoietica: in questa fase il megacariocita è una cellule di grossa taglia, citoplasma abbondante e granulare che si frammenta alla periferia, il nucleo è polilobato e presenta da 16 a 32 lobature. Il megacarioblasto non è capace di dividersi, e la maturazione del nucleo e del citoplasma possono non procedere parallelamente. Diversi sono i fattori di crescita coinvolti, tra questi la trombopoietina e IL-11 che agisce in sinergia con IL-3 negli stadi più precoci e con la trombopoietina nelle fasi più avanzate nell indurre l aumento della ploidia e la maturazione dei megacariociti. I megacariociti possono aumentare di numero nel midollo osseo qualora si verifichi un consumo periferico delle piastrine (per sequestro o distruzione). Ogni megacariocita è in grado di produrre migliaia di piastrine da un unico processo di frammentazione citoplasmatica. Le piastrine dismesse in circolo hanno una emivita di 8-10 giorni. La piastrinopoiesi midollare richiede circa 8-10 giorni in condizioni fisiologiche (Fig. 1.4). σσfigura 1.3. Granulocitopoiesi neutrofila.

17 1 FISIOLOGIA DELL EMOPOIESI 7 σσfigura 1.4. Piastrinopoiesi. σσmonocitopoiesi I monociti sono prodotti nel midollo osseo a partire da precursori staminali (CFU-GM) comuni anche alla linea granulocitaria. Le fasi maturative che si riconoscono nel midollo sono: monoblasto; promonocita; monocita maturo. La monocitopoiesi midollare richiede circa 2,5 giorni in condizioni fisiologiche. I monociti circolanti hanno una emivita di circa 8-9 ore, mentre i macrofagi rimangono nei tessuti per mesi. Fattori di crescita rilevanti per la monocitopoiesi sono IL- 3, GM-CSF e M-CSF, mentre IL-10 è un potente inibitore dell attività macrofagica ed esercita un controllo negativo sull espressione degli antigeni del MHC dei macrofagi (Fig. 1.5). σσlinfocitopoiesi I linfociti derivano da una cellula staminale indirizzata verso la linea linfoide che origina dalla cellula staminale pluripotente. Una volta differenziata verso la linea linfoide, questa cellula dà origine alle due maggiori classi di linfociti: i linfociti B e i linfociti T, che costituiscono due sottogruppi distinti con funzioni diverse. Sebbene non sia possibile distinguere morfologicamente, al microscopio ottico, le due sottopopolazioni, è tuttavia possibile seguirne la differenziazione e la maturazione mediante l identificazione di marcatori di superficie. Linfociti B I linfociti B devono il loro nome alla somiglianza funzionale con i linfociti che maturano in un organo specializzato negli uccelli, detto Borsa di Fabrizio. La cellula staminale che migra in questa sede ectopica prolifera e matura in cellule capaci di produrre anticorpi. L analogo della Borsa di Fabrizio per gli essere umani è il midollo osseo o il fegato fetale. La differenziazione in linfociti B maturi implica un complesso riarrangiamento genico. L espressione e la modificazione dei geni che codificano per le catene pesanti e leggere è fondamentale per la produzione delle immunoglobuline. La maturazione culmina con la migrazione dei linfociti B agli organi linfatici o ai tessuti linfoidi (milza,

18 8 MANUALE DI EMATOLOGIA σσfigura 1.5. Monocitopoiesi. linfonodi, tonsille, intestino, fegato), dove possono rimanere o da cui possono ricircolare liberamente nella linfa o nel sangue. Quando antigenicamente stimolati, i linfociti B aumentano di volume e diventano metabolicamente attivi e vanno incontro a trasformazione blastica che culmina nella divisione mitotica. Le cellule linfoblastoidi divengono sempre più efficienti nella produzione e secrezione degli anticorpi e spesso si differenziano in cellule altamente specializzate nella produzione di immunoglobuline, dette plasmacellule. Le plasmacellule sono presenti nel midollo osseo, negli organi linfoidi e nei siti in cui si verifica la risposta immunitaria, mentre normalmente non circolano nel sangue e nella linfa. I linfociti B e le plasmacellule sono le uniche cellule in grado di produrre immunoglobuline. Cloni di linfociti B e plasmacellule possono espandersi o ridursi sotto l azione dei fattori che regolano la risposta immunitaria. Linfociti T I linfociti T sono così chiamati per la loro dipendenza dal timo per la loro maturazione e specializzazione. I linfociti T rappresentano circa il 60-70% dei linfociti circolanti. Sono in grado di spostarsi liberamente dal sangue agli organi linfatici e di ritornare al sangue attraverso la linfa. I linfociti T non producono immunoglobuline, ma secernono proteine od ormoni detti citochine in grado di promuovere o sopprimere l attivazione di altri linfociti T, dei linfociti B e dei macrofagi. Costituiscono la parte principale della risposta immunitaria cellulomediata e coordinano la risposta immune. Alcune cellule staminali già indirizzate in senso linfoide migrano nel timo, dove si verificherà la differenziazione e la maturazione. Le cellule commissionate linfoidi attraversano la corticale timica entrando in contatto con le cellule epiteliali. Attraverso questo microambiente unico, i timociti perdono e acquisiscono antigeni di superficie. La fase finale della differenziazione porta alla generazione delle due maggiori sottoclassi di linfociti T: linfociti T helper (esprimono l antigene CD4) e linfociti T suppressor (esprimono l antigene CD8) che vengono dismessi nella circolazione sanguigna e linfatica. Il loro ruolo principale è la regolazione e la modulazione della risposta immunitaria.

19 1 FISIOLOGIA DELL EMOPOIESI 9 Linfociti non-b e non-t Costituiscono una piccola percentuale dei linfociti circolanti, non hanno la capacità di produrre immunoglobuline e non hanno il pattern antigenico che li renda timo-dipendenti per la maturazione. Hanno dimensioni leggermente maggiori dei linfociti B e T, ampio citoplasma chiaro e granulazioni citoplasmatiche. Il loro ruolo immunologico è legato alla capacità di lisare cellule infettate da virus e cellule tumorali mediante un meccanismo anticorpo-mediato, in assenza di evidente stimolo antigenico. Queste cellule vengono chiamate natural killer (NK). σσbibliografia 1. Perry JM, Li L. Disrupting the stem cell niche: good seeds in bad soil. Cell 2007;129(6): Walkley CR, Olsen GH, Dworkin S et al. A microenvironment-induced myeloproliferative syndrome caused by retinoic acid receptor gamma deficiency. Cell 2007;129(6): Walkley CR, Shea JM, Sims NA et al. Rb regulates interactions between hematopoietic stem cells and their bone marrow microenvironment. Cell 2007;129(6): Fey MF. Normal and malignant hematopoiesis. Ann Oncol 2007;18 Suppl 1:i9-i13. DOMANDE DI AUTOVALUTAZIONE 1) I globuli rossi: a) sono elementi cellulari dotati di nucleo e organuli citoplasmatici b) derivano da una cellula staminale chiamata reticolocita c) sopravvivono in circolo 7 giorni d) hanno una emivita di circa 120 giorni 2) I fattori di crescita che stimolano l emopoiesi: a) sono tutti prodotti a livello midollare b) sono tutti linea specifici c) sono tutti disponibili come farmaci per stimolare l emopoesi nei pazienti pancitopenici d) inducono la proliferazione la maturazione delle varie linee midollari 3) Qual è il fattore di crescita specifico per la maturazione granulocitaria? a) G-CSF b) M-CSF c) eritropoietina d) trombopoietina 4) I linfociti T: a) derivano da una cellula staminale distinta rispetto ai linfociti B b) contribuiscono alla risposta immunitaria con la produzione di anticorpi c) si distinguono in T-helper e T-suppressor d) possono essere distinti dai linfociti B con la semplice osservazione al microscopio ottico