UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI CAGLIARI APPROCCI GENETICI E FUNZIONALI NELLO STUDIO DELLE LEUCEMIE LINFOBLASTICHE ACUTE (LLA)
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1 UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI CAGLIARI FACOLTÀ DI SCIENZE MATEMATICHE, FISICHE E NATURALI CORSO DI LAUREA SPECIALISTICA IN BIOLOGIA SPERIMENTALE E APPLICATA DIPARTIMENTO DI BIOLOGIA SPERIMENTALE BERNARDO LODDO SEZIONE DI ANTROPOLOGIA APPROCCI GENETICI E FUNZIONALI NELLO STUDIO DELLE LEUCEMIE LINFOBLASTICHE ACUTE (LLA) Relatori: Dr.ssa Carla Maria Calò Prof.ssa Maria Grazia Ennas Tesi di Laurea di Maria Liliana Piredda ANNO ACCADEMICO
2 1.INTRODUZIONE 1.1 Cellule staminali, cellule progenitrici e precursori cellulari Tutte le cellule del sangue derivano da cellule staminali emopoietiche pluripotenti (PHSC), che rappresentano circa lo 0,1% delle cellule nucleate del midollo osseo. Queste di solito sono quiescenti, ma possono andare incontro ad attività mitotica, producendo sia altre cellule pluripotenti che due tipi di cellule staminali emopoietiche multipotenti. Queste due popolazioni sono responsabili della formazione delle varie cellule progenitrici Una di queste, detta colony-forming unit-s (CFU-S) è precursore delle cellule della linea mieloide (eritrociti, granulociti, monociti e piastrine), mentre l altra detta colony-forming unit-ly (CFU-Ly) è precursore delle cellule della linea linfoide (cellule B e T). Le cellule staminali del midollo osseo si trovano generalmente nello stadio G0 del ciclo cellulare, ma possono essere guidate nello stadio G1 da molti fattori di crescita e citochine. L emopoiesi infatti è regolata da numerosi fattori di crescita prodotti da vari tipi cellulari. Ogni singolo fattore di crescita agisce su una particolare cellula staminale o progenitrice o precursore e ne induce la proliferazione o la differenziazione o ambedue i processi. Le cellule più immature di entrambe le serie vengono dette blasti ed in condizioni normali sono meno del 5 % di tutte le cellule midollari. (Gartner L.P. et al., 2004) 1.2 Le malattie linfo-mieloproliferative Le malattie Linfo-Mieloproliferative rappresentano un gruppo eterogeneo di patologie caratterizzato dall espansione clonale di cellule ematopoietiche (linfoidi o non-linfoidi) a livello del midollo osseo, degli organi linfoidi secondari o in sedi extranodali. Si distinguono forme solide (linfomi), circa 10 volte più frequenti, e forme midollari/ematiche (leucemie), sia linfoidi che non-linfoidi (c.d. mieloidi)(larizza et al., 1991) (fig.1)
3 1.3 Le leucemie Le leucemie costituiscono un ampio ed eterogeneo gruppo di neoplasie maligne del tessuto emolinfopoietico che hanno origine da una cellula staminale non ancora orientata o in precursori orientati in senso mieloide o linfoide (Widman et al., 2002). La trasformazione neoplastica altera i meccanismi che regolano la proliferazione e la differenziazione della cellula staminale colpita (Cline MJ et al., 1994), la conseguenza è l origine di un clone neoplastico che si accumula primariamente nel midollo osseo e poi in altri organi e tessuti, caratterizzato da una proliferazione afinalistica e incontrollata tale da acquisire più o meno rapidamente una netta prevalenza numerica rispetto ai cloni normali (Mandelli F. et al., 1991). Nelle forme acute si osserva una perdita della capacità di differenziazione e alla proliferazione di blasti altamente immaturi, mentre nelle forme croniche si ha soprattutto un aumento numerico di cellule che presentano caratteristiche morfologiche e maturative simili alle cellule normali (Rabbits TH. et al., 1991). Quando le cellule interessate nel processo leuchemiogenico hanno caratteristiche fenotipiche (citologiche e molecolari) linfoidi si parla di leucemie linfoidi o sindromi linfoproliferative. Quando le cellule neoplastiche hanno caratteristiche fenotipiche mieloidi si parla di leucemie mieloidi. Le leucemie linfoidi, in grandissima maggioranza originano da cellule staminali la cui differenziazione è già stata determinata in senso linfoide, sia dal punto di vista biologico che dal punto di vista clinico. Una parte delle leucemie mieloidi invece origina dalla trasformazione neoplastica di una cellula staminale la cui - 2 -
4 differenziazione non è stata ancora determinata. Esse si chiamano ugualmente mieloproliferative perché la loro progenie è costituita prevalentemente da cellule neoplastiche con caratteristiche mieloidi; o da cellule staminali emolinfopoietiche. Questo spiega perché alcune sindromi mieloproliferative possano talora produrre cellule neoplastiche con fenotipo linfoide (un classico esempio è dato dalla leucemia mieloide cronica) e perché talune leucemie acute possono essere fenotipicamente ibride. (Sante Tura 1997). Sia le leucemie linfoidi che quelle mieloidi si distinguono a loro volta in sottotipi a seconda della linea (per esempio B o T, granulocitaria, eritroide o megacariocitica)o a seconda del grado di mutazione fenotipica espressa oltre che in termini morfologici e immunofenotipici anche in termini molecolari. Questo si verifica o perché le neoplasie hanno origine da cellule staminali che hanno una collocazione ontogenetica diversa, oppure dalla medesima cellula staminale che subisce diverse trasformazioni in senso neoplastico. Esistono, inoltre, casi meno frequenti in cui l espansione clonale leucemica presenta aspetti fenotipici promiscui, sia mieloidi che linfoidi, e si parla, pertanto, di leucemie ibride o bifenotipiche (Pui CH. et al., 1984; Lo Coco F. et al.,1991). 1.4 La classificazione delle Leucemie mieloidi acute (LMA) La classificazione delle LMA si basa su criteri morfologici mediante l osservazione microscopica di strisci di sangue periferico e di midollo osseo, e su criteri citochimici mediante l analisi di attività enzimatiche e/o presenza di particolari sostanze (mieloperossidasi, sudan nero, fosfatasi acida etc.) sui blasti leucemici
5 Tali criteri furono stabiliti nel 1976 e rivisti nel 1985 dal gruppo FAB (Gruppo Cooperatore Francese-Americano-Britannico) (Bennet JM. et al., 1976). Tale sistema, che prevede indagini relativamente semplici e facilmente riproducibili, ha trovato largo impiego in tutto il mondo ed ha permesso di superare preesistenti divergenze classificative, poiché consente una certa omogeneità di interpretazione. Secondo questo sistema di classificazione, per porre diagnosi di leucemia acuta mieloide, occorre che il numero di blasti mieloidi nel midollo sia più del 30%, con più del 3% positivi alla tecnica citochimica con Sudan Nero (SBB) od a quella per evidenziazione della Mieloperossidasi (MPO)(E-Oncology. 2004). Nel gruppo della LMA possono essere coinvolti vari tipi cellulari, così da poter distinguere in questa categoria 8 differenti sottotipi secondo al Classificazione FAB (Tab.1). M0 (indifererenziata): caratterizzata da blasti privi di granuli citoplasmatici e corpi di Auer. Le reazioni citochimiche convenziona convenzionali (MPO e SBB) risultano negative. Per la diagnosi deve essere rilevata la positività per uno o più marker mieloidi (antigeni CD13 e CD33)in almeno il 20% dei blasti leucemici. Non è associata ad alterazioni citogenetiche specifiche. Leucemia acuta M1: (senza maturazione) caratterizzata da blasti mieloidi senza segni di maturazione
6 Non sono presenti granuli citoplasmatici; la cromatina nucleare è fine. Per la diagnosi è necessario evidenziare la positività alla MPO ed al SBB in almeno il 30% dei blasti leucemici. La componente granulocitaria, con segni di maturazione, deve essere inferiore all 1%. Non è associata ad alterazioni citogenetiche specifiche. Leucemia acuta M2 con maturazione: caratterizzata da blasti mieloidi nei cui citoplasmi è possibile osservare granuli azzurrofili di Auer, ben evidenti i nucleoli. La componente monocitaria acuta con segni di maturazione è superiore al 10%; la componente monocitaria deve essere inferiore al 20%. Questi sottotipi si associano alla traslocazione traslocazione (8;21) [t(8;21)] con il coinvolgimento di geni AML/ETO, con una prognosi favorevole. Leucemia promielocitica acuta M3: la quasi totalità delle cellule leucemiche è costituita da promielociti atipici con citoplsma ricco di granulazioni azzurrofile e corpi di Auer (variante ipergranulare). Questo sottotipo è associato con altissima frequenza alla t (15;17) e al riarrangiamento genico PML/RAR con prognosi favorevole. Esiste una variante ipergranulare in cui i granuli non sono visibili alla microscopia ottica ma solo dimostrabili con la microscopia elettronica. L alterazione citogenetica è la stessa della variante ipergranulare. Leucemia acuta M4 (mielomonocitica): per la diagnosi di questa forma deve essere presente: una quota di blasti superiore al 20%, una componente granulocitaria - 5 -
7 midollare nei vari stadi differenziativi maggiore del 20% ed una componente monocitaria midollare non inferiore al 20%. La positività per la mieloperossidasi e la cloro-acetato-esterasi (esterasi non specifiche) viene riscontrata nella componente granulocitaria ed è presente nelle cellule monocitarie la netta positività all -naftil-acetato esterasi (ANAE). L inversione del cromosoma 16 (inv 16), con prognosi favorevole, si associa frequentemente ad una variante delle AML M4 eosinofilia. Gli eosinofili sono abnormi nel citoplasma. Leucemia Acuta M5a (monolitica scarsamente differenziata): le cellule monoblastiche devono costituire almeno l 80% delle cellule leucemiche; la componente granulocitaria, se presente, deve essere inferiore al 20% delle cellule leucemiche. I monoblasti sono negativi alle mieloperossidasi e positivi all ANAE. Questa forma non è associata ad alterazioni citogenetiche specifiche. Leucemia Acuta M5b leucemia monolitica con differenziazione: per la diagnosi è necessario che i monoblasti siano meno dell 80% della componente monocitaria. Leucemia Acuta M6 (eritroleucemia): è caratterizzata dalla coesistenza di blasti mieloidi ed eritroblasti abnormi nunericamente a livello del midollo osseo. I precursori eritroidi sono meno del 50% delle cellule; almeno il 30% delle cellule non eritroidi è costituito da mieloblasti; i precursori eritroidi sono displastici e PAS positivi. Le alterazioni citogenetiche sono estremamente variabili. Leucemia Acuta M7 (megacariocitaria): la diagnosi di questa forma leucemica è esclusivamente immunofenotipica: gli elementi blastici devono essere sempre - 6 -
Prof AM Vannucchi AA2009 10
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