La SELEZIONE DEGLI SPERMATOZOI ai fini della PMA (tecnica IMSI)
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- Rebecca Bernardini
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1 (tecnica IMSI) Policlinico di Modena DIPARTIMENTO INTEGRATO MATERNO INFANTILE Ginecologia ed Ostetricia Direttore Prof. Annibale Volpe UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI MODENA E REGGIO EMILIA D.Ssa Susanna Xella
2 Secondo l'organizzazione Mondiale della Sanità (O.M.S.) il 15-20% delle coppie è l'infertile: milioni di soggetti. 10% 30% Fattore Maschile Fattore Femminile 30% Fattore Idiopatico 30% Fattore di coppia
3 Anatomia dell apparato genitale maschile 1 2 La Capacitazione e la Reazione 3 acrosomiale avvengono nelle vie genitali femminili 2 1 Maturazione Epididimaria Gli spermatozoi che lasciano il testicolo acquisiscono la capacità fecondante nell epididimo dove avvengono modificazioni della membrana plasmatica dello spermatozoo. Processo Spermatogenetico: Spermatogonio-spermatozoo Proliferazione degli spermatogoni Meiosi Spermiogenesi (72 gg)
4 L analisi del liquido seminale -Spermiogramma con valutazione Morfologica -Spermiogramma con Capacitazione (secondo il WHO) -Test swelling ipo-osmotico (HOS) -CASA -Acrosome Reaction Assay -Analisi della cromatina (SCSA/TUNEL/Comet Assay) -Analisi delle delezioni del Cromosoma Y
5 Nomenclatura del liquido seminale WHO Volume ph Viscosità Zone di agglutinazione Concentrazione sp. Numero totale Motilità Morfologia Vitalità Globuli bianchi Fruttosio Fosfatasi acida Immunobead test MAR test > 2.0 ml normale assenti/rare > 20 x 10 6 per ml > 40 x 10 6 per eiaculato > 50% > 30% normal > 75% vivi < 1 x 10 6 per ml > 13 μmol per eiaculato > 200 U per eiaculato > 20%sperm con particelle < 10%sperm con particelle Classificazione Definizione Normospermia * Normale eiaculato Oligozoospermia * Concentrazione spermatica <20 x 10^6/ml Astenozoospermia * Spp con motilità totale <50% Teratozoospermia * Spp con morfologia normale < 30% Oligoastenoteratozoospermia * Alterazioni significative di tutti e tre i parametri (o combinazione di 2) Azoospermia * No spermatozoi nell eiaculato Aspermia * No eiaculato
6 1987 prima fertilizzazione di un ovocita umano mediante microiniezione di uno spermatozoo sotto la zona pellucida (SUZI) (LawsKing et al, Fertility and Sterility 48, 637) 1988 nascita del primo bambino mediante tecnica SUZI (Ng et al, Lancet 2, 790) 1992 nascita del primo bambino mediante iniezione intracitoplasmatica (ICSI) di uno spermatozoo nell ovocita (Palermo et al, Lancet 2, 17)
7 Distribuzione regionale dei Centri che applicano tecniche di PMA di II e III livello. Totale 199 centri (attivi 31 gennaio 2008) ISS/Rpma2007 ICSI VS FIVET 78% 22%
8 Indicazioni alla tecnica ICSI -Parametri del liquido seminale con valori di (oligo-asteno-teratospermia) Volume Concentrazione >1,0 ml % Motilità totale 0->20 % Motilità rapida 0->10 % Morfologia normale ,1-10x10 6 /ml -Precedenti fallimenti Fecondazione in Vitro Tradizionale (FIVET) -Pochi spermatozoi e di scarsa qualità congelati -Ostruzione delle vie seminali Gli spermatozoi possono essere ottenuti dall'epididimo (Microsurgical Epididymal Sperm Aspiration-MESA), o dal testicolo (Testicular Sperm Aspiration-TESA/E)
9 Rischi della tecnica ICSI? PRO 1995 Nagy et al., i parametri del liquido seminale non influenzano i risultati della ICSI (Hum Reprod. Aug;10(8): ) Svalander et al., i risultati della ICSI non sono direttamente correlati con i parametri del liquido seminale (Hum Reprod vol 10, n. 5, pp ) Svalander et al., i risultati della ICSI non sono correlati con stretti criteri di selezione morfologica degli spermatozoi (Hum Reprod vol 11, n. 5, pp ).
10 Rischi della tecnica ICSI? CONTRO 1998 Bonduelle et al., aumento significativo (0.83%) di aberrazioni cromosomiche in gravidanze ottenute mediante tecnica ICSI Erikson e Kallen, aumento del rischio di malformazioni congenite in ART rispetto al concepimento naturale (5.4% versus 3.8%) Bounduelle et al., non vi è una differenza significativa di incidenza di malformazioni congenite tra ICSI e FIVET (3.4% versus 3.8%) Devroey e Van Steirteghem dopo 10 anni di esperienza di ICSI, rischio di -incremento di aberrazioni cromosomiche de novo legate alla tecnica ma anche alla severità della patologia seminale -trasmissione di anomalie cromosomiche di tipo strutturale -trasmissione alla progenie di sesso maschile di problemi legati alla fertilità.
11 La selezione morfologica degli spermatozoi determina una maggiore percentuale di fertilizzazione degli ovociti anche se non sembra correlare con un miglior sviluppo embrionale.
12 E noto che nell eiaculato umano vi è una presenza, variabile, di spermatozoi che presentano anomalie che non sono evidenziabili con la tradizionale analisi del liquido seminale, tra le quali la frammentazione del DNA. (Lopes et al, 1998; Irvine et al, 2000; Zini et al, 2001). Decondensazione della cromatina Frammentazione della cromatina Associate con - incapacità di ottenere una gravidanza (sia attraverso il concepimento spontaneo che mediante la fecondazione in vitro) --elevata incidenza di aborti precoci. -(Hoshi et al, 1996; Hammadeh et al, 1998; Evenson et al, 1999; Host et al, 2000; Virant-Klun et al, 2002; Benchaib et al, 2003; Carrell et al, 2003; Henkel et al, 2003, 2004; Larson- Cook et al, 2003; Salehet al, 2003; Seli et al, 2004; Virro et al, 2004) Possono determinare malformazioni e patologie fetali (Hansen et al, 2002; Aitken et al, 2004)
13 SPERM DNA FRAGMENTATION a: spermatozoo con normale alone di dispersione della cromatina
14 Rischi legati alla frammentazione del DNA 2004 Tesarik et al., la frammentazione del DNA degli spermatozoi è correlata ad alterazioni tardive dello sviluppo embrionale (Hum Reprod vol 19, pp ) Tesarik et al., e successivamente nel 2008 Cohen-Bacrie et al., dimostrano l influenza del fattore paterno sullo sviluppo embrionale (Hum Reprod vol 10, pp ; J Gynecol Obstet Biol Reprod vol 37, Suppl 1:S4-8). La frammentazione del DNA degli spermatozoi, può influenzare lo sviluppo embrionale tardivo (effetto paterno tardivo)
15 QUALI ANALISI CI PERMETTONO DI VALUTARE GLI SPERMATOZOI? -Analisi ultramorfologica degli organelli subcellulari (microscopia a trasmissione o microscopia elettronica a scansione) (Berkovitz et al., 1999; Mitchell et al., 2006). -Analisi della stabilità cromosomica (FISH) (Calogero et al., 2001; Nagvenkar et al., 2006). -Analisi dell integrità nucleare (SCSA, Tunel assay, SCD test) (Larson et al., 2000; Fernandez et al., 2003; 2004; Greco et al., 2005a,b). QUESTE TECNICHE NON PERMETTONO UN ANALISI IN TEMPO REALE
16 QUALI ANALISI CI PERMETTONO DI SELEZIONARE MEDIANTE L ASPETTO MORFOLOGICO DEGLI SPERMATOZOI? In questa lettera Benjamin Bartoov dichiara la possibilità di effettuare la IMSI, cioè l iniezione intracitoplasmatica di uno spermatozoo morfologicamente selezionato, basata sull analisi sullo stato dalla morfologia degli organelli nucleari dello spermatozoo (MSOME) mediante l utilizzo di un microscopio ad alto ingrandimento (fino a 6600X). QUESTE TECNICHE PERMETTONO UN ANALISI IN TEMPO REALE
17 QUALI TECNICHE CI PERMETTONO DI SELEZIONERE IN TEMPO REALE GLI SPERMATOZOI? SELEZIONE DEGLI SPERMATOZOI ATTRAVERSO UN MICROSCOPIO A LUCE POLARIZZATA: BIRIFRANGENZA SELEZIONE DEGLI SPERMATOZOI PER LA ICSI MEDIANTE ACIDO IALURONICO(HYALURONIC ACID HA) PHYSIOLOGICAL ICSI: PICSI SELEZIONE DEGLI SPERMATOZOI PER LA ICSI MEDIANTE AMPLIFICAZIONE DELL IMMAGINE -INTRACYTOPLASMIC MORPHOLOGICALLY SELECTED SPERM INJECTION: IMSI
18 SELEZIONE DEGLI SPERMATOZOI ATTRAVERSO UN MICROSCOPIO A LUCE POLARIZZATA: BIRIFRANGENZA BIRIFRANGENZA indice della reazione acrosomiale dello spermatozoo, permette di correlare tra la forma degli spermatozoi e la loro brillantezza. La diminuzione della brillantezza degli spermatozoi sembra correlare con le alterazioni del DNA spermatico, valori elevati di frammentazione del DNA spermatico comportano una compromissione della vitalità degli embrioni generati e, quindi, il mancato raggiungimento di una gravidanza o una frequenza maggiore di aborti spontanei. Fertility and Sterility Volume 93, Issue 3, February 2010, Pages
19 SELEZIONE DEGLI SPERMATOZOI ATTRAVERSO UN MICROSCOPIO A LUCE POLARIZZATA: BIRIFRANGENZA Reazione acrosomiale avvenuta Reazione acrosomiale non avvenuta In 7 casi su cento, gli spermatozoi che al microscopio risultano di forma normale, hanno però una diminuzione anomala della brillantezza quando vengono valutati con la luce polarizzata. Tra gli spermatozoi che presentano una forma anomala, la proporzione di cellule prive di brillantezza può arrivare sino al 30%.
20 SELEZIONE DEGLI SPERMATOZOI PER LA ICSI MEDIANTE ACIDO IALURONICO (HYALURONIC ACID HA) PHYSIOLOGICAL ICSI: PICSI Fertil Steril 2010;93:
21 La SELEZIONE DEGLI SPERMATOZOI ai fini della PMA SELEZIONE DEGLI SPERMATOZOI PER LA ICSI MEDIANTE ACIDO IALURONICO (HYALURONIC ACID HA) PHYSIOLOGICAL ICSI: PICSI Componente fondamentale complesso cumulo-ovocita del (Drahorad et al., 1991) Fattore determinante per la maturità e vitalità spermatica (Huszar et al., 2003)
22 SELEZIONE DEGLI SPERMATOZOI PER LA ICSI MEDIANTE ACIDO IALURONICO (HYALURONIC ACID HA) PHYSIOLOGICAL ICSI: PICSI Gli spermatozoi che hanno completato il processo di maturazione hanno subito un rimodellamento della membrana plasmatica, eliminato il citoplasma in eccesso e completato la maturità nucleare (Huszar et al., 2003). Gli spermatozoi maturi che esprimono un elevata densità di recettori per HA si legano all acido Ialuronico in maniera permanente. Gli spermatozoi immaturi con alterazioni della membrana plasmatica non riescono a legarsi all acido Ialuronico (Cayli et al. 2003). La ICSI mediante Acido Ialuronico minimizza anche gli eventuali danni riportati dall utilizzo del polivinilpirrolidone (PVP), sostanza sintetica densa utilizzata convenzionalmente per rallentare la motilità degli spermatozoi (Jean et al 2001). Ma morfologicamente non ci permette di guardare oltre.
23 SELEZIONE DEGLI SPERMATOZOI PER LA ICSI MEDIANTE AMPLIFICAZIONE DELL IMMAGINE - INTRACYTOPLASMIC MORPHOLOGICALLY SELECTED SPERM INJECTION: IMSI L iniezione intracitoplasmatica di uno spermatozoo morfologicamente selezionato, basata sull analisi sullo stato dalla morfologia degli organelli nucleari dello spermatozoo (MSOME) mediante l utilizzo di un microscopio ad alto ingrandimento (fino a 6600X).
24 -Preparazione del liquido seminale (stratificazione su gradiente) -Preparazione della piastra in vetro con diverse concentrazioni di PVP Concentrazione PVP Temperatura ( C) Spermatozoi molto mobili 8% 20 C Spermatozoi poco mobili 0% 37 C -Utilizzo di un invertoscopio ad alto ingrandimento equipaggiato con obiettivo Normarski -Seguire il criterio di riferimento per selezione degli spermatozoi ad alto ingrandimento definito Motile Sperm Organelle Morphology Examination (MSOME) (Bartoov et al, 1994) Questo criterio è basato sulla valutazione delle seguenti caratteristiche dello spermatozoo: nucleo, acrosoma, lamina post-acrosomiale, collo, mitocondri e coda. Bartoov et al., 2002
25 L invertoscopio deve essere dotato di ottiche Nomarski, -un obiettivo a X100 -una lente condensatrice 0.55 N/A -una video camera a colori che ha un ½-inc, 3 chips power HAD CCD ( pixe)l -un monitor ad alta definizione. Moltiplicando l ingrandimento dell obiettivo, quella del selettore, della telecamera e del monitor l ingrandimento finale è di 100 X 1.5 X 0.99 X (355.6MM X 8MM) = 6600 (Bartoov et al., 2002) Monitor MM Telecamera 8MM Amplificatore immagine video 0.99 Ottica Normarski Obiettivo 100X Selettore di amplificazione 1,0X 1,5X 2,0X
26 I criteri MSOME sono basati sulla valutazione delle seguenti caratteristiche dello spermatozoo: nucleo, acrosoma, lamina post-acrosomiale, collo, mitocondri e coda. 1-Nucleo: la lunghezza media è stimata intorno a 4.75±0.28 µm e la larghezza media intorno a 3.28±0.20 µm. Si considerano anormali spermatozoi con testa piccola, larga o grande; è necessaria l omogeneità della massa cromatinica nel nucleo, quindi, non ci deve essere alcun disordine nucleare e non deve essere presente più di un vacuolo. Per quanto riguarda i vacuoli, la loro area non deve occupare più del 4 % dell intera area nucleare. 2-Acrosoma: è considerato anormale se è parziale, mancante o vescicolato. Inoltre, si escludono dalla selezione le lamine postacrosomiali se vescicolate. (long>5.31 µm; Short < 4.19µm) µm -Liscio -Simmetrico -Ovale -Omogeneo µm (wide>3.68 µm; narrow < 2.88µm) 5 µm (diameter µm) 50 µm (diameter µm) 3-Collo: non deve essere assiale e non deve avere residui citoplasmatici o disordini. 4-Coda: è considerata anormale se è mozza, rotta, corta o doppia. I mitocondri non devono essere parziali o distanti.
27 SELEZIONE DEGLI SPERMATOZOI PER LA ICSI MEDIANTE AMPLIFICAZIONE DELL IMMAGINE - INTRACYTOPLASMIC MORPHOLOGICALLY SELECTED SPERM INJECTION: IMSI 6000X 6600X 400X 400X 6000X
28
29 estrusione vacuoli
30 La IMSI nella Procreazione Medicalmente Assistita
31 Bartoov et al., 2003 Disegno dello studio -Solo Coppie con infertilità Fattore Maschile -Donne <37 aa -Almeno 2 fallimento di cicli ICSI precedenti -Più di 3 Ovociti da inseminare. 50 coppie ICSI vs 50 coppie IMSI (10 coppi escluse perché non sono stati trovati spp normali)
32 La qualità embrionale ottenuta con la IMSI è significativamente maggiore a quella ottenuta nei precedenti tentativi fatti sulle stesse coppie (controllo storico) e sul gruppo di controllo (coppie sottoposte a trattamenti di ICSI di routine). Gli embrioni ottenuti dall iniezione di spermatozoi morfologicamente normali, secondo i criteri MSOME, portano a maggiori tassi di gravidanza e maggiore potenziale d impianto nonché un tasso d aborto significativamente più basso se paragonato a quello ottenuto nel gruppo di controllo. La SELEZIONE DEGLI SPERMATOZOI ai fini della PMA
33 Berkovitz et al., 2005 Disegno dello studio -Donne <40 aa -Più di 3 Ovociti da inseminare. 309 coppie IVF/ IMSI -145 casi (47%): ovociti inseminati con spermatozoi che esibivano una corretta morfologia nucleare (POSITIVE GROUP) -38 casi (12%): ovociti inseminati con spermatozoi di seconda scelta (NEGATIVE GROUP) -126 casi (41%):ovociti inseminati sia con spermatozoi morfologicamente normali che di seconda scelta (MIXED GROUP)
34 CRITERI DI SELEZIONE DEGLI SPERMATOZOI 1 Criterio di scelta: -Spermatozoi con dimensioni normali -Cromatina normale (0/1 piccolo vacuolo) Berkovitz et al., Hum. Reprod.vol 20 1:
35 2 Criterio di scelta: a. 1 criterio di 2 scelta: cromatina normale A parità di cromatina normale va bene anche uno spp un po più piccolo o un po più grande Spermatozoo un po più piccolo Spermatozoo un po più grande 2 Criterio di scelta: b. 2 criterio di 2 scelta: cromatina normale Mai spermatozoi di forma non ovale >3,7µm <2,9µm
36 2 Criterio di scelta: c. 3 criterio di 2 scelta: cromatina normale Mai spermatozoi di forma anormale 2 Criterio di scelta: d. 4 criterio di 2 scelta: cromatina normale Con un vacuolo Spp di forma ovale
37 Quando i difetti morfologici degli spermatozoi sono analizzati individualmente si può osservare correlazione tra la tipologia di spermatozoo selezionato e -i risultati di laboratorio (tasso di fertilizzazione e tasso di buona qualità embrionale) -i risultati clinici (impianto e tassi di gravidanze).
38 In questi studi viene valutato l effetto della presenza dei vacuoli nucleari. La selezione di spermatozoi di prima scelta (BEST GROUP) e di seconda scelta (SECOND BEST GROUP). Con vacuoli piccoli o di grandi dimensioni. Berkovitz et al.,2006a, Berkovitz et al.,2006b
39 (a) Spermatozoo con cromatina morfologicamente normale. (b) Spermatozoo con cromatina morfologicamente normale +1 piccolo vacuolo. (c) Spermatozoo con cromatina morfologicamente normale +1 grande vacuolo. L utilizzo di spermatozoi che presentano grandi vacuoli riduce il tasso di gravidanza e aumenta, invece, il tasso d aborto precoce.
40 -Donne <40 aa -Almeno 2 fallimento di cicli ICSI precedenti Il gruppo di studio è paragonato al gruppo storico di controllo: ICSI vs IMSI La selezione dello spermatozoo ad alto ingrandimento non migliora la qualità embrionale ma viene osservato un significativo miglioramento dei risultati clinici
41 Viene osservata la relazione tra la tecnica IMSI e ICSI rispetto il tasso di frammentazione del DNA spermatico. Con la tecnica IMSI si ha possibilità di escludere spermatozoi con vacuoli intranucleari (che possono riflettere alti livelli di frammentazione del DNA). Suggerendo così che questa procedura possa essere usata nei casi in cui siano alti i valori di frammentazione del DNA spermatico.
42 -Prospettico randomizzato -416 coppie
43 La selezione dello spermatozoo ad alto ingrandimento non modifica i tassi di fertilizzazione e il n di embrioni ottenuti, ma porta ad un significativo miglioramento dei risultati clinici
44
45 Età media, n di ovociti inseminati, n di embrioni trasferiti e percentuale di Fertilizzazione NON SIGNIFIVATIVI
46 -25 pz -Donne <40 aa -Almeno 8 ovociti da inseminare A: Grado I - spp normali no vacuoli B-C: Grado II - spp normali con <2 piccoli vacuoli D-E: Grado III - spp normali con < 2 piccoli vacuoli o 1 grande F: Grado IV - spp anormali e con larghi vacuoli
47 La presenza di vacuoli nello spermatozoo ha un effetto negativo sullo sviluppo embrionale che si evidenzia soprattutto nello sviluppo a blastocisti. Confermando l ipotesi per cui lo sviluppo embrionale può essere influenzato dall effetto paterno tardivo.
48 -30 pz -1 o 2 fallimenti precedenti di impianto -Fattore maschile In questo studio randomizzato se si osserva la qualità embrionale in 2 giornata non vi sono differenze tra ICSI e la IMSI
49 LA NOSTRA ESPERIENZA al Centro di Medicina della Riproduzione del Policlinico di Modena -15 pz -Donne <40 aa ( ) -Almeno 2 fallimento di cicli ICSI precedenti -Fattore maschile severo N pazienti Età media N ovociti inseminati % Fertilizzazione % embrioni A+B % gravidanz a % aborto Ciclo ICSI precedente IMSI ns ns ns ns ns ns p>0.05
50 (tecnica IMSI) CONCLUSIONI E evidente l importanza della selezione del miglior spermatozoo per la microiniezione dell ovocita 1-Birifrangenza: non sempre la brillantezza di uno spermatozoo è indice della sua maturità. In 7 casi su cento, gli spermatozoi che al microscopio risultano di forma normale, hanno però una diminuzione anomala della brillantezza Tra gli spermatozoi che presentano una forma anomala, la proporzione di cellule prive di brillantezza può arrivare sino al 30%). 2-PICSI: valuta la maturità grazie all adesione all acido Ialuronico ma morfologicamente non ci permette di guardare oltre (parametro biochimico) -potrebbe essere d aiuto nella selezione degli spermatozoi da analizzare mediante IMSI.
51 (tecnica IMSI) CONCLUSIONI 3-La IMSI: - permette una valutazione morfologica degli spermatozoi in tempo reale riducendo la probabilità di scegliere spermatozoi con danni al DNA anche se in alcuni casi non è possibile utilizzare spermatozoi che rivestano tutti i criteri MSOME (parametro morfologico).. -fin ora è stata applicata solo ad una popolazione selezionata di pazienti con scarsa prognosi, caratterizzata da ripetuti fallimenti di cicli di IVF/ICSI e da fattore maschile severo (Bartoov et.al. 2002, Bartoov et.al. 2003, Berkovitz et.al. 2005, Berkovitz et.al. 2006, Hazout et.al. 2006, Antinori et.al. 2008). -Si è comunque osservato che quando si confronta l iniezione di uno spermatozoo con morfologia normale con quella di uno spermatozoo con morfologia anormale i risultati della IMSI in termini di tassi d impianto e gravidanza sono significativamente aumentati, mentre sono significativamente ridotti i tassi d aborto precoce. (Berkovitz et.al. 2005, Berkovitz et.al. 2006, Berkovitz et.al. 2006).
52 (tecnica IMSI) CONCLUSIONI 4-Sembra, inoltre, che il più importante criterio predittivo di qualità spermatica sia la morfologia del nucleo e in particolare la presenza di vacuoli. (Berkovitz et.al. 2005). La presenza di vacuoli può riflettere difetti molecolari responsabili del rimodellamento anomalo della cromatina durante la maturazione dello spermatozoo (Cayli et.al. 2003) e può rendere lo spermatozoo stesso più vulnerabile al danno al DNA (Sakkas et.al. 2003). 5-Questa tecnica richiede elevati costi di equipaggiamento aggiuntivo della strumentazione di laboratorio; un alto grado di formazione del biologo che deve effettuare la selezione degli spermatozoi che può impegnare dai 60 ai 210 minuti di lavoro dipendentemente dalle caratteristiche degli spermatozoi.
53 SEVERA OAT RIPETUTI FALLIMENTI ABORTI RICORRENTI INFERTILITA INSPIEGATA MSOME SPERMATOZOI NORMALI <20% SPERMATOZOI NORMALI >20% IMSI NO GRAVIDANZ A FIVET/ICSI
54 (tecnica IMSI) CONCLUSIONI I metodi di selezione dei gameti sono di grande importanza specialmente dove, la possibilità di osservare in tempo reale e ad alto ingrandimento lo spermatozoo può rappresentare un ottima opportunità per studiare la relazione tra particolari difetti dello spermatozoo e i risultati della ICSI. Ad ogni modo, altri studi prospettici randomizzati, sono necessari per confermare i risultati preliminari descritti e per identificare altre popolazioni di pazienti che potrebbero beneficiare di questa tecnica.
55 Equipe Medica Dott. Simone Giulini (Responsabile del Centro) Direttore Prof. Annibale Volpe Dott. Antonio La Marca (Responsabile clinico e scientifico) Dott.ssa Alessandra Tirelli (Ginecologa) Dott.ssa Francesca Tortolani (Ginecologa) Segreteria Organizzativa Paola Levratti (Ostetrica) Equipe di Laboratorio Dott.ssa Daniela Tagliasacchi (Responsabile del laboratorio) Dott.ssa Tiziana Marsella (Biologa) Dott.ssa Susanna Xella (Biotecnologa)
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