IMPIEGO DI MARKER MOLECOLARI PER LA VALUTAZIONE DEI TRATTAMENTI TERMICI DEL LATTE

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1 Dagli atti del V Congresso naz. di Chimica degli Alimenti, Parma giugno IMPIEGO DI MARKER MOLECOLARI PER LA VALUTAZIONE DEI TRATTAMENTI TERMICI DEL LATTE I.Gandolfi, E.Bassi, C.Vatteroni, M. Monici, P. Cagnasso, Laboratorio Centrale- Ricerca e Sviluppo, Parmalat Il latte è un alimento di grande importanza nutrizionale, il cui valore è comprovato da millenni di costante impiego nell alimentazione umana. La ricchezza della sua composizione i -contiene lattosio, proteine, grassi, calcio, fosforo e vitamine-, lo rende un fertile substrato per la crescita dei microrganismi, al punto che può essere consumato crudo soltanto entro poche ore dalla mungitura e non senza qualche rischio. Il trattamento termico è il metodo classico di bonifica del latte: fino a pochi decenni or sono veniva utilizzata la bollitura domestica, che ne altera alcune caratteristiche e ne distrugge i componenti più delicati ii. In tempi recenti, lo sviluppo di tecnologie sempre più "mild" ha consentito all industria di ottimizzare i processi di trattamento, assicurando la conservazione e le caratteristiche organolettiche e nutrizionali dell alimento. La pastorizzazione e il trattamento UHT sono le tecnologie maggiormente utilizzate nell industria lattiero-casearia iii, che consentono tempi diversi di conservazione in funzione dell abbattimento microbico. La pastorizzazione è il trattamento termico a bassa temperatura (non inferiore a 72 C per 15 ) che, eliminando la flora batterica patogena e banale, consente la conservazione del latte per alcuni giorni a temperatura di frigorifero. La pastorizzazione abbinata alla microfiltrazione è il processo secondo il quale il latte scremato, appena prima del trattamento di pastorizzazione vero e proprio viene microfiltrato. Passa quindi attraverso una membrana la cui porosità (1,4-2.0µm) consente di trattenere solo le cellule somatiche e le impurità microbiche (99,9%) e di lasciare passare tutte le sostanze nutritive, che sono molto più piccole dei pori. Per queste ragioni il latte rimane fresco per oltre 12 giorni e rimangono intatti il sapore e il valore nutrizionale. L UHT (UltraHightTemperature) è il trattamento che comporta il riscaldamento del latte in continuo a temperatura di poco superiore a 138 C per 2-4 sec. e consente la conservazione del latte per oltre tre mesi, in imballi asettici. Questa tecnologia, sfruttando il fatto che all aumentare della temperatura corrisponde un vertiginoso aumento della cinetica di inattivazione delle spore, consente l utilizzo di tempi di trattamento brevissimi con un trascurabile aumento della velocità delle reazioni chimiche di denaturazione, che sono influenzate soprattutto dal tempo di esposizione al calore iv. Nel trattamento UHT, il calore viene normalmente trasferito per conduzione termica (modo indiretto) o iniettando direttamente il vapore nell alimento (diretto) o facendo passare un film sottile di latte attraverso l interno di un piccolo serbatoio saturo di vapore surriscaldato (infusione).

2 Quest ultima tecnologia consente una uniforme, immediata e delicata diffusione del calore su tutto il latte, fornendo la stessa sicurezza igienica del tradizionale trattamento UHT diretto, ma superiori caratteristiche nutrizionali ed organolettiche, vicine a quelle del latte fresco pastorizzato v. Tutti i processi di trattamento termico determinano comunque reazioni indesiderate, di entità diversa in funzione della tecnologia impiegata, che possono influire sulle proprietà organolettiche e sulla qualità nutrizionale. Risulta quindi molto utile disporre di indici analitici idonei per valutare i differenti tipi di trattamento, per quantificare gli effetti dei parametri termici applicati, ottimizzare i processi produttivi, individuare le migliori tecnologie per conservare le proprietà organolettiche e nutrizionali del latte. In letteratura sono descritti importanti markers molecolari, alcuni dei quali trovano larga applicazione quotidiana nell industria lattiero-casearia: le proteine solubili del siero, la frazione proteica sensibile al calore nel range di temperature impiegate per la pastorizzazione vi. I proteoso-peptoni, la componente della frazione proteica del siero correlabile al concetto di freschezza del latte fresco pastorizzato vii La furosina viii, la molecola ottenuta per idrolisi acida dal composto di Amadori che può esssere impiegata per valutare gli effetti del trattamento termico ix (pastorizzazione x, UHT, sterilizzazione), l aggiunta di polvere al latte crudo xi, e l eventuale perdita di lisina disponibile xii. Il lattulosio xiii, xiv, un epimero del lattosio che si forma in quantità significative per trattamenti superiori a 100 C. Le proteine sono presenti nel latte in concentrazione variabile intorno al 3,3% e vengono solitamente suddivise in due grandi gruppi: la caseina, complesso di proteine fosforilate che precipita quando il latte viene acidificato a ph 4,6 e le proteine del siero, così chiamate perchè in tale processo rimangono in soluzione, cioè nel siero xv. Le proteine del siero, costituite principalmente da α-lattoalbumina, β-lattoglobulina, immunoglobuline, proteoso-peptoni si denaturano rapidamente sotto l influenza del calore, in quanto presentano: 1. ridotto numero di gruppi fosforici 2. ridotto contenuto di prolina (rispetto alla caseina), la cui presenza riduce la possibilità di formazione dei legami idrogeno facilmente scindibili dal calore 3. grandi quantità di amminoacidi solforati come cisteina e metionina, che aumentano la possibilità di formazione dei legami disolfuro, facilmente scindibili come i legami idrogeno. Le temperatura di denaturazione delle proteine del siero del latte sono mediamente comprese tra C: sotto l influsso del calore si aprono le catene e si possono formare nuovi legami tra le catene aperte, generalmente ponti disolfuri intermolecolari, che portano alla formazione di aggregati che determinano dei complessi con la caseina: la quantità di complesso formato è in funzione del calore ricevuto. Per tale ragione le proteine del siero sono impiegate come indice di pastorizzazione

3 e rappresentano un parametro di legge per la classificazione merceologica del latte fresco pastorizzato. La determinazione delle sps viene comunemente eseguita con il metodo Kjeldhall. In letteratura è descritto anche un metodo HPLC che consente la separazione di proteoso peptoni, α-lattoalbumina, β-lattoglobulina, immunoglobuline e le BSA. I proteso peptoni si sono rivelati un parametro utile per valutare la freschezza del latte pastorizzato. L incremento di proteso peptoni è conseguenza diretta dell invecchiamento del latte fresco pastorizzato in relazione all attività di particolari enzimi, le PROTEASI leucocitarie, che derivano dalla lisi delle cellule somatiche e dei leucociti.queste attivano la plasmina che attua una proteolisi specifica sulla β-caseina con liberazione di proteoso peptoni. PROTEASI Origine Resistenza alla pastorizzazione blanda Native del latte - proteolisi aspecifica parziale su tutte le frazioni caseiniche Batteriche -proteolisi aspecifica su parziale tutte le frazioni caseiniche Leucocitarie (da cellule somatiche, totale leucociti)- Attivatrici dell enzima plasmina (plasminogeno plasmina) che attua una proteolisi specifica sulle β-caseine Prodotti di degradazione Piccoli peptidi Piccoli peptidi Proteoso peptoni Per la determinazione dei proteso peptoni viene utilizzato il metodo HPLC delle proteine del siero, variando la composizione del gradiente di eluzione per una miglior quantificazione di questa frazione. Tale metodo ha permesso di evidenziare che (graf.1): nel latte fresco pastorizzato i proteoso peptoni aumentano già dopo 3 giorni di conservazione a 4 C. in un latte microfiltrato fresco pastorizzato, l eliminazione delle cellule somatiche, fa sì che l aumento di proteoso peptoni rimanga contenuto fino a giorni. Sulla base di questi risultati è stato ipotizzato un valore soglia di proteoso peptoni quale indice di freschezza del latte Il latte contiene quantità elevate di lattosio (zucchero riducente) e di lisina, un amminoacido essenziale contenente un ε-amino gruppo particolarmente reattivo. Per tale ragione la reazione di Maillard rappresenta una delle reazioni maggiormente attivate dal trattamento termico, in quanto l ε-amino gruppo, reagendo con il lattosio, forma la ε-n-

4 deossilattulosil-lisina (conosciuto come composto di Amadori) che rappresenta il 1 stadio della RM. Il composto di Amadori si degrada poi in prodotti secondari, potenzialmente in grado di alterare le caratteristiche organolettiche dell alimento; non essendo poi biodisponibile determina inoltre il bloccaggio di una frazione di lisina. Un marker largamente utilizzato quale indicatore quantitativo della RM è la ε-n-2-furoilmetillisina, il composto comunemente conosciuto come furosina, che si ottiene per idrolisi acida, dalla ε- N-deossilattulosil-lisina (composto di Amadori). La determinazione della furosina nel campione acido idrolizzato può essere eseguita in gascromatografia, in elettroforesi capillare o in cromatografia liquida di fase inversa e rivelazione UV (280nm). Nell industria lattiero casearia la furosina trova largo impiego quale: indice di sofisticazione, per individuare la presenza di latte in polvere nel latte crudo indice di trattamento termico, in grado non solo di discriminare le classi merceologiche del latte in funzione del trattamento ma anche di valutare l effetto di diverse condizioni tecnologiche all interno di una stessa classe indice della quantità della lisina bloccata. Oltre alla furosina, un indice di trattamento termico del latte largamente impiegato nell industria lattiero casearia è il lattulosio xvi, un prodotto di isomerizzazione del lattosio. Poiché il riscaldamento induce una lenta isomerizzazione del lattosio, il lattulosio si forma in concentrazioni superiori a 50mg/l solo per temperature superiori a 100 C. Per la determinazione del lattulosio sono disponibili metodi enzimatici, metodi gascromatografici e metodi HPLC. Il gruppo di lavoro IDF-E56 ha suggerito un metodo HPLC con separazione su resina scambiatrice di ioni solfonici in forma piombo e rivelazione in indice di rifrazione. Tale metodo presenta un reale limite di determinazione di circa 70 mg/l e quindi una bassa sensibilità. I risultati di un indagine, eseguita con il metodo HPLC sopracitato, sul contenuto di lattulosio di differenti latti UHT del commercio a diverse date di scadenza indica che i campioni trattati con tecnologie particolarmente mild, presentano un valore di lattulosio al limite della determinazione quantitativa del metodo. Per valutare quindi il lattulosio indotto dall impiego di tecnologie UHT innovative particolarmente mild e dalla pastorizzazione, in collaborazione con l Università del Molise e il Dipartimento di scienze e tecnologie chimiche dell Università di Roma Tor Vergata, abbiamo messo a punto un metodo enzimatico ad elevata sensibilità xvii. Il metodo si fonda sul presupposto che nel latte non è presente fruttosio in forma libera: quello rilevabile deriva pertanto dall idrolisi del lattulosio. Il limite di determinazione è di 2,5mg/l. La precisione si è rivelata ottima anche per bassissimi livelli di concentrazione: a 2,5 e 20mg/l corrispondono RSD pari a 3 e 3,7% rispettivamente). La linearità della risposta è ottima (r 2 =0,988 e r 2 =0,999) Questo metodo è utile e affidabile per valutare tutti i tipi di trattamento termico, ma richiede tempi lunghi di analisi. Le quantità di lattulosio che si formano alle temperature di pastorizzazione sono

5 veramente piccole ma anch esse utili per contribuire a comprendere meglio le caratteristiche del processo. In generale si può affermare che un solo indice non è sufficiente per interpretare un fenomeno: tale interpretazione infatti è tanto più aderente alla realtà quanto maggiore è il numero di indici di natura diversa presi in considerazione. Bibliografia i Alais C., Scienza del latte, Ed. Tecniche Nuove, 1984 ii Pellegrino L. & Resmini P. (Italy) & Luf W. (Austria). - Assessment(indices) of heat treatment of milk. Heat-Induced Changes in milk,fil-idf, second edition, revision of Bulletin 238/1989, 20chapter. iii Corradini C., Tecnologia del latte, Ed. Tecniche nuove, 1995 iv FIL-IDF doc.133, 1981, New Monograph on UHT milk, cap. 4, J. E. Ford and S.Y. Thomson, The nutritive value of UHT milk, v Salvadori C.,Il latte: guida alla scienza e alla tecnologia del latte, cap 3, Edizioni Food per Parmalat SpA, 1995 vi Resmini P., Pellegrino L., Andreini R., Prati F. - Determinazione delle sieroproteine solubili del latte per HPLC (cromatografia liquida ad alta prestazione) in fase inversa. Sci.Tecn.Latt.CAS., 40,7-23 (1989a) vii Resmini P., Pellegrino L., Cattaneo S., De Noni I., M asotti F., Battelli G., Come valutare oggettivamente l invecchiamento del latte fresco pastorizzato, Atti del Convegno Il latte fresco: quando si può chiamare tale?, Federazione Italiana Agricoltori di Treviso, Treviso 4 maggio viii Resmini P., Pellegrino L. and Battelli G. - Accurate quantification of furosine in milk and dairy products by direct HPLC method Ital.J.Food Sci., n.3, ix Cattaneo S., PellegrinoL., Resmini P., Riconoscimento di crema e di latte magro trattati termicamente in condizioni diverse e rimiscelati, Scienza e tecnica lattiero-casearia, 53(4), ,2002. x Decr. MI.RI.AGR.AL.FO Fissazione di un valore massimo di furosina per il latte pastorizzato in flusso continuo e che risulta perossidasi positivo. xi Resmini P., Pellegrino L., Masotti F., Tirelli A., Prati F. - Determinazione del latte in polvere ricostituito nel latte crudo ed in quello pastorizzato, mediante HPLC della furosina. Scienza e Tecnica Lattiero-Casearia, 43, (3), (1992). xii Finot P.A., DeutschR., and Bujard E., The extent of the Maillard reaction during the processing of milk, Prog. Fd. Nutr. Sci., vol.5 pp , xiii O'Brien J. - Heat-induced changes in lactose: isomerization, degradation, Maillard Browning. Heat-Induced Changes in milk, FIL-IDF,second edition, revision of Bulletin 238/1989, chapter7 xiv FIL-IDF, International IDF Standard 147: Heat-Treated milk-determination of lactulose content- High performance liquid chromatography (Reference method). xv Addeo F., Debry G., Paquot M., Sachet P., Schilmme E., Soustre Y. Le proteine del latte e derivati: verità nutrizionali, Ed. Masson, 1994 xvi Pellegrino L., De Noni I. & Resmini P. - Coupling of lactulose and furosine indices for quality evaluation of sterilized milk. Int.Dairy Journal, 5, , (1995). xvii Marconi E., Messia M.C., Validation and application of a rapid and sensitive lactulose assay for distinguishing heattreated milks, J. of Diary Research, 2000