Università degli studi di Catania Scuola di Medicina e Chirurgia Corso di laurea in Tecniche di Laboratorio Biomedico

Transcript

1 Università degli studi di Catania Scuola di Medicina e Chirurgia Corso di laurea in Tecniche di Laboratorio Biomedico VALIDAZIONE DI UN METODO EFFICACE PER LO STUDIO FARMACOCINETICO DELLA NICOTINA Tesi di Laurea Sonia Saitta RELATORE: Prof.ssa Margherita Ferrante CORRELATORE: Dott.ssa Gea Oliveri Conti

2 La sigaretta rappresenta attualmente un vero e proprio fenomeno socio economico e di costume a livello globale. Glamour women Lo studio della farmacocinetica della nicotina è considerato uno strumento conoscitivo fondamentale per la delucidazione dei meccanismi di assorbimento e di efficacia correlati all uso dei nuovi dispositivi antifumo se comparati all assunzione di nicotina mediante il fumo di sigaretta tradizionale.

3 La nicotina assunta ha un'emivita di circa 2h metaboliti: nicotina-n-ossido, nornicotina e cotinina Circa il 70-80% della dose viene C-ossidata dal citocromo P-450 nel fegato CYP2A6 è il più importante P450 per la C-ossidazione della nicotina

4 E stato avviato un progetto pilota per la valutazione della farmacocinetica della nicotina assunta tramite e-cig rispetto all assunzione tramite fumo tradizionale in volontari arruolati presso il Centro per la Prevenzione e Cura del Tabagismo (Dip. Di Biomedicina Clinica e Molecolare - Prof. Polosa research group). Il progetto (PRE-ELECT) è quindi integrato in uno studio volto a definire i protocolli per lo studio multicentrico nazionale (ELECT).

5 Metodi di determinazione citati in letteratura RP-HPLC-UV; LC/MS/ESI TQD o LC/MS/APCI -TQD; GC-NPD; tecniche immunoenzimatiche.

6 VANTAGGI Qualità fase preparativa. Utilizzo standard interno (acetalinide). Bassi valori di LOD e LOQ (alta sensibilità). Validato per urine e sangue. SVANTAGGI Non validato per la caffeina. Non tiene conto della coeluizione della caffeina con la cotinina. La caffeina è una sostanza idrofilica simile alla cotinina e ciò può comportare una coeluizione con conseguente interferenza nel segnale.

7 Metodo di Massadeh modificato Abbiamo sviluppato e validato un metodo RP-HPLC-UV efficace ed efficiente votato alla determinazione di concentrazioni di nicotina, cotinina e caffeina in multiresiduo in campioni ematici. È stata esclusa la spettrometria di massa costi dispendiosi notevole background richiesto all operatore

8 PROBLEMATICA SOLUZIONE Sovrapposizione standard interno (dati non confrontabili con quelli di Massadeh) Correzione con standard esterno e prove di recupero Stabilità del campione preparato di ~8h Iniezione di 7-8 campioni per volta La nicotina permane in traccia all interno della colonna Separazione analitica con eluizione isocratica in tampone + pulizia accessoria in ACN.

9 L HPLC è una tecnica di cromatografia liquida che consente di separare i composti di una miscela, sfruttando la loro differente affinità nei confronti di una fase stazionaria, contenuta all interno di una colonna cromatografica, attraverso cui fluisce la fase mobile.

10 Eluizione isocratica: tampone costituito da una miscela di 0,544 g di KH2PO4; 0,368 g di sodio n-eptano-solfonato (donatore di coppia ionica); 1640 ml di acqua MilliQ e 360 ml di metanolo. ph della fase mobile 3,2 flusso: 1,0 ml/min ʎ: stata programmata a 254 nm da 0 a 18 min e a 260 nm da 18 a 30 min Colonna Knauer C18 con precolonna

11

12 I recuperi su campioni di plasma fortificato sono stati del 110% per la nicotina, del 110% per la caffeina e del 91% per la cotinina e le linearità (R 2 ) calcolate sono stata rispettivamente di 0,9976 per la nicotina, di 0,9991 per la caffeina e di 0,9996 per la cotinina. LOD e LOQ sono stati calcolati sulla scorta del rapporto segnale/rumore rispettivamente pari a 3:1 e 6:1. ng/ml LOD LOQ cotinina 10,9 35 caffeina 7 22,50 nicotina 13,7 43,7

13 Nello studio pilota (PRE-ELECT) 98 campioni di sangue sono stati raccolti da 14 volontari (selezionati accuratamente tra pazienti del Centro Antifumo del Policlinico di Catania) che si sono astenuti per 12h dal consumo di caffè e prodotti del tabacco con/e senza combustione prima dell esposizione controllata a fumo di sigaretta (volontari della serie C) e di e-cig (volontari della serie O). Per testare la capacità di rilevazione del metodo messo a punto abbiamo analizzato 14 campioni ematici di cui 7 da un volontario che aveva fumato e-cig (01-Tx-O) e 7 da uno cha aveva fumato la sigaretta tradizionale (04-Tx-C).

14 Raccolta e conservazione 4mL di sangue di ciascun volontario sono stati raccolti in provette con EDTA; centrifugati immediatamente a 2800 rpm per 5 min; il plasma surnatante è stato raccolto poi in provette eppendorf e qui congelati a -80 C fino al momento dell'analisi. Protocollo di estrazione del campione 0,5 ml di plasma è stato posto in una provetta di vetro 100µL di acetanilide in metanolo al 50% (standard interno); ogni campione è stato alcalinizzato con 100mL di NaOH (2,5M) e vortexato per 30 s. l estrazione è stata eseguita mediante aggiunta di 3mL di una soluzione 1:1 di diclorometthane/diethyletere, agitazione per 2 min; la fase organica separata è stata prelevata accuratamente e trasferita in un nuova provetta di vetro contenente 20µL di HCl (0,25M);

15 La fase organica è stata evaporata in corrente di azoto a temperatura ambiente fino a secchezza completa; La fase organica è ricostituita quindi con 250µL di fase mobile in vials di vetro da 2mL fornita di riduttore; (100µL) Iniettati nel sistema cromatografico HPLC.

16 Volontario fumatore di sigaretta tradizionale Volontario svapatore

17 E-cig Sigaretta La lettura dei 14 campioni ha testimoniato la capacità e l affidabilità del metodo per una sua applicazione in studi di farmacocinetica della nicotina

18 La valutazione della caffeina non è una scelta opzionale. Ad oggi tutti i dati di letteratura (astensione del volontario dal consumo di caffè) risultano non veritieri dato che l esposizione inalatoria della caffeina attraverso il fumo è sempre stata sottostimata o non giustamente considerata. La disponibilità di dati corretti e più rispondenti alla realtà oggettiva permetterà la conoscenza della: reale concentrazione della nicotina assorbita e della cotinina prodotta; reale farmacocinetica della nicotina. Entrambi questi fattori sono di fondamentale importanza in termini di guadagno in salute pubblica per le loro implicazioni nella valutazione e gestione dei rischi derivanti dall esposizione attiva e passiva a fumo tradizionale e elettronico.

19