Il formaggio Gorgonzola ed il problema Listeria monocytogenes

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1 Cop Quaderno ricerca ok :45 Pagina 2 Regione Lombardia Agricoltura CONSORZIO TUTELA FORMAGGIO GORGONZOLA ISTITUTO LATTIERO CASEARIO DI LODI Il formaggio Gorgonzola ed il problema Listeria monocytogenes QUADERNI DELLA RICERCA N 28 Marzo 2004

2 Cop Quaderno ricerca ok :45 Pagina 3 Regione Lombardia Agricoltura Sperimentazione condotta nell ambito del Progetto Regionale di Ricerca Il formaggio Gorgonzola e la questione Listeria monocytogenes (GOLIS) (d.g.r. 1 dicembre 2000 nr 2396) A cura di: D. Carminati G. Mucchetti E. Neviani 2 S. Fontana 3 Hanno realizzato le attività sperimentali, le prove, lo studio: Istituto Sperimentale Lattiero-Caseario Via A. Lombardo, Lodi Tel Fax ilcomm@pop.telware.it Hanno collaborato G. Giraffa 1 A. Perrone 1 B. Bonvini 1 F. Locci 1 M. Gatti 1 G. Filippi 3 C. Olivato 3 Per informazioni: Regione Lombardia - Direzione Generale Agricoltura U.O. Programmazione e ricerca per le filiere agroindustriali Struttura Ricerca e innovazione tecnologica Piazza IV Novembre, Milano Tel Fax agri_ricerca@regione.lombardia.it Referente: Gianpaolo Bertoncini Tel gianpaolo_bertoncini@regione.lombardia.it 1 Istituto Lattiero Caseario di Lodi 2 Università di Parma 3 Consorzio Tutela Formaggio Gorgonzola DOP. Copyright Regione Lombardia 1 1

3 interno Quaderno ricerca ok :58 Pagina 1 Regione Lombardia Agricoltura CONSORZIO TUTELA FORMAGGIO GORGONZOLA ISTITUTO LATTIERO CASEARIO DI LODI Il formaggio Gorgonzola ed il problema Listeria monocytogenes (GOLIS) QUADERNI DELLA RICERCA N 28 Marzo 2004

4 interno Quaderno ricerca ok :58 Pagina 2 Sommario Presentazione pag. 3 Premessa pag. 4 Finalità della ricerca pag. 7 Articolazione della ricerca pag. 8 Considerazioni conclusive del progetto di ricerca GOLIS pag. 39 Bibliografia di riferimento pag. 41 2

5 interno Quaderno ricerca ok :58 Pagina 3 Presentazione Nel mondo occidentale, nel momento in cui per la maggior parte della popolazione la disponibilità di cibo non rappresenta più un problema, è diventata preminente la problematica della sicurezza alimentare. Paradossalmente mentre da un punto di vista strettamente tecnico e scientifico il rischio alimentare è ridotto al minimo, mai come ora la percezione del rischio da parte del consumatore è stata così elevata, al punto da indurre la Commissione della Comunità Europea nel Libro Bianco sulla sicurezza alimentare, ad affermare come priorità assoluta l obiettivo di assicurare ai cittadini lo standard massimo di sicurezza degli alimenti. In tale ottica, la Direzione Generale Agricoltura ha finanziato il progetto di ricerca Il formaggio Gorgonzola e la questione Listeria monocytogenes per indagare, in uno dei formaggi DOP più importanti a livello nazionale oltre che lombardo, la probabilità di insorgenza e per mettere a punto una strategia razionale di riduzione del rischio relativo alla presenza del microrganismo sulla superficie del formaggio. Dai risultati del progetto emerge che il problema esiste, ma può essere controllato con successo adottando da parte di produttori, commercianti e consumatori opportuni accorgimenti. Questa pubblicazione illustra l attività di ricerca svolta nel triennio e rappresenta certamente uno strumento utile per tutti gli operatori e gli studiosi del settore lattiero-caseario. Viviana Beccalossi Vicepresidente ed Assessore Regionale all Agricoltura 3

6 interno Quaderno ricerca ok :58 Pagina 4 Premessa Il Gorgonzola è uno dei formaggi DOP nazionali più conosciuti ed apprezzati sia in Italia che all estero. Lo stato italiano, con decreto 30/10/1955 n 1269, riconobbe la denominazione di origine Gorgonzola e stabilì i metodi di lavorazione, le caratteristiche merceologiche e le zone di produzione di questo formaggio. A tutela della produzione e del commercio del formaggio per il quale è consentito l uso della denominazione Gorgonzola, il 14 maggio 1970 venne fondato il Consorzio per la tutela del formaggio Gorgonzola. L area di produzione è limitata alle province di Novara, Vercelli, Verbano Cusio Ossola, Biella, Cuneo, ed il territorio di Casale Monferrato per il Piemonte e Bergamo, Brescia, Como, Cremona, Lodi, Lecco, Milano, Pavia e Varese per la Lombardia. La produzione di Gorgonzola nel 2002, equamente distribuita tra Lombardia e Piemonte, è risultata essere di n forme pari a circa Tons di prodotto finito, per un valore della sola materia prima di circa 150 milioni di euro. Nel panorama dei 30 formaggi DOP italiani, il Gorgonzola rappresenta circa il 10% della produzione nazionale e circa il 6% dei consumi di formaggi italiani. Il giro d affari al consumo è di oltre 350 milioni di euro. Il 30% circa della produzione è destinato all esportazione. Il Gorgonzola è un formaggio erborinato a pasta molle ottenuto da latte di vacca intero pastorizzato aggiunto di fermenti lattici e muffe selezionate. Le caratteristiche merceologiche prevedono: formaggio da tavola di forma cilindrica con peso medio variabile tra 6 e 13 Kg; crosta ruvida con pigmentazione dal grigio all arancio, non edibile; pasta unita di colore bianco o paglierino, screziata per sviluppo di muffa (erborinatura); sapore da dolce o leggermente piccante a decisamente piccante maturazione compresa tra i 50 ed i 120 giorni; tenore minimo in estratto secco 45%; grasso minimo sulla sostanza secca 48%. I trattamenti del latte, della cagliata e del formaggio, le attrezzature utilizzate ed i locali di stagionatura condizionano il processo produttivo e maturativo del formaggio Gorgonzola e danno un contributo essenziale al fine di ottenere un prodotto dalle caratteristiche peculiari e tipiche riconosciute dal consumatore. La pastorizzazione del latte consente l eliminazione dei germi patogeni e comporta la contemporanea riduzione delle altre microflore contaminanti; i microrganismi presenti nella cagliata sono quindi prevalentemente quelli aggiunti con gli innesti selezionati. In seguito l ecosistema microbico del formaggio, in particolare la sua superficie, si arricchisce in relazione ai microrganismi presenti negli specifici ambienti di produzione. Durante la stagionatura le forme vengono forate, in fasi successive, per favorire l aerazione della pasta necessaria allo sviluppo della muffe caratteristiche del Gorgonzola (Penicillium weidemanii e Penicillium spp.), che determinano la tipica erborinatura verde della pasta. Il processo di maturazione, grazie alla proteolisi svolta principalmente dal sistema di proteasi e peptidasi di Penicillium, comporta una graduale riduzione dell acidità del formaggio con risalita del valore di ph anche vicino alla neutralità; questa modificazione del substrato, particolarmente evidente a livello di superficie, condiziona l evoluzione della flora microbica del prodotto e riduce anche la capacità naturale del formaggio di interferire con le contaminazioni microbiche secondarie che possono originare negli ambienti di stagionatura. In particolare, l ecosistema naturale che si forma a livello della crosta può 4

7 interno Quaderno ricerca ok :58 Pagina 5 favorire la colonizzazione anche da parte di batteri indesiderati, come Listeria monocytogenes. Il Gorgonzola rappresenta un ecosistema in continua evoluzione nel procedere della maturazione nel quale le variabili che regolano le interazioni tra le cellule microbiche ed il substrato sono diverse in funzione del momento in cui avviene la contaminazione. Nella fase iniziale della lavorazione, in caldaia e fino alla stufatura, la diminuzione dell acidità del substrato svolge un ruolo predominante. Durante la successiva fase di salatura a secco, soprattutto a livello superficiale, si ha anche un abbassamento dell attività dell acqua. Durante la maturazione la foratura modifica le condizioni della presenza di ossigeno nella pasta e la bassa temperatura condiziona le interazioni tra microrganismi e substrato, favorendo la crescita dei microrganismi capaci di crescere a temperatura di 2-5 C. La già citata progressiva disacidificazione del Gorgonzola, in particolare della sua crosta, sottrae infine uno dei classici fattori intrinseci di controllo della microflora (1-3). Listeria monocytogenes è un microrganismo patogeno responsabile di una malattia, denominata listeriosi, che colpisce sia l uomo che altre specie animali. Fra i patogeni cosiddetti emergenti L. monocytogenes è quello che negli ultimi anni ha suscitato più clamore nel settore lattiero-caseario perché gli episodi di listeriosi alimentare per consumo di latte e derivati hanno dato origine a forme cliniche anche gravi con un tasso di mortalità piuttosto alto (circa 30%). L. monocytogenes, come molti altri patogeni, è particolarmente pericoloso per individui anziani, malati immunodepressi, donne in gravidanza e neonati, perché possono contrarre la malattia anche quando la carica infettante nell alimento consumato è particolarmente bassa (< 100 ufc/g) (4-7). Le caratteristiche fisiologiche di L. monocytogenes, quali l acidotolleranza (capacità di crescere fino a ph di , e di sopravvivere anche in alimenti acidi quali lo yogurt), l alotolleranza (capacità di crescere fino a concentrazioni di NaCl del 10%, e di sopravvivere fino a concentrazioni del 25%) e la psicrotrofia (capacità di crescere anche a 4 C, con un tempo di duplicazione di circa 30 ore), consentono a questo microrganismo di insediarsi, adattarsi e svilupparsi anche nelle condizioni ambientali più sfavorevoli che le tecnologie di produzione casearia comportano (8-11). L ubiquitarietà in natura di L. monocytogenes rende estremamente difficile la sua radicale eliminazione dal caseificio in quanto numerose sono le nicchie adatte alla sopravvivenza ed alla crescita di questo microrganismo. La ricerca di queste nicchie e dei potenziali veicoli di trasmissione, ed il loro controllo attraverso l applicazione di rigorose misure igieniche, permettono di perseguire l obbiettivo di prevenire o quantomeno di ridurre il rischio di contaminazione. Nel caso dei formaggi è stato evidenziato come le possibilità di contaminazione ambientali siano strettamente correlabili al tipo di prodotto ed alle caratteristiche fisico-chimiche e strutturali della crosta che possono favorire od inibire l insediamento di Listeria. Per alcuni prodotti, in particolare per i formaggi tipici in cui la microflora della crosta svolge un ruolo indispensabile per la maturazione, la sanificazione degli ambienti di stagionatura e la pulitura della crosta può portare tuttavia ad esiti contraddittori, in quanto se tali pratiche non sono correttamente eseguite, riducono da un lato la competizione naturale tra le flore superficiali e dall altro possono veicolare esse stesse la contaminazione crociata tra lotti diversi di produzione. Una forte sanitizzazione ad azione indifferenziata può eliminare tutti o parte dei microrganismi 5

8 interno Quaderno ricerca ok :58 Pagina 6 integrati, provocando difetti nella maturazione ed anche, paradossalmente, un possibile aumento della presenza di L. monocytogenes. L alterazione dell equilibrio microbico, con l eliminazione di una flora saprofitica competitiva, può rappresentare un rischio maggiore di ricontaminazione da parte di microrganismi ubiquitari ed opportunisti come Listeria (12-27). Nel caso del Gorgonzola, mantenendo pratiche un tempo comuni a molti formaggi che vedevano la produzione del formaggio separata da quella della sua stagionatura, è ancora molto diffusa la maturazione delle forme presso centri specializzati di stagionatura collettiva. Considerando questo aspetto dal punto di vista dell ecologia microbica, significa che si é spesso di fronte ad una duplice realtà ambientale: la fase produttiva e quella di stagionatura, con la fase di salatura che può avvenire in tutto o in parte in ognuna delle due situazioni. La separazione fisica tra ambienti di produzione e stagionatura, collegati pur sempre dalle fasi di trasporto delle forme e di gestione dei materiali (es. fascette) comporta problematiche diverse per quanto riguarda la comprensione delle possibili fonti di contaminazione e soprattutto per identificare efficaci strategie di prevenzione, controllo o eliminazione delle stesse. Se lo scrupoloso rispetto delle Norme di buona fabbricazione può essere efficacemente perseguito in fase di produzione di Gorgonzola, l identificazione di Norme di buona fabbricazione altrettanto efficaci ed applicabili è molto più difficilmente ottenibile in fase di salatura e stagionatura, dove le peculiari caratteristiche dell ecosistema ambientale e delle procedure tecnologiche applicate influenzano e determinano il microecosistema che si instaura alla superficie del formaggio e che ne è parte essenziale. Il ritrovamento di L. monocytogenes negli ambienti di produzione e sulla crosta del formaggio Gorgonzola, anche se con sempre minore frequenza grazie agli sforzi operati dai singoli produttori per migliorare l igiene di processo, è un inconveniente che periodicamente tende a ripresentarsi e che rappresenta un fattore di preoccupazione per il Consorzio di Tutela. In conseguenza del saltuario ma costante rinvenimento di L. monocytogenes, germe patogeno la cui riconosciuta pericolosità è oggetto di attenzione da parte delle Autorità Sanitarie, considerata l importanza commerciale del Gorgonzola per il comparto caseario nazionale, essendo uno dei formaggi DOP italiani maggiormente conosciuti ed apprezzati in tutto il mondo, il Consorzio di Tutela del Gorgonzola e la Regione Lombardia hanno quindi co-finanziato il Progetto di ricerca GOLIS, svolto in collaborazione con l Istituto Sperimentale Lattiero Caseario di Lodi. 6

9 interno Quaderno ricerca ok :58 Pagina 7 Finalità della ricerca Gli obiettivi del progetto GOLIS sono stati finalizzati a definire l attuale grado di diffusione di L. monocytogenes sulla superficie del formaggio Gorgonzola e negli ambienti di produzione e stagionatura, ed a valutare sistemi idonei e razionali per contenere e/o ridurre il rischio e soprattutto compatibili col mantenimento della tipicità del prodotto stesso. La ricerca è stata volutamente limitata alla verifica della presenza di L. monocytogenes sulla crosta del formaggio e negli ambienti di produzione, e non ha coinvolto anche la pasta del formaggio, in quanto la pastorizzazione del latte permette l eliminazione di Listeria e quindi l eventuale ritrovamento nella pasta è da ascrivere a carenze nella gestione della pastorizzazione, aspetto che in caso riguarderebbe le pratiche del singolo caseificio, e non rappresenta una problematica di interesse comune di tutti i produttori. 7

10 interno Quaderno ricerca ok :58 Pagina 8 Articolazione della ricerca 8 Per affrontare quindi la problematica di comprendere e dimostrare l origine del problema L. monocytogenes sulla crosta del formaggio Gorgonzola al fine di prevenirne l insorgenza o quantomeno ridurne l incidenza, si è previsto di articolare la ricerca secondo queste linee principali: 1. Valutazione della presenza di L. monocytogenes sulla crosta del formaggio e negli ambienti di stagionatura, anche in funzione di caratteristiche chimico-fisiche e microbiologiche associabili alla tecnologia di produzione del formaggio; 2. Valutazione del comportamento di L. monocytogenes sul formaggio durante il periodo di conservazione commerciale; 3. Caratterizzazione dei ceppi di L. monocytogenes isolati dalla superficie di formaggio Gorgonzola; 4. Valutazione dell origine del problema L. monocytogenes negli ambienti di produzione e stagionatura: indagine sui possibili punti di contaminazione 5. Valutazione sperimentale dell impiego di nuove metodologie e tecniche per ridurre e/o eliminare L. monocytogenes dalla superficie del Gorgonzola. In questo modo, unitamente alla volontà da parte dei soggetti finanziatori di valorizzare e migliorare questo prodotto DOP, si è voluto ribadire l impegno e la sensibilità sia dell organismo di tutela che della Regione Lombardia nei confronti non solo dei produttori ma anche dei consumatori. 1. Valutazione della presenza di L. monocytogenes sulla crosta del formaggio e negli ambienti di stagionatura, anche in funzione di caratteristiche chimico-fisiche e microbiologiche associabili alla tecnologia di produzione del formaggio Introduzione La valutazione dell incidenza attuale del problema L. monocytogenes nella produzione del formaggio Gorgonzola è stata eseguita partendo dalla premessa che l habitat favorevole alla colonizzazione da parte di batteri ubiquitari e resistenti come L. monocytogenes sia essenzialmente la crosta e che quindi la contaminazione superficiale possa avvenire in seguito a trasmissione del germe per contatto del formaggio con ambienti o materiali contaminati in seguito a pratiche erronee degli operatori. A tal fine, poiché le metodiche di campionatura ufficiale dei formaggi (25 g di formaggio con pasta e crosta) non sarebbero state sufficienti a permettere di verificare in modo efficiente la presenza di quantità anche minime di Listeria sul formaggio o negli ambienti, si è studiato e messo a punto un sistema di campionatura della crosta, considerata come una sorta di carta d identità dell intero processo nei suoi molteplici aspetti. Il campionamento è stato basato sulla raccolta, per raschiatura, dell intero strato superficiale di almeno dieci forme diverse di uno stesso lotto di Gorgonzola. Per accertare la validità del tipo di prelievo e confermare di non essere incorsi in una eventuale sottostima del grado di contaminazione a seguito ad esempio del mancato recupero di cellule situate nell immediato sottocrosta si è inoltre proceduto per

11 interno Quaderno ricerca ok :58 Pagina 9 circa il 50% dei campioni ad un secondo campionamento prelevando in parallelo anche campioni di crosta da forme diverse dello stesso lotto. Risulta quindi evidente che le percentuali di ritrovamento di Listeria in questi campioni non corrispondono a percentuali di presenza nel formaggio, ma indicano la percentuale dei caseifici o degli stagionatori nei quali Listeria è ritrovabile, senza alcuna correlazione con la percentuale di forme eventualmente contaminate: è evidente infatti che una sola colonia di Listeria su una forma, che normalmente potrebbe sfuggire al controllo ufficiale, origina con questo tipo di prelievo un campione positivo. Per la finalità della ricerca, ovvero di verificare l ubiquitarietà di Listeria ed identificare in quali ambienti crei le sue nicchie di sopravvivenza o crescita, era quindi fondamentale monitorare la frequenza del ritrovamento di Listeria nel sistema produttivo del Gorgonzola. In collaborazione con il Consorzio di Tutela, è stato elaborato un piano di campionamento che ha coinvolto tutte le aziende associate. Inoltre, per poter meglio valutare se la tipologia di Gorgonzola, dolce o piccante, potesse avere un influenza sulla possibile contaminazione da L. monocytogenes, si è ulteriormente ampliato il campionamento procedendo al prelievo separato di entrambe i tipi. Sui campioni di crosta prelevati sono state effettuate anche una serie di analisi microbiologiche e chimico-fisiche, e sono state inoltre raccolte una serie di informazioni (data di produzione; tipo di prodotto; tipo di crosta umida o asciutta; colore) ritenute utili per cercare di comprendere se e quali caratteristiche del prodotto potessero essere in qualche modo correlate con la presenza di L. monocytogenes. Metodologia Sono stati analizzati 96 campioni (84 campioni da Gorgonzola di tipo dolce; 12 da Gorgonzola di tipo piccante) prelevati dalle superfici di formaggi di 42 aziende (caseifici e stagionatori). Per talune aziende il prelievo è stato ripetuto più volte. Nel dettaglio: 65 campioni costituiti dalla raschiatura di almeno 10 forme per ogni produttore; 31 campioni costituiti da miscele di croste di 2-3 mm di spessore prelevate da forme diverse dello stesso lotto da cui sono stati prelevati i campioni precedenti. La ricerca di L. monocytogenes è stata effettuata in 25 g di prodotto, subcampionato da ognuno dei 96 campioni, secondo il metodo FIL-IDF 143A:1995 parzialmente modificato ed implementato: arricchimento selettivo primario in Buffered Listeria Enrichment Broth (BLEB; Oxoid), incubazione a 30 C per 24 ore sottoarricchimento in 10 ml di BLEB, incubazione a 30 C per 24 ore isolamento selettivo su Palcam agar (Oxoid) e Aloa agar (Biolife), incubazione a 37 C per 48 ore identificazione delle colonie sospette di L. monocytogenes sia con tests biochimici (attività biochimiche specifiche valutate con Mono Confirm Test Biolife; attività aminopeptidasica specifica con test rapido su dischetti Monocytogenes ID Disc Biolife) e fisiologici (colorazione di Gram; catalasi; mobilità), sia con analisi PCR specie-specifica utilizzando un kit commerciale (BAX, Qualicon). 9

12 interno Quaderno ricerca ok :58 Pagina 10 Altre analisi microbiologiche: Conta di L. monocytogenes su ALOA agar a 37 C per 48 ore Enterococchi su Kanamicyn Aesculine Azide agar (KAA, Oxoid), a 42 C per 48 ore Batteri alofili su Tryptone Soya agar (TSA, Oxoid) con 5% di NaCl, a 30 C per 48 ore Lieviti e muffe su Yeast Glucose Chloramphenicol agar (YGC, Fluka), a 25 C per 5 giorni Ricerca di microflore ad attività inibente specifica verso L. monocytogenes con il metodo dell agar doppio strato: - le piastre di KAA, TSA, YGC dopo crescita rispettiva di enterococchi, alofili, lieviti e muffe sono state ricoperte con uno strato di 6 TSA molle (agar 6 g/l) inoculato con L. monocytogenes (10 ufc/ml) - dopo solidificazione le piastre sono state incubate a 37 C per 24 ore - sulla patina di L. monocytogenes si sono ricercati aloni di inibizione, espressione di una attività inibente specifica, in corrispondenza delle colonie sottostanti. Ricerca di attività inibente aspecifica verso L. monocytogenes: - gli omogenati dei campioni (10 g di campione in 90 g di sodio citrato 2%) sono stati strisciati su TSA e incubati a 37 C per 24 ore - gli strisci sono stati ricoperti con uno strato di TSA molle (agar 6 6 g/l) inoculato con L. monocytogenes (10 ufc/ml) - dopo solidificazione le piastre sono state incubate a 37 C per 24 ore - sulla patina di L. monocytogenes si è ricercata la presenza di un alone di inibizione in corrispondenza degli strisci, espressione di una attività inibente microbica aspecifica Ricerca di sostanze inibenti L. monocytogenes presenti nei campioni di crosta: - gli omogenati dei campioni sono stati centrifugati e filtrati (filtri con pori di diametro 0.45 mm) per rimuovere le cellule 6 - in TSA inoculato con L. monocytogenes (10 ufc/ml), dopo solidificazione, sono stati praticati dei pozzetti riempiti poi con il filtrato - dopo incubazione a 37 C per 24 ore si è ricercata la presenza di un alone di inibizione attorno ai pozzetti, determinato dalle eventuali sostanze inibenti presenti nel filtrato Analisi fisico-chimiche sostanza secca (28 campioni) per essiccamento di 3 g di campione a 102 C fino a peso costante NaCl (25 campioni) per titolazione indiretta dei cloruri. ph (52 campioni) con ph-metro corredato di elettrodo per misure in superficie. attività dell acqua (a w) (40 campioni) con analizzatore di acqua libera AquaLab CX-3 acido lattico residuo (11 campioni) mediante HPLC secondo il metodo descritto da Bouzas et al. (28). Risultati Il confronto tra i due metodi di campionatura della crosta del Gorgonzola (raschiatura della patina superficiale ed asportazione di uno strato sottile di crosta) ha evidenziato una perfetta coerenza dei risultati e quindi ha confermato la validità del metodo di prelievo per raschiatura superficiale: tale metodo ha il vantaggio di essere non distruttivo e può quindi essere applicato nel campionamento di formaggi in corso di maturazione. 10

13 interno Quaderno ricerca ok :58 Pagina 11 Frequenza di campioni di crosta di Gorgonzola risultati positivi per Listeria 27% Listeria spp. % 26% 47% L. monocytogenes Influenza del tipo di prodotto sulla presenza di Listeria dolce L. monocytogenes Listeria spp. La presenza di L. monocytogenes negli ambienti di stagionatura del formaggio Gorgonzola è stata confermata in oltre il 60% delle aziende, mentre Listeria spp. è stata ritrovata nel 95% delle aziende. Nel caso di aziende risultate negative anche a Listeria spp. (non patogene ma che possono essere considerate come indici del livello di insediamento nell ambiente di specie appartenenti a questo genere), i campionamenti sono stati ripetuti più volte per verificare se ci fossero elementi di processo o strutturali legati all assenza di Listeria. In tal modo il numero di campionamenti (96) è risultato superiore al numero delle aziende coinvolte (42). L. monocytogenes è stata ritrovata quindi nel 47% dei campioni, mentre Listeria spp. in un ulteriore 26%. Il 27% dei campioni è risultato negativo. La percentuale di campioni negativi non è quindi in relazione al numero di aziende in cui non è presente Listeria, mentre è in relazione con la probabilità o la frequenza di contaminazione della crosta del formaggio. Questi risultati non rivestono, a nostro parere, un carattere di eccezionalità in quanto è noto che questi microrganismi, proprio per la loro ubiquitarietà, trovano un habitat adeguato negli ambienti di stagionatura di formaggi come il Gorgonzola ed altri similari. Inoltre, il tipo di campionamento piccante effettuato ha permesso di esplorare, in modo molto capillare, il grado di insediamento nell ambiente: la superficie dei formaggi, particolarmente ricettiva per le frequenti manipolazioni a cui è sottoposta durante la stagionatura, è stata di fatto utilizzata come una superficie di elezione il più possibile rappresentativa dello stato di contaminazione ambientale. I dati ottenuti giustificano quindi il saltuario rinvenimento da parte dei laboratori di controllo di campioni di formaggio Gorgonzola positivi per presenza di L. monocytogenes, quando l analisi è fatta a partire da campioni con crosta. % Influenza del periodo di stagionatura sulla presenza di Listeria < > 80 giorni di stagionatura Nonostante le differenze di modo di fabbricazione e di condizioni di stagionatura del Gorgonzola dolce e piccante, a differenza di quanto ci si sarebbe potuti attendere, non si sono rilevate differenze significative nel livello di contaminazione delle superficie dei formaggi. Il rischio di contaminazione superficiale pare pertanto similare per le differenti tipologie di prodotto. L analisi dei risultati dell incidenza di Listeria non ha inoltre evidenziato differenze direttamente asso- 11

14 interno Quaderno ricerca ok :58 Pagina grigio/asciutte Influenza del tipo di crosta sulla presenza di L. monocytogenes 14% ciabili alla durata della stagionatura del formaggio. La distribuzione della positività in base ai giorni di stagionatura deve essere tuttavia valutata con cautela in quanto non è stato possibile realizzare un campionamento che prevedesse lo stesso numero di campioni per ogni gruppo di durata di stagionatura. La non evidenziazione di un legame diretto tra tempo di stagionatura e positività per Listeria è coerente per altro con la mancata differenziazione tra incidenza di Listeria sulle croste di Gorgonzola dolce e piccante, caratterizzati anche da lunghezze diverse della stagionatura. 86% arancio/umide Comparando invece le caratteristiche esteriori del formaggio (aspetto e colore della crosta, legati quindi alla tipologia di flora superficiale) con i dati di presenza o assenza di Listeria è stato possibile osservare che i formaggi con crosta più umida e di colore arancio (associabile a presenza prevalente di flora batterica cromogena e lieviti) presentano una maggiore incidenza di L. monocytogenes, mentre le croste più asciutte e poco pigmentate di colore grigiobiancastro (non associabile tuttavia ad una presenza prevalente di flora fungina), sono risultate quelle meno frequentemente contaminate. Tale risultato è stato confermato considerando le caratteristiche delle croste di quel 27% di campioni dove Listeria è risultata assente: l 88% di questi campioni infatti presentava una crosta asciutta e l 82% una crosta comunque poco pigmentata all arancio. Quindi, croste asciutte e che non presentano una patina colorata tipica di una proliferazione di flore microbiche di superficie sembrano essere indicative di condizioni potenzialmente sfavorevoli alla colonizzazione o persistenza di Listeria. La quantificazione del livello di contaminazione ambientale nelle diverse aziende, almeno nel periodo del prelievo, ha evidenziato che Listeria spp. è presente in numero variabile compreso tra < 10 UFC/g 4 (limite minimo del metodo di conta adottato) e 1.8 x 10 UFC/g. Dei 45 campioni risultati positivi per L. monocytogenes, il 19% ha presentato 3 cariche < 10 UFC/g, mentre il 40% ha mostrato cariche > 1.0 x 103 UFC/g. Dato che i campioni, come detto, erano costituiti esclusivamente di croste del formaggio, peraltro raccolte da più forme diverse dello stesso lotto, le cariche rilevate dimostrano che i livelli di contaminazione della superficie del formaggio, e quindi di riflesso quella degli ambienti di stagionatura, non sono particolarmente elevati. Caratteristiche della microflora della crosta del Gorgonzola e presenza di Listeria La ricerca quantitativa dei gruppi microbici caratteristici della popolazione della crosta ha evidenziato che i microrganismi alofili (corynebatteri e micrococcaceae), i lieviti e le muffe sono le microflore numericamente più rappresentate; gli enterococchi sono risultati i più variabili sia per presenza che in relazione al valore numerico di tale presenza. Non è stato comunque possibile correlare le caratteristiche del tipo di formaggio (dolce o piccante), del tipo di crosta (umida o asciutta) o del periodo di stagionatura con microflore specifiche, ad eccezione

15 interno Quaderno ricerca ok :58 Pagina 13 enterococchi muffe alofili lieviti Microflore di crosta 0% 20% 40% 60% 80% 100% % di campioni delle muffe. Molti dei campioni risultati negativi per L. monocytogenes presentavano infatti valori di muffe più elevati. Al momento tuttavia non si hanno comunque elementi per comprendere l origine ed il significato di tale risultato, in quanto la carica in muffe non è correlabile né con il tempo di stagionatura, né con il tipo di formaggio (dolce o piccante), né con il tipo di crosta, nonostante la relazione osservata precedentemente tra aspetto poco pigmentato ed asciutto della crosta e Listeria. Relazioni tra Listeria e presenza di microflore in grado di esercitare una attività antimicrobica specifica o aspecifica La ricerca fra le microflore di log UFC/g crosta di batteri in grado di esercitare < 3,0 una specifica attività anti-listeria 3,0-5,0 è risultata positiva in 18 campioni. Tale attività è stata individuata solo 5,0-7,0 fra la microflora alofila, mentre fra 7,0-8,0 lieviti, muffe, ed enterococchi non 8,0-9,0 è mai stata evidenziata nessuna colonia avente effetto inibente. Nonostante > 9,0 questo, quasi tutti i campioni che presentavano tra la microflora alofila ceppi in grado di esprimere in vitro una attività antimicrobica erano risultati positivi per L. monocytogenes e/o Listeria. La simultanea presenza di Listeria e di microrganismi che possiedono la capacità di inibirla non rappresenta necessariamente un controsenso; è stato infatti osservato in precedenti lavori di ISLC dedicati alla contaminazione superficiale di formaggi a crosta lavata che uno dei fattori in grado di influenzare tale comportamento è il momento in cui si realizza la contaminazione del formaggio. Se la contaminazione avviene durante le prime fasi della stagionatura, Listeria può colonizzare la crosta senza che lo sviluppo di altre microflore di superficie, anche potenzialmente inibenti, riesca ad impedirne l insediamento. Per contro è stato rilevato che le possibilità di colonizzazione della crosta da parte di Listeria diminuivano se la contaminazione avveniva tardivamente quando oramai le flore di superficie si erano ben sviluppate (29). In base a queste evidenze sperimentali si potrebbe quindi sostenere che la contaminazione dei Gorgonzola studiati sia avvenuta già durante le prime fasi della stagionatura. È possibile tuttavia considerare anche un altra ipotesi legata alla modalità di crescita di Listeria e delle flore potenzialmente inibenti sulla crosta del formaggio: nel momento in cui è accettabile l ipotesi, visto la carica numerica limitata, che tali flore siano organizzate in microcolonie sulla crosta del formaggio, può anche venire meno la possibilità di contatto diretto tra flora inibente e Listeria. Tale ipotesi aveva per altro portato alcuni produttori di starter a commercializzare colture sussidiarie di enterococchi produttori di batteriocine, basandosi sul presupposto che una presenza più numerosa di ceppi potenzialmente inibenti potesse rappresentare uno strumento efficace per bloccare la crescita di Listeria. Per verificare quindi la possibile presenza sulla crosta di batteriocine o comunque di sostanze inibenti preformate è stata ricercata la presenza di una attività antimicrobica aspecifica nei confronti di L. monocytogenes. A tal fine, l omogenato di ogni campione, privato delle cellule per filtrazione, è stato messo in contatto con colture di Listeria isolate da Gorgonzola medesimo. Il metodo utilizzato non ha in nessun caso evidenziato presenza di metaboliti naturali, o di sostanze 13

16 interno Quaderno ricerca ok :58 Pagina 14 ancora attive eventualmente aggiunte per il risanamento della superficie dei formaggi, che potessero spiegare alcuno dei casi di negatività rilevati. Caratteristiche chimico-fisiche delle croste e relazione con la presenza di Listeria Al fine di valutare l esistenza di altri elementi, non di natura strettamente microbiologica, che potessero essere in qualche modo correlati con la presenza di Listeria sulla superficie dei diversi formaggi analizzati e quindi permettere di intravedere strategie utili al suo controllo, si sono effettuate su un numero mirato di campioni di croste analisi chimico-fisiche relative al contenuto di NaCl, a w, ph e contenuto di acido lattico. Contenuto di sale. La % di sale, espressa sulla sostanza secca, è risultata molto variabile, oscillando tra 1.2 e 6.3% a testimonianza della diversità delle pratiche di cura dei formaggi in magazzino e dell aspetto delle croste. La presenza di Listeria non è tuttavia risultata correlabile al diverso contenuto di sale, essendo stata ritrovata in campioni sia a basso che ad alto contenuto di NaCl. Questi dati confermano per altro quanto noto dalla letteratura che riporta per L. monocytogenes la capacità di crescere anche in presenza di concentrazioni di sale superiori al 10% (9). Attività dell acqua (a w ). I valori rilevati sono risultati compresi tra 0.91 e Per L. monocytogenes è noto che il limite minimo di a w per la sua crescita è ; al di sotto di questi valori, o con questi valori ma a temperature di refrigerazione, si determina un effetto batteriostatico (8). L attività dell acqua è la misura dell acqua libera disponibile in un alimento che può essere utilizzata dai microrganismi per il loro metabolismo. Questo parametro diminuisce all aumentare della concentrazione di soluti (es. sali, zuccheri) che sequestrando l acqua libera diminuiscono il valore dell a w. Nonostante alcuni campioni presentassero valori di a w prossimi a quelli limitanti, non si sono evidenziate correlazioni con la presenza di Listeria, a testimonianza di quanto la matrice reale spesso diverga dai modelli e di come i modelli richiedano procedimenti accurati di validazione. ph. I valori di ph delle croste sono risultati compresi tra 5.6 e 8.1. La presenza di Listeria non è risultata correlata a questo parametro: si sono ritrovati infatti campioni negativi per Listeria con ph > 7.0 (ottimale per la crescita di questo patogeno) così come campioni positivi con ph 5.6. Dalla letteratura è peraltro noto che L. monocytogenes può sopravvivere in un intervallo di ph compreso tra 4.0 e 9.2 (8, 9). Acido lattico. Il dosaggio dell acido lattico è stato effettuato su alcuni campioni (sia negativi che positivi per Listeria) per cercare di comprendere se vi fossero relazioni tra la concentrazione di acido e la presenza del patogeno. Le quantità di acido lattico sono risultate comprese tra < 0.05% e 0.3%, e campioni negativi per Listeria sono stati ritrovati anche fra quelli con contenuto di acido lattico più elevati. Si è proceduto inoltre ad una valutazione stratigrafica su due ottavini di Gorgonzola, eseguendo dosaggi su strati contigui prelevati dall esterno verso l interno (crosta - sottocrosta - parte mediana - parte interna). Anche in questo caso la crosta è risultata la parte con il minore contenuto di acido lattico residuo, circa 0.05%, probabilmente dovuta all utilizzo dei lattati da parte della flora 14

17 interno Quaderno ricerca ok :58 Pagina 15 eumicetica di superficie. La maggior presenza di acido lattico nella pasta di formaggi ormai a fine stagionatura (concentrazioni fino a circa 0.5%) potrebbe dimostrare che, durante la maturazione, nelle zone interne del formaggio permane un gradiente di acido lattico potenzialmente in grado di contrastare una eventuale contaminazione che potrebbe essere veicolata dall esterno. Al contrario presenze elevate di acido lattico sulla crosta, come alcune di quelle rilevate (0.3%) potrebbero indicare una differente presenza di flora superficiale o l utilizzo di pratiche di trattamento superficiale delle croste. Anche se elevati residui di acido lattico sulla crosta potrebbero esercitare effetti inibenti nei confronti di Listeria, non sembra comunque che questo possa essere un elemento in grado di garantire da solo l assenza del patogeno. Considerazioni conclusive I risultati di questa indagine hanno confermato che la presenza di Listeria spp. è un problema per il formaggio Gorgonzola. Il ritrovamento di L. monocytogenes nel 47% dei campioni di crosta esaminati, che supera il 70% se si considerano tutti i campioni positivi per Listeria spp., è indicativo di un problema diffuso di contaminazione ambientale che non riguarda solo alcune aziende, ma è pressoché generalizzabile. Il tipo di campionamento effettuato (raschiatura della patina o strati di crosta prelevati da più forme) ha permesso di rendere estremamente sensibile la valutazione della presenza di Listeria e L. monocytogenes negli ambienti del Gorgonzola; allo stesso tempo è importante ribadire che, a causa delle modalità di campionamento (raschiatura dell intera crosta da 10 forme), sarebbe erroneo cercare di trasferire e sovrapporre i risultati ottenuti in questa ricerca a quelli recuperabili dalle risultanze delle analisi ufficiali. Il tipo di campionatura effettuata ha permesso di ottenere utili informazioni relative alla presenza del pericolo L. monocytogenes ma non fornisce e non voleva fornire elementi di analisi del rischio. Inoltre, la dichiarazione di non edibilità della crosta ha comportato l assenza della stessa nell esecuzione delle analisi di controllo, almeno in Italia: questo fa sì che qualora si ritrovi L. monocytogenes nella pasta del formaggio, evento la cui probabilità è estremamente ridotta, sia facilitata la ricerca delle cause determinanti, cosa prima di fatto impossibile in quanto con l analisi contemporanea di pasta e crosta, le motivazioni della positività erano associate, probabilisticamente ed a ragione, alla crosta e questo poteva portare a sottovalutare deviazioni dalle Norme di buona fabbricazione. I risultati ottenuti sono utili perchè sgombrano il campo ad esempio da possibili erronei convincimenti, quali quello che il microrganismo sia presente solo in alcune strutture produttive e quindi da ricondurre semplicisticamente ad erronee procedure di sanificazione aziendale. L. monocytogenes rappresenta invece un pericolo caratteristico per la produzione di Gorgonzola e si devono individuare i punti della linea di produzione critici per la contaminazione e quali procedure di produzione e stagionatura possano ridurre la presenza ambientale e l eventuale colonizzazione della crosta (16, 30-32). 2. Valutazione del comportamento di L. monocytogenes sul formaggio durante il periodo di conservazione commerciale. Introduzione Nonostante nel disciplinare di produzione sia stata dichiarata la non edibilità della crosta del Gorgonzola, questo non significa che debbano venire meno l attenzione e gli sforzi per 15

18 interno Quaderno ricerca ok :58 Pagina 16 ridurre l incidenza della presenza di L. monocytogenes negli ambienti di caseificio e quindi sulla crosta del formaggio. Le motivazioni per cui la non edibilità della crosta non corrisponde, e non vuole corrispondere, alla soluzione pratica del problema Listeria sono molteplici e fra queste assume importanza la volontà di verificare se esiste un rischio associato alla fase di conservazione del Gorgonzola allo stato porzionato e preconfezionato. Si è ritenuto infatti di valutare la capacità di L. monocytogenes di sopravvivere o sviluppare sul formaggio stagionato pronto per la vendita, per comprendere se la fase di commercializzazione del prodotto possa rappresentare un momento di aumento del rischio igienico sanitario. Il Gorgonzola prima di essere commercializzato viene sottoposto ad una serie di interventi quali, il taglio (in 2 parti nel caso di vendita di forme intere), il porzionamento meccanico (in numerose fette nel caso di vendita di prodotto preconfezionato), ed il confezionamento (manuale o automatico), che possono esporre la pasta del formaggio ad una contaminazione per trascinamento dalla crosta eventualmente contaminata, sia direttamente dalla crosta sulla pasta, sia in forma crociata tra formaggi diversi in quanto veicolata dalle lame e dalle parti di attrezzatura con cui le diverse forme entrano in contatto. L entità del potenziale rischio igienico che un eventuale contaminazione della pasta del formaggio potrebbe rappresentare, è stata quindi studiata sia verificando la sopravvivenza di L. monocytogenes in formaggi porzionati e confezionati direttamente in azienda e pronti per essere commercializzati, sia valutando la cinetica di crescita sulla pasta di formaggi artificialmente contaminati in laboratorio, e conservati nelle condizioni tempo/temperatura normalmente consigliate per la commercializzazione del prodotto finito. Metodologia Formaggio naturalmente contaminato. Da una forma precedentemente risultata positiva per L. monocytogenes sulla crosta, dopo porzionatura meccanica e confezionamento automatico in azienda, sono state prelevate 12 porzioni e conservate in laboratorio a 6±2 C per 40 giorni. La ricerca di L. monocytogenes è stata effettuata in modo separato su crosta e pasta (arricchimento in BLEB a 30 C per 24 ore, isolamento su ALOA agar dopo 48 ore a 37 C). Formaggio artificialmente contaminato. Da Gorgonzola maturi di 5 aziende diverse, sono state prelevate asetticamente in laboratorio, e disposte in contenitori sterili, porzioni di crosta e di pasta. Ogni porzione di pasta e di crosta 4 è stata inoculata con circa 10 UFC/g di L. monocytogenes (miscela di ceppi isolati in precedenza da Gorgonzola) e poi conservati a 6±2 C per 5 settimane. La carica di L. monocytogenes nei campioni di pasta e di crosta artificialmente contaminati è stata determinata con frequenza settimanale (terreno selettivo ALOA agar, incubazione a 37 C per 48 ore). Campioni di pasta e di crosta non con aminati, ma conservati nelle stesse condizioni, venivano prelevati ed utilizzati per determinare ph, a, sostanza secca, sale. Risultati La ricerca di L. monocytogenes nelle 12 porzioni ottenute da una forma naturalmente contaminata in superficie, dopo w 16

19 interno Quaderno ricerca ok :58 Pagina 17 ufc/g ufc/g 1,00E+08 1,00E+07 1,00E+06 1,00E+05 1,00E+04 1,00E giorni di conservazione a 6±2 C, ha indicato che Listeria è in grado di sopravvivere alle normali condizioni di conservazione domestica. L analisi differenziata di crosta e pasta ha permesso di evidenziare che il patogeno era presente solo sulla crosta di 4 porzioni (il 33% delle porzioni esaminate), mentre i campioni di pasta sono sempre risultati negativi. In questo caso quindi, come nella maggioranza dei casi, non c è stata veicolazione della contaminazione dalla crosta alla pasta durante le fasi di porzionamento. Interessante tuttavia è la conferma sia della capacità di sopravvivenza che della distribuzione casuale di Listeria sulla crosta. Per verificare tuttavia quanto potesse accadere nella ipotesi che Listeria fosse veicolata sulla pasta, sono state assunte le condizioni più sfavorevoli (il cosiddetto worst case scenario) deducibili dalle esperienze in corso, 4 combinando la contaminazione media più elevata della crosta (10 UFC/g) con l ipotesi che l intera popolazione sia veicolata dalla crosta sulla pasta. I tests con i 5 differenti formaggi così contaminati hanno dimostrato che nelle condizioni di temperatura e durata di conservazione osservate, L. monocytogenes è capace di crescere sulla pasta da 10 fino a 1000 volte rispetto alla carica di partenza e che quindi una eventuale contaminazione della pasta del Gorgonzola espone il prodotto ad un rischio molto elevato. Il comportamento di L. monocytogenes aggiunta sulla crosta è risultato invece decisamente diverso e più variabile, suggerendo un possibile effetto della matrice di crescita legata ad interazioni con le altre microflore. Solo in 3 croste su 5 è stata infatti registrata una crescita, risultata inoltre molto più contenuta (incremento < a 10 Sviluppo di L. monocytogenes sulla pasta di Gorgonzola diversi conservati a 6 C. A B C D E Gorgonzola Sviluppo di L. monocytogenes sulla crosta di Gorgonzola diversi conservati a 6 C. 1,00E+08 1,00E+07 1,00E+06 1,00E+05 1,00E+04 1,00E+03 A B C D E Gorgonzola 1a settimana 5a settimana 1a settimana 5a settimana volte la carica iniziale) rispetto a quanto rilevato sulla pasta. I motivi della crescita differente di L.monocytogenes quando inoculata sulla crosta o sulla pasta non sono spiegabili solo in base alle caratteristiche chimicofisiche (a, % NaCl, w ph) dei prodotti ed alla loro variazione nel corso della conservazione. Le differenze rilevate non sono state di particolare rilievo e comunque non sufficie nti singolarmente per poter giustificare il diverso comportamento di L. monocytogenes. - I valori di acqua libera della pasta (tra e 0.978) e della crosta (tra e 0.973), non soggetti a variazioni particolari durante la conservazione, non 17

20 interno Quaderno ricerca ok :58 Pagina 18 Nonostante sia stata effettuata solo una prova di conservazione di porzioni ottenute da formaggi naturalmente contaminati, l aver ritrovato la contaminazione solo sulla crosta di alcune delle porzioni ed in nessun caso sulla pasta è indicativo del fatto che il trascinamento, anche se possibile, non è scontato, in quanto dipende dal livello di contaminazione della crosta e dalla organizzazione in microcolonie o in patina diffusa di Listeria sulla crosta. Se infatti la contaminazione è minima e a localizzazione puntiforme, la probabilità che gli organi di taglio trascinino alcune cellule dalla crosta sulla pasta è minore. Queste fasi finali di lavorazione del prodotto non si possono comunque considerare esenti da rischio in quanto, come dimostrato dalle prove di contaminazione artificiale, se Listeria arriva in contatto con la pasta del Gorgonzola, questa rappresenta un substrato idoneo per il suo sviluppo. Le condizioni di refrigerazione sia nella catena distributiva che a livello di conservazione domestica, ed i tempi di conservazione del prodotto preconfezionato normalmente adottati per il periodo di commercializzazione non sono tali da evitare che il pericolo rappresentato da alcune cellule eventualmente trascinate dalla crosta possa trasformarsi in un rischio per la salute del consumatore. La temperatura di conservazione del formaggio può assumere tuttavia un ruolo importante nel rallentare la crescita di L. monocytogenes, se si considera che, come riportato in letteratura, il tempo necessario per la duplicazione cellulare diventa sempre più breve all aumentare della temperatura: nell intervallo compreso tra 2.5 C e 9.3 C ad esempio, temperature riscontrabili normal- sono mai risultati limitanti la crescita di L. monocytogenes (in grado di crescere con valori di a w > 0.91). Si è osservata tuttavia una diversità dei valori di a w della crosta rispetto a quelli prima indicati, che è dovuta alla diversa natura del campione analizzato: in questo caso è stata analizzata una crosta con spessore di circa 4-6 mm, mentre nel l indagine precedente erano stati analizzati campioni di crosta ottenuti per raschiatura della superficie. - La percentuale di sale (sulla frazione umida del formaggio) è risultata compresa tra 1.6% e 5.1%, ben inferiore al valore del 10% riportato in letteratura quale concentrazione limite entro la quale L. monocytogenes riesce a crescere (9). - Il ph è il parametro che ha fatto registrare le maggiori variazioni in funzione sia del prodotto che della durata della conservazione. I campioni di pasta presentavano valori iniziali di ph più bassi e variabili (tra 5.48 e 7.24) rispetto alle rispettive croste (tra 7.60 e 8.03). Durante la conservazione, i diversi campioni di pasta hanno fatto registrare incrementi compresi tra 0.1 e 1.6 unità ph, mentre le croste, già inizialmente neutro alcaline, hanno presentato incrementi di ph più contenuti (tra 0.11 e 0.37 unità ph). Nonostante sulle croste si siano registrati i valori di ph più alti, e non siano state individuate condizioni inibenti la crescita, a questo non è corrisposto uno sviluppo di Listeria quantomeno analogo a quanto rilevato sulla pasta. Il contenimento della crescita sulla crosta è un risultato già riportato da altri studi su formaggi a crosta lavata, dove sono stati attribuiti alla presenza di un abbondante microflora di superficie, indipendentemente dalla proprietà dei singoli ceppi di produrre sostanze inibenti, effetti di antagonismo e/o competizione nei con fronti di L. monocytogenes (13, 29, 33). Considerazioni conclusive 18