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1 LabNews foglio di informazione del laboratorio di Patologia Clinica di Livorno direttore: Marcello Fiorini Antonio La Gioia Patrizia Petricci Fabrizio Torsi Siponta Vairo Viale Alfieri, Livorno e luci in sala si sono appena riaccese ed il brusio monta gradatamente mentre il moderatore, guardandosi intorno, pone la domanda di rito: ci sono domande su questa interessante relazione? Sullo schermo acceso resta l'ultima diapositiva: UNA RIFLESSIONE... IN ITALIA 2000 PERSONE CONTRAGGONO L'INFLUENZA SUINA E CI SI METTO- NO LE MASCHERINE; PERSONE HANNO L'INFE- ZIONE DA HIV E NON CI SI METTE IL PRESERVATIVO... E NEMMENO SI PENSA DI ORGA- NIZZARE UNA CAMPAGNA DI IN- FORMAZIONE PER LA PERCEZIO- NE DEL RISCHIO. Nessuno in sala dà una risposta alla domanda implicita della relatrice (perchè?) anche se tutti sanno che quel perchè ha la sua spiegazione ed una collocazione geografica precisa in un punto d'italia identificato dalle coordinate 41 51' latitudine nord, 12 25' longitudine est ed in una realtà politica (e sociale) di abdicazione alla laicità dello stato. Quel perché angosciato, però, aveva una sua ragion d'essere descritto nel contenuto della bellissima relazione: soggetti HIV positivi in Italia; di questi soggetti (25%) non conoscenti del loro stato di sieropositività e, quindi, di trasmettitori inconsapevoli dell'infezione; incremento della incidenza e prevalenza dell'infezione; confine sempre più labile tra popolazione/comportamenti a rischio e popolazione/comportamenti normali quali ovvie conseguenze dei primi due punti di cui sopra. Eravamo ad Ancona, il 20 e 21 di ottobre al corso di sierologia (epatite - HIV) organizzato da Paola Pauri, corso che a me personalmente ha detto che non si finisce mai di imparare anche a 60 anni e che il miglioramento della qualità del servizio che i laboratori sono chiamati a dare, passa anche attraverso il confronto con le esperienze e le conoscenze altrui. Poi, dopo qualche settimana, l'ascolto distratto della radio durante il percorso casaospedale e viceversa mi ha per un po' illuso che l'ignavia imbelle ed ipocrita che condiziona i (non) programmi di prevenzione dell'infezione HIV fosse stata rotta dalla campagna di informazione avviata dal ministero della salute che invita a fare il test sierologico (gratuito e con garanzia dell'anonimato); ignavia ipocrita, appunto, perché prima dei programmi di screening (o insieme, almeno) sarebbero dovuti partire programmi di educazione e prevenzione che avrebbero dovuto avvertire dell'assottigliarsi del confine normale/a rischio e promuovere l'uso del profilattico come accorgimento più efficace contro la diffusione dell'infezione; ma in Italia la parola preservativo è tabù a meno che non significhi conservante per sughi e marmellate. Non ancora disilluso, mi sarei aspettato che gli ordini dei medici, le associazioni culturali e scientifiche, la libera stampa, le società scientifiche, la società civile consapevole, infine, avvertissero il peso deva- (Continua a pagina 9)

2 'attuale prevalenza della infezione da HIV si attesta, in Italia, intorno a casi ed appare in crescita per il verificarsi di circa 4000 nuovi casi/anno (uno ogni 2 ore!) ma anche per la migliore efficacia delle terapie antiretrovirali che rallentano sia la progressione verso la malattia conclamata sia la sopravvivenza dei soggetti con AIDS. Perché in Italia ogni 2 ore un adulto contrae l'infezione HIV? Risposta non facile, perché i fattori implicati sono molteplici e concorrono all'incremento della incidenza dell'infezione con una efficacia diversificata. Sicuramente risultano rilevanti i fattori sociali/comportamentali che hanno visto il progressivo spostamento da popolazioni a rischio socialmente marginate e quindi poco coinvolte (almeno in apparenza) nella diffusione esterna dell'infezione, verso categorie percepite come normali, sicuramente per questo più pericolose. Basti pensare a questo proposito che fino alla fine degli anni 90 la più frequente modalità di trasmissione era rappresentata dall'uso promiscuo di siringhe (55% circa) mentre attualmente sono i comportamenti sessuali quelli più implicati nella diffusione dell'infezione e, in questo ambito, si assottigliano progressivamente le differenze tra comportamenti etero ed omosessuali. In tale contesto di apparente normalizzazione l'esistenza di una popolazione di circa sieropositivi inconsapevoli rappresenta un fattore di enorme criticità e contestualmente il punto di intervento più efficace per il laboratorio di Patologia Clinica che nella promozione autonoma o istituzionale di programmi di screening può diagnosticare precocemente lo stato di sieropositività riportando soggetti potenzialmente inconsapevoli del loro stato di trasmettitori a comportamenti responsabili. Come è noto l'attuale normativa permette l'accesso alla diagnostica sierologica senza limitazioni, anche in assenza di prescrizione medica, gratuitamente e con garanzia dell'anonimato e della riservatezza dei dati personali. Proprio tale contesto obbliga il laboratorio, sul piano della competenza professionale, ad una gestione del soggetto che accede alla diagnostica sierologica HIV comprensiva non solo dei semplici dati analitici ma anche del counceling pre e post test che permettano sia la comprensione preventiva delle indagini di laboratorio sia le implicazioni personali e comportamentali di una eventuale positività ed il successivo indirizzamento alle strutture cliniche di riferimento (UU:OO: di Malattie Infettive). É obbligo del laboratorio, inoltre, una gestione esaustiva delle indagini sierologiche in modo da consegnare al richiedente una risposta chiusa e conclusiva che permetta in maniera univoca un giudizio di sieronegatività o sieropositività. Tale esigenza può essere compresa interamente all'interno di un unico laboratorio con l'uso di specifici algoritmi diagnostici ovvero può avvalersi del contributo di laboratori specialistici per eventuali test di conferma o per la ricerca quali/quantitativa della viremia. Sarebbe auspicabile in quest'ultimo caso che non sia consegnata all'utente una risposta interlocutoria, del tipo test di screening positivo/reattivo. Si consiglia test di conferma, ma che si preveda già in fase di prelievo l'invio, se necessario, dei materiali clinici ai centri di riferimento in una ottica di rete territoriale che eviti al cittadino inutili migrazioni in un contesto di ansia e di apprensione. Nuova gestione della diagnostica HIV presso il laboratorio dell'ospedale di Livorno. Counceling pre test. Il percorso diagnostico HIV sarà proposto gratuitamente a tutti coloro che ne facciano richiesta. L'anonimato e la riservatezza dei dati saranno garantiti dalla procedura di criptazione del nome attualmente in uso, corretta secondo le indicazioni normative che prevedono per la criptazione la terza lettera del cognome, la terza lettera del nome e la data di nascita. L'impossibilità di intercettare tutta l'utenza che accede alla diagnostica HIV ha suggerito la stesura di una nota informativa chiara ed esaustiva (ci auguriamo) utile a comprendere il significato dei test che saranno eseguiti, le implicazioni in caso di positività/negatività ed un piccolo dizionario cronologico. Tale nota sarà consegnata a tutti i richiedenti la diagnostica HIV presso i punti di prelievo del poliambulatorio e dei distretti. Il testo completo è alle pagg I MMG che ritenessero vantaggioso utilizzarlo per i propri pazienti possono richiederlo per mail agli indirizzi: Fase analitica. Verranno prelevate due provette: una per la ricerca sierologica ed una per l'eventuale viremia e verrà utilizzato il seguente algoritmo: 1. I test di screening. Ricerca simultanea di anti corpi e della proteina antigene p24 con metodica in chemiluminescenza di 4 a generazione. Il test negativo sarà refertato come tale accompagnato dal consiglio di ripetizione nel caso di precedente comportamento a rischio (vedi scheda counceling pre test) e comporterà la conclusione dell'algoritmo diagnostico test di screening. La positività del test pre cedente sarà seguita dalla esecuzione di un secondo test di screening di 4 a generazione con metodica ELFA, anch'esso sensibile agli anticorpi ed alla p Western-blot. La positività ai test di screening de-

3 ve essere confermata da un test di maggiore specificità quale la ricerca mediante tecniche di blottaggio di anticorpi anti antigeni virali specifici quali p24, gp41, gp120/160 o altri. Tale test può dare i seguenti risultati che, comunque non condizionano in maniera significativa il passaggio al test successivo: negativo. Con ogni probabilità le positività ai test di screening erano determinate dalla presenza della sola p24 (antigene) e precedevano lo sviluppo anticorpale. In questo caso si passa al successivo test di conferma; indeterminato. Idem come sopra con la differenza che in questo caso vi è sviluppo anticorpale ancora incompleto per soddisfare i criteri interpretativi di positività della WB; positivo. Il test è conclusivo per sieropositività HIV. Il test successivo è solo complementare e/o utile per definire la carica virale. 4. Ricerca dell'rna virale con tecniche di biologia molecolare. Tale indagine, se negativa nel caso di WB negativa o indeterminata definisce lo stato di falso positivo alle indagini di screening. Conferma lo stato di positività e quantifica la carica virale. Counceling post test. Rappresenta la delicata fase di comunicazione dello stato di sieropositività e sarà preceduta dal prelievo di un campione di sangue su cui eseguire estemporaneamente uno dei test di screening utilizzati nell'algoritmo precedentemente esposto per evitare l'improbabile ma non impossibile eventualità di errata associazione materiali/soggetto nel corso del primo accesso. Gli scopi del counceling post test sono rappresentarti essenzialmente dalla spiegazione del significato del risultato di laboratorio, dalla raccomandazione di osservare comportamenti relazionali che tengano conto dello stato di sieropositività, e dalla facilitazione nell'indirizzo del soggetto verso la struttura clinica di riferimento. (alg) Informazioni per gli utenti che richiedono test diagnostici per l'infezione da virus della immunodeficienza acquisita (HIV). Si prega di leggere con attenzione. Nel caso in cui fossero necessari ulteriori chiarimenti, è possibile contattare la segreteria del Laboratorio ( ) chiedendo un colloquio con i Dirigenti preposti. Lei ha richiesto un test diagnostico per conoscere il suo stato rispetto alla infezione da HIV. L'attuale normativa Nazionale e Regionale garantisce l'accesso a tale diagnostica a tutti i cittadini che ne facciano richiesta. Le indagini di laboratorio vengono eseguite rispettando il diritto all'anonimato ed alla protezione dei propri dati personali sensibili (diritto alla privacy). Proprio per questo motivo il prelievo che le sarà effettuato sarà identificato solo con una sigla che in nessun modo potrà essere successivamente associata ai suoi dati anagrafici. Allo stato attuale dell'arte nessun test di laboratorio da sé solo è tanto specifico da essere in grado di risultare negativo nel 100% dei casi negativi o, viceversa, tanto sensibile da essere positivo nel 100% dei casi positivi. Nel nostro laboratorio utilizziamo i migliori metodi attualmente disponibili che, ad esempio, hanno una specificità del 99.9% (un falso positivo ogni 1000); tuttavia, nella gestione di ogni singolo paziente utilizziamo più test allo scopo di dare una risposta conclusiva. In particolare vengono eseguiti il primo ed eventualmente uno o più dei successivi test: 1. ricerca combinata di anticorpi e antigene p24 con metodica chemiluminescente di 4 generazione (1 test di screening); 2. ricerca combinata di anticorpi e antigene p24 con altra metodica ELFA di 4 generazione (2 test di screening); 3. ricerca in immunoblot di anticorpi rivolti verso specifici antigeni virali (1 test di conferma); 4. ricerca con tecniche di amplificazione genica (biologia molecolare) dell'rna virale (test per la valutazione della presenza e della carica virale). Al termine di tale percorso diagnostico Lei riceverà una risposta i cui esiti potranno essere: 1. Negativo/non reattivo. Questo risultato indica che Lei, nel momento del prelievo è sieronegativo, vale a dire che non ha evidenza sierologica di infezione da HIV. Tale risposta, in assenza di comportamenti a rischio precedenti il prelievo può considerarsi conclusiva. Attenzione, però: se Lei nelle settimane precedenti ha avuto comportamenti a rischio (rapporti sessuali occasionali non protetti, uso promiscuo di siringhe, tatuaggi o piercing in ambienti non controllati, altri) può

4 trovarsi nel così detto "periodo finestra" (negatività temporanea dei test in presenza di infezione). In questo caso è consigliabile la ripetizione dei test HIV entro 3-6 mesi osservando in tale periodo accortezza e prudenza nelle relazioni (sessuali, familiari, altre) come se fosse sieropositivo (vedi anche la voce "sieroconversione" nel dizionario a fondo pagina). 2. Positivo/reattivo. Questo risultato indica che Lei è sieropositivo, vale a dire che ha contratto l'infezione da HIV ed è in condizione di trasmettere il virus ad altri soggetti. In questo caso, al ritiro della risposta, le sarà proposto un colloquio con i Dirigenti del Laboratorio che Le forniranno le informazioni necessarie sul significato della sua positività, sulle implicazioni comportamentali e quant'altro servirà alla comprensione del suo nuovo stato; la indirizzeranno, inoltre, verso le strutture idonee alla sua gestione clinica. Le forniamo un dizionario cronologico utile alla comprensione di alcuni termini tecnici: 1. Comportamenti a rischio: relazioni non protette con soggetti sieropositivi o dei quali non si conosca lo stato sierologico che comportino lo scambio o il contatto con materiali (sangue, sperma, secrezioni vaginali, ad esempio) capaci di trasmettere il virus HIV. 2. Trasmissione/Trasmissibilità: capacità/possibilità del soggetto sieropositivo di passare il virus al soggetto sano. 3. Sieroconversione: passaggio dallo stato di negativo a quello di positivo dopo l'esposizione al virus (infezione). La sieroconversione avviene dopo un periodo di tempo variabile dopo l'esposizione ma, comunque, non inferiore a duetre settimane. Per questo motivo i test di laboratorio non devono essere eseguiti subito dopo l'eventuale comportamento a rischio o nelle due-tre settimane successive poiché risulteranno molto probabilmente negativi, portando il soggetto alla falsa tranquillità di non essere stato infettato. 4. Periodo finestra: intervallo di tempo che intercorre tra il contatto con il virus e la sieroconversione. In questo periodo, necessario per la produzione di anticorpi, i test di laboratorio risultano negativi e possono dare la falsa tranquillità che un comportamento a rischio non abbia causato infezione. Il periodo finestra è variabile da soggetto a soggetto ma non è mai inferiore a 2-3 settimane, durante le quali è inutile fare i test di laboratorio ma è indispensabile osservare comportamenti di prudenza come se si fosse sieropositivo. 5. Sieropositività/Sieropositivo: condizione in cui sono presenti nel sangue ed in altri liquidi corporei anticorpi contro il virus HIV o il virus stesso. Questa condizione può progredire verso la malattia conclamata (AIDS) ma, contemporaneamente, può essere controllata e rallentata per molti anni nella sua progressione con l'uso di terapie specifiche e tempestive. 6. Terapia antiretrovirale: terapia specificamente idonea a rallentare la crescita (moltiplicazione) del virus HIV e la progressione della malattia. É generalmente composta dalla associazione di più farmaci e la sua efficacia è in continua crescita con la scoperta di nuovi farmaci. Un altro fattore (forse più importante) di efficacia è rappresentato dalla tempestività di inizio e dalla continuità dell'assunzione.

5 l Toxoplasma gondii è un protozoo parassita intracellulare obbligato nell'essere umano, diffuso in tutto il mondo ed è un'importante causa di infezione e di malattia sia nell'uomo che negli animali. L'infezione può presentarsi con evoluzione acuta o cronica, in forma sintomatica o asintomatica. L'infezione acuta è di solito asintomatica sia negli adulti che nei bambini; la forma cistica del parassita può persistere a livello dei tessuti senza alcuna manifestazione clinica nel paziente immunocompetente (ad eccezione di rari casi di corioretinite nella Toxoplasmosi oculare). L'infezione acuta causa i più gravi quadri clinici in pazienti immunodepressi (AIDS) in cui l'infezione, sia primaria che dopo riattivazione, può causare encefaliti, miocarditi e/o polmoniti, ed a livello fetale in quanto l'infezione trasmessa dalla madre al feto può causare l'aborto o serie complicazioni alla nascita o anche dopo anni a livello oculare, auricolare o neurologico. Data la possibilità di applicare misure di prevenzione adeguate per impedire l'infezione durante la gravidanza oppure di adottare un'adeguata terapia sia per prevenire l' infezione congenita che per curare un'infezione acuta o riattivata in paziente immunodepressi, è evidente quanto sia importante un corretto approccio diagnostico. Per un'efficace diagnosi sierologica dobbiamo conoscere la condizione immunitaria del soggetto (se ha avuto o no contatti con il parassita) e l'esordio dell'infezione (acuta, recente o pregressa): soggetto sieronegativo: assenza di anticorpi IgG/IgM; quindi possibilità di infezione durante la gravidanza. Nei pazienti immunocompromessi (trapiantati, HIV positivi) il mancato riscontro di immunoglobuline specifiche non è un dato attendibile. soggetto sieropositivo: presenza di anticorpi IgG/IgM/IgA; se il quesito clinico richiede di datare il momento dell'infezione è necessario seguire strategie diagnostiche predefinite. Fondamentali elementi di interpretazione sono: -qualità degli anticorpi rilevati -cinetica anticorpale (IgG) a tre settimane di intervallo -confronto dei titoli anticorpali Riguardo alla cinetica anticorpale e al confronto dei titoli anticorpali in campioni prelevati in tempi diversi le modalità di esecuzione e di interpretazione sono abbastanza semplici. Particolarmente complesso risulta, invece, lo studio della qualità degli anticorpi rilevati. IgM: compaiono precocemente e scompaiono più rapidamente degli anticorpi IgG, sono quasi sempre presenti in caso di infezione recente e possono mantenersi a bassi titoli anche per più di un anno. Falsi riscontri di positività possono essere dovuti alla presenza di anticorpi naturali non specifici oppure di fattore reumatoide o di anticorpi antinucleo; false negatività possono essere dovute alla minore affinità delle IgM e ciò può essere superato utilizzando procedure particolari come metodi ELISA a cattura. IgA: la loro produzione è incostante; di solito compaiono dopo le IgM e possono essere presenti prima o dopo le IgG, scompaiono dopo 6-12 mesi dall'infezione e possono ricomparire in caso di riattivazione in assenza di IgM. IgG: compaiono per ultimi, normalmente durante la seconda settimana dopo l'infezione, raggiungono il picco dopo 2-3 mesi, poi calano per persistere a titoli serici bassi anche per tutta la vita; il titolo delle IgG può risalire in caso di reinfezione (senza aumento di IgM e di IgA) o di riattivazione (con possibile rialzo delle IgA). E' stato messo a punto un metodo che misura la forza di legame (avidità) degli anticorpi IgG riuscendo così a discriminare gli anticorpi prodotti nelle fasi precoci dell'infezione da quelli ad alta avidità che sono espressione di una pregressa immunità. Criteri di interpretazione: -IgM/IgG negative: assenza di immunità, in caso di donna in gravidanza si deve eseguire un controllo mensile anche un mese dopo il parto per evidenziare anche le infezioni più tardive; nei pazienti immunodepressi la negatività non esclude la presenza di una infezione toxoplasmica in atto. -IgM positive e IgG negative: può significare un'infezione molto recente oppure la positività può essere dovuta ad anticorpi naturali; è necessario fare un controllo dopo 7-15gg e se le IgG si manterranno negative si potrà presupporre la presenza di anticorpi naturali, ma se risulteranno positive si potrà confermare una infezione recente. -IgM positive e IgG positive: può trattarsi di una toxoplasmosi recente o pregressa con persistenza di IgM e/o presenza di anticorpi naturali; può essere utile valutare nello stesso siero le IgA che, se presenti, possono avere significato di infezione recente anche inferiore a sei mesi. Un tentativo di datare l'infezione si può fare utilizzando il test di avidità delle IgG, cioè la forza di legame tra antigene e anticorpo; se l'avidità delle IgG è elevata l'infezione viene considerata non recente (la datazione varia in base al kit utilizzato), se, invece, l'avidità è bassa o intermedia non è possibile esprimere un giudizio definitivo perchè esistono pazienti con indice di avidità bassa anche se la loro infezione non è recente. -IgM negative e IgG positive con titolo >300 UI: l'infezione è avvenuta da più di un anno ed ha conferito lo stato di immunizzazione; nel caso di paziente immunodepresso è necessario escludere una riattivazione valutando il titolo delle IgA. -IgM negative e IgG positive con titolo <300 UI: infezione di vecchia data che conferisce protezione immunologica. Un grande contributo alla diagnosi della toxoplasmosi è stato dato dall'impiego sempre più diffuso dei metodi molecolari. (pp) Bibliografia: Ciardelli Infection dis.j. 2008;27(2):125-9 De Pascale Microbiologia Medica 2008; 23(3):

6 B-MLUS come MGUS Con la citometria a flusso multiparametrica, negli ultimi anni, è stato possibile caratterizzare con precisione una importante entità nosologica in soggetti apparentemente normali: la Linfocitosi Monoclonale a cellule B (MBL). I criteri diagnostici riconosciuti sono: Conta assoluta di linfociti B <5x10E9/L (cut-off per diagnosi differenziale dalla corrispondente Leucemia Linfatica Cronica (LLC)). Monoclonalità Kappa o Lambda (alcune oligoclonalità Kappa e Lambda) Assenza di linfoadenomegalia Assenza di organomegalia Assenza di infezioni intercorrenti L immunofenotipo contempla tre principali categorie: 1. CD5+ CD19+ CD CD5- CD19+ CD CD5+ CD19+ CD23- Nella MBL è documentata con una certa frequenza la mutazione dei geni IgHV, che intervengono nella sintesi immunoglobulinica, così come nella corrispondente Leucemia Linfatica Cronica, nella quale la frequenza di tale mutazione è molto alta (70%). Per conteggi assoluti di linfociti B compresi fra 1.5 e 5x10E9/L la MBL evolve in LLC nell 1.1% dei casi/anno: maggiore è la conta di B linfociti monoclonali, più alto è il rischio di evoluzione in LLC. La MBL può essere considerata condizione di premalignità (può precedere anche di 7 anni la comparsa di LLC) o può essere solo una condizione di senescenza immunitaria. La sua prevalenza nella popolazione generale adulta è del 3.5%, sale al 7% negli individui con età superiore ai 70 anni, mentre nei familiari di I grado di individui con LLC arriva al 28%. Per quanto detto la MBL è assimilata, come situazione clinica, a quanto osservato nelle Gammopatie Monoclonali di incerto significato (MGUS) e per essa è stato coniato anche il termine di B-Linfocitosi Monoclonale di incerto significato (B-MLUS). La sua diagnosi riveste grande importanza, oltre che per il riconoscimento del rischio di evoluzione in LLC, anche nella selezione di donatori di cellule staminali, nel trapianto allogenico in pazienti con LLC, per identificare i portatori di questo clone B simil-llc. Dalla relazione del prof. P.Ghia (Istituto Scientifico S. Raffaele Milano) Riassunto in Biochimica Clinica 2009 vol.33 n 5 pa gg (sv) Una nuova formula per la stima del GFR Nella valutazione clinica della funzione renale la misura della concentrazione plasmatica o della escrezione urinaria di una sostanza può non descrivere lo stato di reale funzionalità dell organo. Un miglior descrittore della funzionalità renale è senz altro rappresentato dal GFR (Glomerular Filtration Rate) che, tuttavia, non può essere facilmente misurato nella usuale pratica clinica. Per questi motivi negli ultimi 20 anni sono state proposte numerose formule per il calcolo del GFR (estimate GFR, egfr) che utilizzano come base di calcolo il valore di creatinina sierica e, tra queste, la Cockcroft-Gault. A partire dal 1999, però, la formula maggiormente utilizzata è quella proposta nell ambito di un programma di follow up su 1628 soggetti insufficienti renali (Modification of Diet in Renal Disease study, MDRD). Tale formula per il calcolo dell egfr presenta il vantaggio di non utilizzare parametri antropometrici oltre a sesso, età e razza ma essendo stata calcolata su soggetti con I.R. risulta inaccurata nei soggetti normali, oltre che negli ultra settantacinquenni e nei soggetti con variazioni (iper-ipo) della massa muscolare. Ulteriori problemi erano determinati da problemi di standardizzazione nella misurazione della creatinina che, recentemente, hanno portato alla raccomandazione per l uso di metodiche IDMS tracciabili. Per questi motivi recentemente Levy e coll. hanno proposto una nuova formula calcolata sui dati di 5504 soggetti nell ambito dello studio Chronic Kidney Disease Epidemiology Collaboration (CKD-EPI). Tale formula sembra essere più accurata della MDRD che nell uso di molti anni ha dimostrato di sottostimare la prevalenza di insufficienza renale. Dalla relazione del dr. D. Giavarina (Laboratorio di Chimica Clinica ed Ematologia, Ospedale Civile San Bortolo, Vicenza) Riassunto in RIMeL/IJLaM 2009; 5 (Suppl):105

7 Diagnostica molecolare della celiachia Ad oggi la più forte correlazione genetica dimostrata per la malattia celiaca (MC) è quella con i geni del sistema HLA: Il 90-95% dei celiaci correla con l eterodimero DQ2 codificato dagli alleli DQA1*0501/DQB1*02 Il 5-10% correla con l eterodimero DQ8 codificato dagli alleli DQA1*0301/DQB1*0302. Le molecole DQ2 e/o DQ8 si legano ai peptici deaminati della gliadina (la deaminazione della gliadina avviene da parte dell enzima transglutaminasi) e presentano tali antigeni ai linfociti T della mucosa intestinale, che reagiscono con produzione di citochine pro-infiammatorie, inducendo una risposta di tipo Th1 e Th2. Esiste un effetto dose dipendente della molecola DQ2: più alta è la sua dose, più intensa è la reazione infiammatoria mucosale. La concordanza del 100% della MC con la presenza di DQ2/DQ8 e per contro, il rilievo che le stesse molecole sono presenti anche nel 30% dei soggetti normali, depongono per la presenza di altri fattori genetici favorenti la MC, ancora oggi oggetto di studi. Nella pratica clinica la ricerca dell assetto genico HLA DQ2/DQ8 è, ad oggi, l unica indagine molecolare che può essere opportuno effettuare, ma non per fini diagnostici, poiché abbiamo detto che il 30% dei soggetti normali presenta tali molecole. La tipizzazione HLA DQ2/DQ8, essendo associata al 100% dei soggetti celiaci, ha un elevato valore predittivo negativo: la negatività per DQ2/DQ8 esclude praticamente la malattia celiaca. I test di tipizzazione vengono eseguiti con metodica PCR (reazione a catena della polimerasi) ad alta risoluzione, la più indicata per la sua sensibilità e specificità. Quando utilizzare questi test: nei casi di sierologia dubbia nei casi di sierologia negativa con segni clinici fortemente sospetti quando non è possibile effettuare una biopsia intestinale (gold standard per MC) nelle forme di celiachia latente nello screening di soggetti a rischio come nei familiari di celiaci: un risultato negativo evita loro di sottoporsi periodicamente ad esami sierologici di screening; se il test è positivo non indica lo sviluppo della malattia ma l opportunità di controlli periodici sierologici di screening. Dalle relazioni sull argomento dei proff. R. Troncone, L.Sacchetti, N. Tinto della Università di Napoli. (sv) C eravamo anche noi Il nostro laboratorio è stato presente al recente 41 Congresso Nazionale SIBioC 2 Evento congiunto S IBioC SIMeL con tre poster, di cui uno sulla Determinazione dell emoglobina glicata in presenza di emoglobinopatie, il cui contenuto era stato anticipato sul LabNews n. 42, e due descritti di seguito. Nel nostro laboratorio è presente un sistema di automazione totale TLA di ultima generazione (ACCELERATOR, Abbott) che consente lo stoccaggio automatico dei campioni in condizioni ambientali standardizzate ed il loro recupero, anch'esso automatizzato, per un eventuale ripetizione o dosaggio. La conservazione ha una durata di 7 giorni, per cui appare evidente l'importanza della stabilità degli analiti dosabili e la capacità del nostro sistema di salvaguardarla. Abbiamo condotto studi sulla capacità di conservazione del nostro sistema TLA che ci hanno consentito di presentare al recente 41 Congresso Nazionale SIBioC 2 Evento congiunto SIBioC SIMeL, due poster origi nali riguardanti rispettivamente la Stabilità di analiti nei sistemi di automazione totale (TLA) in Chimica Clinica e la Stabilità di analiti nei sistemi di automazione totale (TLA) in Immunometria. Nelle nostre condizioni standardizzate di conservazione i campioni sono generalmente rimisurabili entro la settimana. Sono in corso studi ulteriori per determinare con più precisione il tempo di stabilità, verificare la ripetibilità e quantificare l entità del bias. (mf)

8 'era una volta chi, per la diagnostica sierologica dell'epatite B, richiedeva i marcatori dell'epatite e c'era anche chi richiedeva marcatori dell'epatite A, B e C. C'erano anche i laboratori che, a fronte di tali richieste, eseguivano diligentemente anti HAV IgG ed IgM, HBsAg, HBsAb, HBeAg, HBeAb, Anti core Ig totali ed IgM, ed HCV e tutti erano contenti. Non mancavano le conoscenze; tutti sapevamo la storia naturale sierologica dell'infezione ed i rapporti cronologici che legano l'espressione sierica dei diversi antigeni e/o anticorpi. Solo che vi era scarsa attenzione alle implicazioni economiche degli sprechi e delle ridondanze e, soprattutto, non si era ancora consolidata la cultura della appropriatezza che avrebbe portato (o sta portando) alla gestione della diagnostica di laboratorio per quesiti clinici ed algoritmi diagnostici. Tutto a posto, allora? Sicuramente no: in molti laboratori italiani la situazione è quella descritta in premessa e, per di più, l'acquisizione di nuovi presidi diagnostici ripropone qualitativamente le stesse problematiche anche laddove sembravano superate. Basti pensare, a questo proposito, alle richieste di biologia molecolare per HBV o HCV non congruenti con il quadro sierologico. Proponiamo di seguito gli algoritmi diagnostici per la sierologia di HAV, HBV ed HCV che saranno applicate nel nostro laboratorio a partire dal prossimo anno. HAV. La determinazione delle IgG sarà eseguita solo sul quesito clinico di valutazione dello stato vaccinale; le IgM nel sospetto di infezione in atto. HBV. É stato acquisito il kit per la determinazione qualitativa dell'hbsag che sostituisce quello per la determinazione quantitativa che sarà riservata esclusivamente ai soggetti con epatite cronica (persistenza di HBsAg per più di sei mesi) HBeAg positivi/negativi in trattamento, nei soggetti candidati al trapianto, immunocompromessi o HIV positivi. Le stesse indicazioni sono riservate alla ricerca e quantificazione in PCR dell'hbv-dna, con l'aggiunta, per questo marcatore, della infezione occulta da HBV, caratterizzata dalla negatività per HbsAg. Per quanto riguarda la valutazione della pregressa esposizione al virus, viene mantenuta la tripletta classica HBsAg HBsAb Anticore Ig totali tranne che per i soggetti italiani di età inferiore a 18 anni, dal momento che tale popolazione risulta coperta dalla vaccinazione obbligatoria introdotta in Italia nel In tali soggetti sarà eseguita solamente la ricerca di HBsAb. HCV. Come è noto la positività per il test sierologico HCV non discrimina il soggetto esposto e guarito da quello con progressione verso l'epatite cronica, la cirrosi e l'epatocarcinoma. Il discrimine tra le due situazione è dato dalla presenza di RNA virale in circolo, evidenziabile con tecniche di biologia molecolare. Il ricorso a tale tecnica non può, tuttavia, essere offerto indiscriminatamente a tutti gli HCV positivi. É stato recentemente proposto l'utilizzo del parametro S/CO (segnale rapportato al cut off) come discriminante tra i soggetti HCV positivi da sottoporre a test molecolari e quelli per i quali il risultato di tale parametro ha un elevato valore predittivo per negatività della viremia. Un valore S/CO >5.0 ha un elevato valore predittivo positivo (99.2%) e permette di escludere quindi l'ipotesi di falsi positivi al test di screening, passando, ove richiesto, direttamente alla determinazione di HCV RNA senza necessità del test di conferma in immunoblot. Nel caso di S/CO <5.0, viceversa, diminuendo il valore predittivo positivo sarà necessaria la conferma di con metodiche di blotting e, nel caso di conferma, la ricerca dell'rna per discriminare tra infezione risolta ed infezione attiva. (alg)

9 Amalia e Massimo fanno parte (ancora per qualche giorno) della pattuglia, sempre più ristretta, dei vecchi tecnici di laboratorio che trovai al mio arrivo a Livorno nel giugno del Avevano confidenza con strumenti e metodologie ormai desuete, matraccio e beuta per loro non erano parolacce ed hanno vissuto nel corso degli anni successivi tutti i grandi e difficili cambiamenti del laboratorio. Amalia, esuberante, sempre pronta allo scherzo ed alla battuta nelle relazioni personali, tramutava queste sue caratteristiche in riservatezza, attenzione e scrupolo nelle attività quotidiane del laboratorio; proprio come Massimo, su cui potevi sempre contare anche nei momenti più critici senza che mai rinunciasse alla pacatezza ed alla riservatezza che lo contraddistinguono. Le commemorazioni rischiano sempre di essere retoriche e possono apparire finte. Ma io parlando di Amalia Saloni e Massimo Giusti non ho bisogno di alcuna retorica e di nessuna forzatura nell'affermare che vanno via accompagnati da sentimenti che non si comprano, non si vendono e non si fingono: stima, rispetto ed affetto. Non penso di riuscire, anche sforzandomi, di trovare un solo operatore del laboratorio che non abbia condiviso e condivida questo sentire per loro. Un abbraccio a tutti e due e l'augurio sincero che i tanti interessi della vita extra lavorativa contribuiscano a farli sentire ed essere vivi, attivi e contenti per una scelta che io, da parte mia comincio ad invidiare. (alg) (Continua da pagina 1) stante di una campagna, spacciata come informativa, che in realtà, crudamente e realisticamente tradotta, offre una sola informazione: non importa se avete comportamenti a rischio tanto, dopo, il test vi dirà se siete sieronegativo (speriamo) o sieropositivo. Prosit Mi arriva la rassegna stampa del 7 dicembre 2009 ed apprendo che la nostra ASL nel 2008 si è piazzata al penultimo posto nella classifica regionale di valutazione delle Aziende Sanitarie. Nessuna sorpresa: non sempre il decisionismo e l'arroganza coniugano efficienza e qualità. La sorpresa casomai è un'altra: nel paniere utilizzato dalla Regione per la valutazione dei suoi Direttori Generali il grado di soddisfazione dell'utenza e la qualità delle relazioni interne contano solo per il 16%. (10% e 6% rispettivamente)! Aumenta la sensazione di essere sudditi due volte: la prima come cittadini ed utenti di questo SSR; la seconda come operatori dello stesso sistema. Questo numero di Lab News prevalentemente incentrato sulla sierologia HIV ed Epatite è stato reso possibile dalla elevata qualità scientifica proposta da tutti i relatori del corso di Ancona del 20 e 21 ottobre. Desidero ringraziarli per quel che ho imparato e per aver messo il materiale didattico a disposizione. Li ringrazio ad uno ad uno: Paola Pauri (Laboratorio di Jesi); Marcello Acetoso e Roberto Bettini (Laboratorio di Pesaro); Patrizia Bagnarelli e Katia Marinelli (Virologia di Ancona); Luca Butini (Immunologia Clinica di Ancona); P. Mazzacanti (Istituto di Igiene ASUR 9). Buon Natale e Felice (alg) Prelievi Poliambulatorio: Tutti i giorni dalle 7.30 alle Consegna campioni Poliambulatorio: Tutti i giorni dalle 7.30 alle Appuntamenti per prelievo al Poliambulatorio Giorni feriali: dalle alle Sabato: Consegna risposte Poliambulatorio: Giorni feriali: dalle alle Sabato: Prelievi Distretto Via E.Rossi: Tutti i giorni dalle 7.30 alle 9.15 Consegna risposte: Prelievi Distretto Fiorentina: Tutti i giorni dalle 7.30 alle 9.15 Consegna risposte: Prelievi Distretto Via del Mare: Da Lun a Ven dalle 7.30 alle 8.45 Consegna risposte: Prelievi Distretto Collesalvetti: Lun-Mer-Sab* dalle 7.30 alle 9.00 consegna risposte Lun-Mer-Ven: Prelievi Distretto Stagno Venerdì* dalle 7.30 alle 9.00 *su prenotazione

10 Da questo mese sul nostro sito internet è presente un link che permette di collegarsi al sito web Lab Tests Online (www.labtestsonline.it), curato dalla Società Italiana di Biochimica Clinica e Biologia Molecolare Clinica (SIBioC) con il supporto e la collaborazione dell EDMA (European Diagnostic Manufacturers Association) e di Assobiomedica. Il sito è la versione italiana di quello curato dallasocietà Americana di Chimica Clinica (American Association for Clinical Chemistry-AACC) che descrive oltre 200 esami di laboratorio, oltre 80 malattie di elevata prevalenza nella popolazione e collega fra loro queste informazioni e la cui redazione è curata da professionisti della disciplina. STANDARDIZZAZIONE INTERNAZIONALE DELL EMOGLOBINA GLICATA Il processo di standardizzazione della misura dell emoglobina glicata (HbA1c), avviato qualche anno fa a cura della Federazione Internazionale di Chimica Clinica (IFCC), ha portato alla messa a punto di un metodo ufficiale di riferimento ed alla produzione di due materiali primari di riferimento con conseguente introduzione di nuove unità di misura (mmol/mol) allineate con il sistema internazionale delle unità di misura (S.I.). Il nuovo sistema di riferimento IFCC permette infatti di misurare direttamente ed in maniera specifica la porzione glicata dell emoglobina. L implementazione del nuovo sistema di riferimento in Italia avverrà, secondo le raccomandazioni del gruppo di lavoro GLAD (composto da esperti delegati dalle varie associazioni scientifiche italiane), dal mese di Gennaio 2010, con l allineamento delle metodiche in uso allo standard IFCC e l espressione del risultato in mmol/mol. I risultati dell HbA1c verranno refertati anche in unità di misura convenzionale (%) insieme all unità di misura IFCC per un periodo di tempo non superiore ai due anni. Si riporta una tabella di corrispondenza tra i valori attuali dell HbA1c e i valori nuovi (IFCC): Valori attuali Valori nuovi % 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 10,0 mmol/l Nuovo intervallo di riferimento per soggetti non diabetici: mmol/mol. Bibliografia: Mosca A et al. RIMeL/IJLaM 2009; 5: Da gennaio 2010 per gli ultra 75enni la richiesta di creatinina sierica con relativa determinazione del filtrato glomerulare stimato (codice di inserimento CRA) verrà automaticamente convertita nel dosaggio della Cistatina C, ciò indipendentemente dalla richiesta. Per gli altri casi (es: anomalie della massa muscolare) in cui l'algoritmo non è applicabile in automatico, raccomandiamo che l'eventuale richiesta di cistatina C sia accompagnata dalla esplicitazione dello stato di "alterata massa muscolare".

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