Valutazione della qualità delle acque del Naviglio Martesana tramite classificazione tradizionale e DNA barcoding (a.s )

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1 Valutazione della qualità delle acque del Naviglio Martesana tramite classificazione tradizionale e DNA barcoding (a.s )

2 Scopo del progetto è quello di valutare la qualità delle acque del Naviglio Martesana attraverso la raccolta di macroinvertebrati. Il numero e la tipologia delle unità sistematiche permette di calcolare l E.B.I. (Indice Biotico Esteso). Accanto alle tecniche di classificazione tradizionali, è stata introdotta la classificazione tramite confronto di sequenze geniche. Per questo abbiamo dovuto imparare ad utilizzare alcune delle tecniche di ingegneria genetica e a lavorare su data base dedicati.

3 IL CAMPIONAMENTO

4 Sono stati effettuati cinque campionamenti, tre a ottobre, uno a novembre e uno a marzo, in tre punti diversi lungo il Naviglio; sono stati sfruttati i momenti nei quali il consorzio toglie parzialmente l acqua. Gorgonzola Milano Bellinzago Lombardo

5 Strumenti per il campionamento Questo è il materiale utilizzato per i nostri campionamenti. - Una benna; - Setacci sovrapposti con maglie di grandezze diverse; - Innaffiatoio per «pulire» da argilla e sabbia il campione raccolto; - Bacinelle ; - Barattolini di vetro; - Pinzette; - Pipette; - Kit per l analisi delle acque; - Guanti in lattice.

6 Il lancio della benna Nella foto si vede il momento in cui si lancia la benna. Questo strumento ha un meccanismo di blocco che mantiene la benna aperta. Non appena tocca il fondo il meccanismo si disattiva cosicché, tirando verso l alto, la benna si chiuda rapidamente grazie a un sistema di leve intrappolando i primi centimetri di fondo con gli organismi che ci vivono.

7 L individuazione degli organismi Il materiale raccolto dalla benna viene messo nei setacci e lavato più volte. I materiali più grossolani rimangono nel setaccio superiore, con maglie di circa 1cm 2, mentre i macroinvertebrati rimangono nel setaccio inferiore, con maglie di circa 1mm 2, che lascia passare argilla e sabbia fine. Quello che rimane nel secondo setaccio viene messo in una vaschetta bianca con un velo d acqua. Qui si cercano a vista gli organismi e si prendono con delle pinzette.

8 Nella foto una larva di Hydropsichidae. Questa famiglia appartiene all ordine dei Tricotteri e contrariamente al solito non vive in un astuccio costruito con sassi o legnetti. I ciuffi sotto e al termine dell addome sono branchie.

9 Particolare di Astacus leptodactylus, un gambero di fiume originario dell Europa orientale (viene anche detto gambero turco).

10 Esemplare di Spherium corneum (grande all incirca 2 cm), mollusco molto comune dove la corrente del Naviglio deposita sabbia e limo. Nella foto si notano i due sifoni da cui l animale fa entrare ed uscire l acqua che viene filtrata dalle branchie per ricavare ossigeno e trattenere le particelle alimentari

11 ESTRAZIONE E AMPLIFICAZIONE DEL DNA

12 Estrazione Ogni organismo raccolto, o una sua parte se l organismo intero fosse troppo grande, è stato messo in apposite microprovette, le eppendorf. Lì è stato trattato con tensioattivi, enzimi proteolitici e altre sostanze in grado di rompere le membrane cellulari. E stato poi sottoposto ad alcune centrifughe in modo da ottenere una soluzione contenente solo il suo DNA. In questa fase bisogna porre molta attenzione a non inquinare il campione con DNA estraneo. eppendorf centrifuga

13 L amplificazione Dopo l estrazione è necessario amplificare il gene mitocondriale (COI, citocromo ossidasi). Questo gene è specifico di ciascuna specie e varia se le specie sono diverse. Per far questo si utilizza la tecnica della PCR. La soluzione contenente il DNA viene messa in una piccola provetta assieme a corti frammenti di DNA artificiali, detti primer, studiati apposta per consentire la duplicazione, in qualche milione di copie, solo del tratto di DNA che contiene il gene a cui siamo interessati. La provetta viene messa in una macchina della PCR che ottiene l amplificazione attraverso una serie di cicli (circa 20) di riscaldamento a 95 e raffreddamento a circa 60.

14 DNA e mitocondri Una cosa che non tutti sanno è che il DNA di una cellula non è solo quello contenuto nel nucleo. Piccole quantità di DNA sono contenute anche nei mitocondri e nei cloroplasti. Questo fatto richiama il loro meccanismo di formazione. Contrariamente agli altri organuli i mitocondri e i cloroplasti erano in origine dei batteri che sono stati inglobati da cellule più grandi dando vita con queste a una simbiosi strettissima. I geni contenuti in questo DNA codificano per proteine connesse alle funzioni dei due organuli. Perché è stato scelto proprio DNA mitocondriale per arrivare a classificare gli organismi? La scelta di utilizzare un gene del DNA mitocondriale risulta molto utile in quanto questi geni presentano una bassa variabilità ed inoltre sono presenti in copia singola. Questo permette di ottenere sequenze più «pulite».

15 L elettroforesi Per controllare il successo dell amplificazione bisogna fare una elettroforesi. L elettroforesi è una tecnica basata sul movimento di particelle immerse in un gel (solitamente gel di agarosio) per effetto di una coppia di elettrodi. La soluzione con il DNA, trattato preventivamente con un marcatore fluorescente, viene messa in appositi pozzetti (piccoli buchi) lasciati nel gel al momento della sua solidificazione. Il DNA, avendo carica negativa si sposta verso l anodo, carico positivamente. Dopo aver lasciato «correre» il DNA per circa 30 minuti, si illumina la gelatina con dei raggi UV in modo da mettere in evidenza la presenza del DNA amplificato.

16 IL SEQUENZIAMENTO

17 Abbiamo inviato i campioni sottoposti a elettroforesi al laboratorio IGA TECNOLOGY SERVICES di Udine per il sequenziamento. Per ogni organismo analizzato abbiamo ottenuto le sequenze di basi azotate. Nel grafico si vede un tratto della sequenza. Ogni picco corrisponde a una base azotata e il colore ci dice di quale base si tratta. In alto è riportato un tratto di sequenza.

18 IL CONFRONTO TRA LE DUE CLASSIFICAZIONI

19 Le sequenze che ci sono state inviate dai laboratori di Udine le abbiamo inserite in un apposito data base che ci ha restituito il nome della specie o di altra unità sistematica superiore avente la maggior affinità con il nostro organismo a livello del gene estratto. C è anche un punteggio che ci indica il livello di sovrapposizione. Più è alto questo punteggio più possibilità abbiamo che il nostro organismo sia effettivamente quello trovato nel data base.

20 n campioni classificazione con metodo tradizionale classificazione con sequenziamento genico 0 2 Anellide tubificide Tubifex tibifex/limnodlilus 13 Anellide tubificide Branchiura sowerbyi 50 Aracnide Pseudomonas mendocina (batterio) 17 Stenelmis sp. (fam Elminthidae) Elmidae sp. / Stenelmis sp. 0 1 Gammarus/Echinogammarus Acidovorax sp (batterio) 0 6 Chironomidae Tanypodinae 2 esemp. Cricotopus bicintus 27 Simulide Simulium piperi 37 Chironomide Chironomus riparius 0 8 Baetis sp. (ordine efemerotteri) Erbaspirillum seropedicae (batterio) OO Aphelocheirus aestivalis Aphelocheirus ellipsodeus 10 Piscicola sp. Helobdella stagnalis 12 Erpobdella testacea Erpobdella testacea 34 Erpobdella testacea Trocheta intermedia 0 3 theodoxus (fluvialis?) Erbaspirillum seropedicae (batterio) 20 Zigottero (Platicnemis/Lestes) Erythromma najas 21 Zigottero Tubifex tubifex 33 larva primi stadi (0,6 cm) odonati anisotteri Acidovorax sp. 44 Tricottero Leptoceridae sp. Dal confronto tra le due classificazioni si vede che nella maggior parte di casi c è una corrispondenza almeno a un livello di livello sistematico superiore a quello della specie, mentre in 6 casi i due sistemi danno conclusioni molto diverse. Cercheremo di analizzare il perché nelle prossime diapositive

21 Che cosa ha mangiato! 21 Zigottero Tubifex tubifex Per quanto riguarda il campione n 21, si trattava chiaramente di una larva di libellula appartenente al gruppo degli zigotteri. Come mai il DNA ci restituisce degli anellidi? La risposta più plausibile è che la larva, predatrice, si fosse appena cibata di questi organismi quando è stata catturata. L estrazione e l amplificazione può aver casualmente favorito l organismo mangiato rispetto a quello che a noi interessava. A sostegno di questa tesi possiamo anche osservare che questi anellidi sono presenti nell ambiente, come dimostra il campione n 2

22 Perché batteri? n campioni classificazione con metodo tradizionale classificazione con sequenziamento genico 50 Aracnide Pseudomonas mendocina (batterio) 0 1 Gammarus/Echinogammarus Acidovorax sp (batterio) 0 8 Baetis sp. (ordine efemerotteri) Erbaspirillum seropedicae (batterio) 0 3 theodoxus (fluvialis?) Erbaspirillum seropedicae (batterio) 33 larva primi stadi (0,6 cm) odonati anisotteri Acidovorax sp. Nel caso di questi 5 campioni l errore è ancora più grave, in quanto il confronto tra il DNA amplificato e il database, ha dato come risposta dei batteri. Anche questo è facilmente spiegabile in quanto il gene preso in considerazione, contenuto nei mitocondri, è posseduto anche dai batteri che svolgono la respirazione cellulare. In questo caso l estrazione e l amplificazione ha favorito il DNA dei batteri contenuti nell apparato digerente dell organismo o che ne inquinavano l esterno.

23 Perché non la specie corretta? OO Aphelocheirus aestivalis Aphelocheirus ellipsodeus In questo caso la classificazione tradizionale e quella fatta utilizzando il DNA coincidono in modo quasi perfetto. Come mai però la specie risulta diversa? Aphelocheirus aestivalis è l unica specie presente in Italia. La spiegazione più ovvia è che i data base che abbiamo utilizzato non contengono ancora le sequenze di tutte le specie. Potrebbe essere anche che si tratti effettivamente dell ellipsodeus che ha colonizzato di recente i nostri territori come stanno facendo tante altre specie. Questa seconda ipotesi andrebbe tuttavia supportata dalla cattura di altri esemplari adulti (quelli catturati erano negli stadi larvali) e da una attenta classificazione con metodi tradizionali fatta da esperti.

24 Conclusioni Dal confronto dei due metodi si può concludere che la classificazione con l utilizzo del DNA non è per forza migliore di quella operata con metodi classici. Bisogna cercare in tutti i modi di non inquinare il campione usando strategie appropriate per amplificare solo il DNA dell organismo che ci interessa. Questo potrebbe essere ottenuto anche con l utilizzo di primer più specifici per i diversi gruppi di organismi. Inoltre si paga lo scotto della non completezza dei data base. Certamente in prospettiva le cose dovrebbero migliorare, in quanto i data base sono destinati a diventare sempre più completi. La classificazione mediante confronto di frammenti di DNA ha poi il vantaggio di non richiedere degli esperti di quei particolari organismi.

25 L INDICE E.B.I. DEL NAVIGLIO MARTESANA

26 La tabella Per individuare il valore dell indice E.B.I. (Indice Biotico Esteso), si fa riferimento a questa tabella. Si sceglie la riga in base alla tipologia di organismi presenti. Dal basso verso l alto si hanno organismi sempre più esigenti di acque pulite e ossigenate. La colonna si sceglie in base al numero di unità sistematiche rinvenute. L unità sistematica utilizzata non è la specie ma il genere o la famiglia.

27 Le nostre unità sistematiche Unità sistematiche Indice IBE con livello di determinazione Unità sistematiche presenti nel campionamento N PLECOTTERI (genere) nessuno TRICOTTERI (famiglia) 14, 42, 43, 44 4 EFEMEROTTERI (genere) 8, 9 2 COLEOTTERI (famiglia) 17 1 ODONATI (Genere) (20-21), 33 2 DITTERI (famiglia) (6, 7, 28, 29, 30, 37, 38, 39), 23, (26, 27, 40, 41) 3 ETEROTTERI (genere) (OO, 46) 1 CROSTACEI (famiglia) (1, 16, 22), 5 2 MOLLUSCHI (genere) (3,15, 36, 49), (18, 48), (4, 19), (11, 45), 47 5 TRICLADI (famiglia) nessuno IRUDINEI (genere) (10, 31, 32), (12, 33,34) 2 OLIGOCHETI (famiglia) (2, 13) 1 totale 23 Nella tabella sono riportati tutti i campioni raccolti suddivisi in base alle unità sistematiche previste dalla tabella. Tra parentesi i campioni che valgono per una sola unità. Per esempio, tra i ditteri, la prima parentesi contiene 8 campioni perchè, pur essendo diversi a livello di specie, fanno parte tutti della famiglia dei Chironomidi.

28 Il valore dell indice E.B.I. Entriamo dalla quinta riga poiché abbiamo 6 unità sistematiche tra Tricotteri ed Efemerotteri delle famiglie Baetidae e Caenidae; entriamo dalla sesta colonna perché abbiamo un totale di 23 unità sistematiche. L indice ottenuto è quindi pari a 9.

29 Interpretazione dell indice E.B.I. Come si vede da questa tabella un valore pari a 9 pone le acque del Naviglio Martesana nella II classe, appena al di sotto degli ambienti privi di inquinamento.

30 Conclusioni L indice ottenuto ci restituisce una situazione del Naviglio Martesana decisamente buona per un canale artificiale. Probabilmente la scelta del consorzio Villoresi degli ultimi anni di non mandare mai in asciutta totale il Naviglio, tenendo sempre un minimo vitale, ha consentito l instaurarsi di un ecosistema sufficientemente complesso all interno di acque non molto inquinate e discretamente ossigenate. A riprova di quanto detto si possono confrontare i campionamenti di ottobre/novembre con quello di marzo. Le specie presenti sono sostanzialmente le stesse, ma le larve di marzo, cresciute durante l inverno, erano molto più grandi (nel caso dei ditteri simulidi molte si erano già impupate, pronte per il passaggio allo stadio adulto). Se il consorzio avesse tolto l acqua completamente si sarebbero interrotti i cicli vitali (uovo, larva, adulto) degli organismi di questo ecosistema. Sarebbe molto interessante, considerato che a causa di alcuni lavori che il consorzio deve fare nella zona di Concesa il Naviglio verrà temporaneamente asciugato, rifare una indagine simile negli anni successivi, confrontare i dati e verificare quanti anni eventualmente ci vogliano per ristabilire la situazione attuale.

31 Hanno realizzato questo lavoro Prof. Leoni Fiorentino Alessandro Luciano Andrea Binelli Alessandro Galbiati Giulia Fanzone Arianna Alessi Andrea Chiudinelli Mattia Casati Matteo Carbone Luca Cusimano Cristina Ghezzi Andrea Scloza Sara Malacrida Docente di scienze Istituto Marconi Gorgonzola Studente Liceo Volta Milano Studente Istituto Marconi Gorgonzola Studente Istituto Marconi Gorgonzola Studente Istituto Marconi Gorgonzola Studente Istituto Marconi Gorgonzola Studente Istituto Marconi Gorgonzola Studente Istituto Marconi Gorgonzola Studente Istituto Marconi Gorgonzola Studente Istituto Marconi Gorgonzola Studente Istituto Marconi Gorgonzola Studente Istituto Marconi Gorgonzola Studente Istituto Marconi Gorgonzola Si ringraziano il prof. David Horner, docente presso l università statale di Milano che ha coordinato le attività Le prof. Cinzia Grazioli e Livia Pirovano del CUSMIBIO per aver progettato questa attività, averla seguita con pazienza e averci aiutato con consigli indispensabili.