INFORMAZIONI SU ALCUNE CONDIZIONI GENETICHE

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1 INFORMAZIONI SU ALCUNE CONDIZIONI GENETICHE FIBROSI CISTICA (CFTR) La fibrosi cistica è una malattia genetica a trasmissione autosomico-recessiva causata da mutazioni del gene CFTR; nella popolazione i portatori di mutazioni a carico di un solo allele (eterozigoti) sono circa 1/25. Il test molecolare permette l individuazione delle mutazioni più frequenti associate alla malattia. Inoltre la variazione del copy number di uno o più esoni del gene CFTR può rappresentare sino al 10% delle mutazioni nella maggior parte delle popolazioni studiate. La metodica impiegata prevede PCR ed ibridazione inversa. SINDROME X FRAGILE (FMR-1) La Sindrome X fragile (anche detta Sindrome di Martin-Bell; ritardo mentale X-linked) costituisce la più frequente causa genetica di ritardo mentale nel maschio. Il test è indicato per: individui con ritardo mentale, autismo storia familiare di ritardo mentale coppie con rischio riproduttivo per ritardo mentale diagnosi prenatale in feto da madre portatrice tremori/ atassia maschile (FXTAS) menopausa precoce (POF) Il test molecolare individua espansioni CGG al 5 del gene FMR-1. La metodica impiegata prevede PCR ed elettroforesi capillare ed analisi Southern blot con sonda StB12.3 ALZHEIMER (apoe) ApoE è una apolipoproteina implicata nel metabolismo lipidico; nella popolazione umana è presente in tre isoforme, denominate e2-e3-e4, che deteminano sei possibili fenotipi. La presenza della forma allelica apoe-e4 è stata associata all insorgenza del morbo di Alzheimer in età avanzata, sia sporadico che familiare. Sebbene esistano pareri non favorevoli all utilizzo del genotyping di apoe come test predittivo, tale genotyping può risultare molto utile nella diagnosi differenziale di Alzheimer in pazienti con accertati segni clinici di demenza. Il test molecolare individua i 6 possibili genotipi di apoe. La metodica impiegata prevede PCR, digestione enzimatica ed elettroforesi su gel agarosio Nusieve. ALZHEIMER (PS1) PS1 (presenilina 1) è una proteina componente i complessi proteici ad alto peso molecolare nel reticolo endoplasmatico e nell apparato del Golgi. Il gene codificante tale proteina è localizzato sul cromosoma 14; sono state descritte oltre 50 diverse mutazioni di questo gene in pazienti con forme familiari ad esordio precoce. Queste mutazioni rapppresentano la causa più comune di origine genetica della malattia di Alzheimer familiare ad esordio precoce (28-60 anni). Il test molecolare viene eseguito mediante sequenziamento diretto dell esone 5 del gene PS1. STERILITÀ/ANOMALIE DELLA DIFFERENZIAZIONE SESSUALE (SRY- sex determining regiony) La ricerca di SRY viene fatta in pazienti con Sindrome di Turner (Monosomia X). La Sindrome di Turner ha una frequenza alla nascita di circa 1/2500. La monosomia omogenea dell X, (45,X) è presente in molte delle pazienti, mentre in altri casi si riscontrano anomalie

2 strutturali del cromosoma X o mosaicismo cromosomico (non sempre rilevabile citogeneticamente). Poiché in una delle linee cellulari potrebbe essere presente il cromosoma Y, o parti di esso, è opportuno escludere questa eventualità attraverso un test di amplificazione genica di sequenze Y-specifiche. In particolare viene ricercata la sequenza SRY (sex-determining region on Y chromosome), principalmente coinvolta nella differenziazione gonadica maschile. Il test molecolare viene eseguito mediante PCR, ed elettroforesi su gel di agarosio. E disponibile anche il sequenziamento del gene per la ricerca di eventuali mutazioni. ACONDROPLASIA/IPOCODROPLASIA (FGFR3) Costituiscono le più comuni forme ereditarie di malattie che causano bassa statura, dovute ad una delle due possibili mutazioni a carico del gene per il Recettore 3 del Fattore di crescita per i Fibroblasti (FGFR3). Più del 90% dei casi sono sporadici, talora associati ad una avanzata età paterna. Il test viene raccomandato per: confermare la diagnosi in soggetti con fenotipo caratteristico diagnosi prenatale di acondroplasia Il test molecolare per la acondroplasia individua le mutazioni c.1138g>a, p.gly380arg e c.1138g>c, p.gly380arg nel gene FGFR3. Il test molecolare per la ipocondroplasia individua le mutazioni c.1620c>a, p.asn540lys (frequenza 49%), c.1620c>g, p.asn540lys (frequenza 21%) e c.1612a>g, p.ile538val (frequenza <2%) nel gene FGFR3. degli esoni 8 e 11 del gene FGFR3. SINDROMI DA MICRODELEZIONI/RITARDO MENTALE Il 5% (Knight, 1997), il 6% (Biesecker, 2002), il 2.5% (Ravnan, 2006) dei ritardi mentali idiopatici (da moderati a severi) presenta riarrangiamenti a livello delle regioni subtelomeriche e pertanto, in assenza di un quadro clinico che indirizzi verso una sindrome specifica, viene valutata la integrità di tutte le estremità telomeriche. A tutt oggi solo alcuni sbilanciamenti telomerici hanno mostrato di avere un fenotipo distinto e riconoscibile: del 1p, 4p, 5p, 9q, 17p e 22q. Riarrangiamenti criptici di alcune regioni cromosomiche sono responsabili di sindromi che causano ritardo mentale (S. Williams, S. Prader Willi, S. Angelman, S. Miller Dieker, S. Smith Magenis, S. Alagille, Di George/VCF, S. Sotos, S. Saethre-Chotzen) E possibile individuare tali sindromi da delezioni e duplicazioni cromosomiche e valutare la integrità delle estremità telomeriche utilizzando una tecnica di recente introduzione denominata MLPA (Multiplex Ligation Probe Amplification) che permette anche di determinare lo stato di metilazione di specifiche regioni cromosomiche (CpG island). L'analisi dello stato di metilazione di specifiche regioni del cromosoma 15 consente di individuare la quasi totalità dei casi di Sindrome di PraderWilli/Angelman. Il test molecolare viene eseguito mediante tecnica MLPA. SINDROME DI BECKWITH-WIEDEMANN La sindrome di Beckwith-Wiedemann è una patologia poligenica causata da disregolazione dell'espressione dei geni presenti nella regione cromosomica 11p15, che è una regione soggetta a imprinting. Sono stati implicati vari difetti della regione cromosomica 11p15 (alterato numero di copie, disopia uniparentale, mutazioni geniche) e i difetti epigenetici sono responsabili di circa due terzi dei casi. L'incidenza stimata è di 1/ nati vivi. Il test molecolare viene eseguito mediante tecnica MLPA che permette di indagare sia difetti nel numero di copie che lo stato di metilazione della regione cromosomica 11p15.

3 SINDROME DI SILVER-RUSSELL La sindrome di Silver-Russell è una patologia geneticamente eterogenea. Circa il 30% dei casi mostra ipometilazione del gene H19, localizzato sulla regione 11p15 soggetta a imprinting. L'ipometilazione è dovuta in molti casi a un meccanismo epigenetico o a un microriarrangiamento genomico, come la microduplicazione materna L'incidenza è stimata in 1-30/ casi. Il test molecolare viene eseguito mediante tecnica MLPA che permette di indagare sia difetti nel numero di copie che lo stato di metilazione della regione cromosomica 11p15. MALATTIA DI CHARCOT-MARIE TOOTH/NEUROPATIA EREDITARIA CON IPERSENSIBILITÀ ALLA PRESSIONE (HNPP) La malattia di Charcot-Marie-Tooth è una neuropatia periferica ereditaria, la cui prevalenza è stimata 1/2500. Sono note tre forme: demielinizzante (CMT1), dominante legata all'x (CMTX1) e neuronale (CMT2). La forma CMT1 è caratterizzata da duplicazione di una regione di 1.5Mb sul cromosoma 17p11.2. La delezione della medesima regione è responsabile dell'80% dei casi di neuropatia ereditaria con ipersensibilità alla pressione (HNPP). Il test molecolare viene eseguito mediante tecnica MLPA che permette di indagare i difetti nel numero di copie della regione cromosomica 17p11.2. ATROFIE MUSCOLARI SPINALI Le atrofie muscolari spinali (SMA) sono un gruppo di malattie neuromuscolari: ne vengono definiti quattro tipi in base all'età d'esordio e alla gravità della malattia. Il 95% circa delle SMA è causato da delezioni omozigoti del solo esone 7 o degli esoni 7 e 8 del gene SMN1 (cromosoma 5q12.2-q13.3) che codifica per la proteina SMN. È stato inoltre identificato un secondo gene (cromosoma 5q12.2-q13.3) che contribuisce a produrre solo il 10% della proteina SMN a lunghezza completa. Pur con alcune eccezioni, la gravità della SMA correla inversamente con il numero delle copie del gene SMN2. L'incidenza è stimata in circa 1/ Il test molecolare viene eseguito mediante tecnica MLPA che permette di indagare difetti nel numero di copie dei geni SMN1 ed SMN2. SINDROMI MED12-CORRELATE: SINDROME DI OPITZ-KAVEGGIA (FG tipo 1) E SINDROME DI LUJAN-FRYNS Mutazioni del gene MED12 (cromosoma Xq13), che codifica per una delle proteine del complesso di inizio della trascrizione, sono responsabili di due differenti malattie genetiche con trasmissione X-linked recessiva: la sindrome di Opitz-Kaveggia (FG tipo 1) e la sindrome di Lujan-Fryns. Le mutazioni p.g958e e p.r961w nell'esone 21 del gene MED12 causano la sindrome di Opitz-Kaveggia, caratterizzata da deficit cognitivo, ipotonia, macrocefalia, dismorfismi facciali e malformazioni multiple. La mutazione p.n1007s nell'esone 22 del gene MED12 causa la sindrome di Lujan Fryns, caratterizzata da deficit cognitivo, macrocefalia, dismorfismi facciali, habitus marfanoide degli esoni 21, 22 del gene MED12. TEST DI VALUTAZIONE DELLA PREDISPOSIZIONE GENETICA ALLO SVILUPPO DI PATOLOGIE TROMBOEMBOLICHE Circa il 30% dei pazienti affetti da trombosi hanno familiari affetti dalla medesima patologia. Alcuni difetti ereditari contribuiscono ad uno stato di trombofilia: fattore V Leiden, mutazione G20120A del gene della protrombina, mutazione C677T del gene MTHFR, associato ad iperomocisteinemia. La presenza di tali mutazioni incrementa il rischio di malattia tromboembolica. I test molecolari sono suggeriti per: donne in trattamento estroprogestinico anticoncezionale

4 donne in trattamento sostitutivo ormonale individui con familiarità per episodi tromboembolici pazienti con episodi tromboembolici in età giovanile abortività ripetuta I test vengono eseguiti in Real Time PCR. TEST DI VALUTAZIONE DELLA PREDISPOSIZIONE GENETICA ALLO SVILUPPO DEI TUMORI BRCA1 e BRCA2 (Tumore familiare mammella-ovaio) Secondo il National Cancer Institute (NCI) 1 donna su 50 entro i 50 anni di età ed 1 donna su 10 entro gli 80 anni si ammala di cancro alla mammella. Il rapporto maschi/femmine è di 1/125. Se pure molti fattori non genetici sono stati identificati, nel 5-10% dei casi si ritiene che la causa più importante di cancro mammario sia la presenza di geni di suscettibilità. A tutt oggi sono stati identificati i geni maggiori BRCA1 e BRCA2, ereditati secondo modalità autosomica dominante, le cui mutazioni determinano predisposizione allo sviluppo di tumori mammella/ovaio. I figli di individui portatori di mutazioni BRCA 1 e 2 hanno la probabilità del 50% di ereditare la medesima mutazione. La strategia più efficace si è dimostrata l analisi genetica a partire da un individuo malato, seguita dalla identificazione della mutazione e quindi dall estensione dell indagine ai familiari a rischio. La valutazione del rischio viene eseguita secondo Gail (1989) e Claus (1994), mentre la predizione del rischio di mutazione BRCA è valutata in accordo a Shattuck-Eidens (1997) e BRCAPRO (1997, 1998). degli esoni dei geni BRCA1 e BRCA2. Si stima che dal 5 al 15% di casi di cancro alla mammela di origine familiare sia dovuto a variazioni di copy number di uno o più esoni in BRCA1 e BRCA2 ed è stata descritta una ampia varietà di delezioni e duplicazioni. Il test molecolare viene eseguito mediante tecnica MLPA. PALB2 (Partner di localizzazione nucleare di BRCA2) Il gene PALB2, localizzato sul braccio corto del cromosoma 16, codifica per una proteina definita come partner di localizzazione nucleare di BRCA2. PALB2 svolge funzione stabilizzante di BRCA2 in corrispondenza dei foci nucleari, consentendo in tal modo l attivazione del pathway di riparo del DNA: viene pertanto definito in letteratura come gene a bassa suscettibilità per cancro alla mammella. dei 13 esoni del gene PALB2. Le variazioni di copy number uno o più esoni in PALB2 vengono valutate mediante tecnica MLPA. p53 Mutazioni germinali in P53 causano la sindrome di Li-Fraumeni una rara malattia ereditaria caratterizzata dallo sviluppo di neoplasie giovanili (prima dei 45 anni) e pediatriche a carico di diversi organi e tessuti. Tra le neoplasie tipiche di questa malattia in ordine di frequenza: - carcinoma della mammella femminile (età media: 36 anni) - sarcomi dell osso e dei tessuti molli - neoplasie cerebrali ad insorgenza nell infanzia o in età giovane-adulta - carcinoma della corteccia del surrene nell infanzia o in età giovane-adulta - carcinomi a carico di altri organi (tratto digerente e respiratorio), leucemie e linfomi. Le mutazioni a carico di P53 sono molto rare e perciò rendono conto di una piccolissima quota del rischio di tipo familiare. degli esoni del gene p53.

5 CHEK2 La proteina checkpoint kinase 2 (CHEK2), prodotto del gene CHEK2 localizzzato sul cromosoma 22q, rappresenta un elemento di segnale filogeneticamente conservato all interno della rete cellulare che risponde ai danni del DNA e partecipa al mantenimento della integrità genomica. La mutazione c.1100delc p.t367fsx15 nell esone 10 del gene CHEK2 rappresenta un allele di predisposizione al cancro della mammella a bassa penetranza. La frequenza della mutazione c.1100delc è decisamente variabile in popolazioni differenti e comunque tale variante è rara in tutte la popolazioni studiate. Il test molecolare viene eseguito mediante tecnica MLPA. MLH1/MSH2/MSH6 Esistono due modelli distinti nella progressione del cancro gastrointestinale definiti da due tipi di instabilità genomica: instabilità cromosomica (CIN) ed instabilità dei microsatelliti (MSI) associata ad un pathway mutante ; tale fenotipo si trova nel 15% di CCR sporadico ed è caratterizzato da piccole inserzioni e delezioni in sequenze di microsatelliti che ne causano alterazioni nella lunghezza; all MSI pathway sono riconducibili anche tumori (endometrio e meno frequentemente stomaco, vie urinarie, vie biliari, ovaio, piccolo intestino, pancreas ed altri) associati a Sindrome di Lynch (HNPCC: Hereditary Non Poliposic Colorectal Cancer) ed alcuni tumori gastrointestinali ed endometriali. Tale predisposizione ereditaria allo sviluppo di cancro colpisce 1/ individui ed è caratterizzata da precoce età di insorgenza. Il fenotipo riconducibile all MSI pathway è causato da mutazioni germinali nei geni del MisMatch Repair (MMR) MSH2-MSH3-MSH6, MLH1-MLH3 e PMS1- PMS2; mutazioni germinali in MLH1 ed MSH2 ne rappresentano la causa maggiore. degli esoni dei geni MLH1/MSH2/MSH6. Si stima che circa il 13% delle mutazioni germinali che interessano MLH1 ed MSH2 sono rappresentate da delezioni intrageniche. Il test molecolare viene eseguito mediante tecnica MLPA. APC/Poliposi Adenomatosa Familiare (FAP) Il gene oncosoppressore APC, situato sul cromosoma 5q21-q22, è associato sia a sindromi ereditarie ( FAP) che a neoplasie sporadiche colorettali. La forma classica di FAP è dovuta a mutazioni germinali nel gene APC ed inoltre mutazioni somatiche di tale gene rappresentano il primo evento nella evoluzione del carcinoma sporadico del colon. La maggior parte delle mutazioni di APC sono mutazioni che coinvolgono pochi nucleotidi e determinano proteine tronche. Studi recenti hanno però dimostrato che circa il 10% di individui con FAP presentano estese delezioni che interessano APC ed è stato riportato anche qualche caso di estese duplicazioni (variazioni di copy number ). Il test molecolare viene eseguito mediante tecnica MLPA. MUTYH/ Poliposi Adenomatosa Familiare (FAP) e Poliposi Adenomatosa Familiare Attenuata (AFAP) Mutazioni germinali bialleliche nel gene MUTYH, situato sul cromosoma 1p34.1 e codificante per una proteina di escissione di basi coinvolta nella riparazione del DNA, rappresentano un fattore predisponente per FAP e per AFAP. Le mutazioni p.y165c nell esone 7, p.g382d nell esone 13 e p.e466del nell esone 14 presenti in omozigosi o in eterozigosi composta, rappresentano circa l 80% delle mutazioni causative nella popolazione caucasica. degli esoni 7, 13 e 14 del gene MUTYH.

6 HOXB13 La mutazione p.g84e nel gene rappresenta un fattore di rischio significativo per lo sviluppo del cancro alla prostata. La metodica impiegata prevede una analisi mutazionale mediante sequenziamento diretto dell esone 1 del gene HOXB13. CDKN2A Mutazioni germinali nel gene CDKN2A, situato sul cromosoma 9p21 e codificante per un oncosoppressore che regola il ciclo cellulare inducendo arresto del ciclo cellulare, rappresentano un fattore predisponente per cancro al pancreas e melanoma. La metodica impiegata prevede una analisi mutazionale degli esoni codificanti le due isoforme proteiche p16 e p14 mediante sequenziamento diretto degli esoni del gene CDKN2A. DIAGNOSI MOLECOLARE DI OLIGO/AZOOSPERMIA MICRODELEZIONE CROMOSOMA Y L infertilità è un problema che interessa il % di tutte le coppie ed in circa la metà dei casi è di tipo maschile. In molti di questi casi sono identificabili microdelezioni a carico del cromosoma Y, responsabili di oligo/azoospermia. Questo tipo di analisi, associato alla ricerca di anomalie cromosomiche ed allo screening per fibrosi cistica è in grado di individuare sia cause genetiche di infertilità maschile che la loro possibilità di trasmissione in seguito a pratiche di fecondazione assistita. Il test molecolare è indicato per: maschi oligo/azoospermici fecondazione assistita (ICSI) infertilità maschile Il test viene eseguito con multiplex-pcr e successiva elettroforesi su gel di agarosio (sec. Kent-First, 1999). TEST DI FARMACOGENETICA/VALUTAZIONE DI MARCATORI BIOLOGICI MOLECOLARI DIAGNOSTICI E PROGNOSTICI L insorgenza di resistenza/intolleranza ai farmaci (chemioterapici, antiinfiammatori, etc) è uno dei principali ostacoli al successo dei trattamenti. L individuazione di caratteristiche specifiche di un individuo permettono di predire la possibile insorgenza di resistenza/intolleranze a tali trattamenti e rappresenta pertanto una informazione fondamentale per l individuazione della terapia da seguire. Risposta terapeutica a gefitinib/erlotinib (EGFR) Il test molecolare permette di individuare mutazioni a carico degli esoni 18, 19, 21 del gene EGFR. In particolare vengono ricercate le mutazioni associate a risposta terapeutica a Gefitinib (Ref. bibliografiche: NEJM, 2004; 350: / Science, 2004;304: ). degli esoni 18, 19, 21 del gene EGFR. Effetti collaterali da irinotecan (UGT1A1) Il test molecolare permette di individuare il polimorfismo A(TA)6TAA/A(TA)7TAA a carico del promotore del gene UGT1A1. I genotipi A(TA)6/7TAA A(TA)7/7TAA sono associati a tossicità per Irinotecan. della regione del promotore del gene UGT1A1. Risposta terapeutica a cetuximab/panitumumab (Kras-BRAF-PIK3CA) L attivazione del proto-oncogene ras mediante mutazioni puntiformi rappresenta una delle più frequenti alterazioni genetiche associate con lo sviluppo neoplastico.

7 Mutazioni a livello dei geni ras sono state riscontrate in diversi tipi di tumori, quali tumori pancreatici, al colon ed ai polmoni. Inoltre, le mutazioni a carico dei codoni 12 e 13 del gene kras rappresentano un marcatore predittivo della risposta clinica all impiego di anticorpi anti-egfr nel carcinoma metastatico del colon-retto. dell esone 2 del gene kras. Il prodotto del gene BRAF, una delle isoforme di RAF (Raf-1, A-Raf, B-Raf) è un effettore di RAS. Mutazioni somatiche nel gene BRAF, in particolare la mutazione oncogenetica c.1799t>a, p.v600e nell esone 15, sono state identificate nei melanomi (75%), PTC (Papillary Thyroid Carcinoma) (45%), carcinomi ovarici (14%) e del colonretto (10%). Esistono forti evidenze che lo stato mutazionale del gene BRAF rappresenti un marcatore utilizzabile per valutare l efficacia del trattamento anti-egfr all interno di una analisi multipla (K-ras e BRAF). dell esone 15 del gene BRAF. Mutazioni nel gene PIK3CA rappresentano una delle cause nella tumorigenesi di vari tumori ed in particolare sono state individuate nel 10-30% dei casi di cancro colorettale. In questo ultimo caso le mutazioni sono perlopiù localizzate negli esoni 9 e 20. Esistono forti evidenze che lo stato mutazionale del gene PIK3CA rappresenti un marcatore utilizzabile per valutare l efficacia del trattamento anti-egfr all interno di una analisi multipla (Kras-BRAF-PIK3CA). degli esoni 9 e 20 del gene PIK3CA. Risposta terapeutica a farmaci metabolizzati da enzimi del citocromo P450 Nell uomo, il metabolismo epatico del farmaco è suddiviso in due componenti: reazioni di fase I e reazioni di fase II. Ci sono almeno 30 famiglie di enzimi che metabolizzano farmaci e quasi tutti mostrano polimorfismi. Più di tre quarti degli enzimi di fase I fanno parte della famiglia di citocromo P450 e sono indicati con CYP. La superfamiglia di enzimi del citocromo P450 (CYP450) costituisce il principale catalizzatore delle reazioni di biotrasformazione dei farmaci. Nell uomo sono state identificate 18 famiglie e 43 sottofamiglie ognuna comprendente circa 50 isoforme ciascuna delle quali è il prodotto di un singolo gene e possiede uno specifico spettro di substrati. La diversità è dovuta a variazioni genetiche (duplicazioni, delezioni, SNPs) nei geni che codificano per le isoforme del CYP450; in particolare le isoforme CYP2C9, CYP2C19 e CYP2D6 sono coinvolte nel metabolismo della maggior parte dei farmaci attualmente utilizzati. Mutazioni nei geni CYP possono produrre isoforme con attività enzimatica assente, ridotta o aumentata che determinano 4 distinti fenotipi/metabolizzatori: lenti-pm (poor metabolizers) privi di enzimi funzionali intermedi-im (intermediate metabolizers) eterozigoti per la presenza di un gene mutato (enzima non funzionale rapidi-em (extensive metabolizers) omozigoti geni funzionali ultrarapidi-ur (ultrarapid metabolizers) più di due geni funzionali Il CYP2C19 catalizza il metabolismo degli antidepressivi imipramina, amitriptilina, clomipramina, citalopram e moclobemide, così come quello del diazepam, del desmetildiazepam, dell omeprazolo, del proguanil e della mefenitoina. Il CYP2D6 è uno dei più importanti isoenzimi coinvolti nel metabolismo dei farmaci e sebbene sia quantitativamente uno dei meno rappresentati (< 5% del totale), catalizza l ossidazione di più di 30 farmaci: per quanto riguarda i farmaci anticancro, CYP2D6 è coinvolto solamente

8 nella conversione del tamoxifene al 50 volte più potente antiestrogenico 4OH-tamoxifene ed endoxifene. Il test molecolare viene eseguito in Real Time PCR. Resistenza all Aspirina Il test molecolare permette di individuare eventuali sostituzioni aminoacidiche a livello della proteina prodotta dal gene GPIIIa. La metodica impiegata prevede PCR, digestione enzimatica ed elettroforesi su gel di agarosio. Instabilità dei microsatelliti (MSI) come marcatore biologico Esistono due modelli distinti nella progressione del cancro gastrointestinale definiti da due tipi di instabilità genomica: instabilità cromosomica (CIN) ed instabilità dei microsatelliti (MSI) associata ad un pathway mutante ; tale fenotipo si trova nel 15% di CCR sporadico ed è caratterizzato da piccole inserzioni e delezioni in sequenze di microsatelliti che ne causano alterazioni nella lunghezza; all MSI pathway sono riconducibili anche tumori (endometrio e meno frequentemente stomaco, vie urinarie, vie biliari, ovaio, piccolo intestino, pancreas ed altri) associati a Sindrome di Lynch (HNPCC: Hereditary Non Poliposic Colorectal Cancer) ed alcuni tumori gastrointestinali ed endometriali. Tale predisposizione ereditaria allo sviluppo di cancro colpisce 1/ individui ed è caratterizzata da precoce età di insorgenza. La analisi della instabilità dei microsatelliti prevede analisi di frammenti ottenuti per amplificazione contenenti corte sequenze ripetute di mono, di, tetra e pentanucleotidi. Criteri di definizione: MSI-H se instabilità >30% dei loci analizzati (2 o più dei markers utilizzati) MSI-L se instabilità <30% dei loci analizzati (1 dei markers utilizzati) MSS se assenza di instabilità Essa rappresenta un marcatore biologico diagnostico ed inoltre esistono anche forti evidenze di prognosi migliore per pazienti con MSI-H rispetto a MSI-L o MSS. La metodica impiegata prevede PCR e successiva elettroforesi capillare. BRAF come marcatore biologico Il prodotto del gene BRAF, una delle isoforme di RAF (Raf-1, A-Raf, B-Raf) è un effettore di RAS. Mutazioni nel gene BRAF, in particolare la mutazione oncogenetica c.1799t>a, p.v600e nell esone 15, sono state identificate nei melanomi (75%), PTC (Papillary Thyroid Carcinoma) (45%), carcinomi ovarici (14%) e del colonretto (CCR) (10%). Mutazioni nel gene BRAF, vengono più frequentemente identificatea nei CCR con MSI-H (20-30%) rispetto a quelli con MSS (5-10%) ed ancora mutazioni nel gene BRAF non sono mai state identificate nei pazienti con Sindrome di Linch (HNPCC). Lo stato mutazionale del gene BRAF rappresenta quindi un utile marcatore biologico diagnostico. dell esone 15 del gene BRAF. c-kit come marcatore biologico L insorgenza di mutazioni nel proto-oncogene c-kit (codificante per un recettore di membrana tirosin chinasico) determina un attivazione costitutiva del recettore e rappresenta una tappa fondamentale nello sviluppo di vari tumori fra cui i tumori stromali gastrointestinali (GIST). Il 90% dei GIST presenta mutazioni in c-kit ed in particolare esse sono localizzate negli esoni 9, 11, 13 e 17. Lo stato mutazionale del gene c-kit rappresenta quindi un utile marcatore biologico diagnostico.

9 degli esoni 9, 11, 13 e 17 del gene c-kit Marcatori biologici molecolari prognostici nella leucemia mieloide acuta (LAM) (FLT3, NPM1, CBL, WT1) Il 40%-45% dei pazienti affetti da LAM appartengono al sottogruppo NC-LAM (pazienti affetti da LAM con cariotipo normale). Tali pazienti esibiscono usualmente due o più alterazioni di tipo genetico molecolare e la loro identificazione assume un significato prognostico e risulta utile ai fini della scelta terapeutica. Attualmente le indagini molecolari prevedono la ricerca di mutazioni in geni coinvolti nei meccanismi di regolazione della proliferazione, dello sviluppo e del differenziamento delle cellule progenitrici ematopoietiche. Mutazioni nel gene codificante la proteina FLT3, un recettore tirosin kinasico, portano alla sua attivazione costitutiva e conseguentemente a proliferazione incontrollata delle cellule progenitrici ematopoietiche. Due sono le mutazioni presenti con maggiore frequenza nelle NC-LAM: duplicazioni in tandem del dominio juxstamembrana di FLT3 situate in corrispondenza degli esoni 14 e 15 e mutazioni puntiformi nell esone 20 in corrispondenza del codone D835 nel dominio tirosin kinasico di FLT3. Le metodiche impiegate prevedono amplificazione mediante PCR degli esoni 14 e 15 e successiva elettroforesi su gel agarosio Nusieve e una analisi mutazionale mediante sequenziamento diretto dell esone 20 del gene FLT3. La proteina NPM1 è una fosfoproteina nucleolare che lega l RNA ed è coinvolta nel trasporto delle ribonucleoproteine tra nucleo e citoplasma. Mutazioni nell esone 12 del gene NPM1 rappresentano la più frequente alterazione genetica nelle NC-LAM. dell esone 12 del gene NPM1 Il gene CBL codifica per una proteina con attività di ubiquitina ligasi e partecipa alla degradazione dei recettori tirosin kinasici. Le mutazioni a carico del gene sono diverse, ma perlopiù localizzate negli esoni 8 e 9. degli esoni 8 e 9 del gene CBL. Il gene WT1 (Wilms Tumor 1) codifica per un regolatore trascrizionale espresso nelle cellule renali embrionali e nelle cellule staminali ematopoietiche. Sebbene sia noto che WT1 è coinvolto nella proliferazione e differenziazione delle cellule ematopoietiche, il suo preciso ruolo nella ematopoiesi ed il suo contributo nella leucemogenesi rimangono ancora da definire: certamente però le mutazioni nel gene WT1 hanno significato di prognostico avverso. Le mutazioni nel gene WT1 hanno una frequenza del 10% nelle NC-LAM e si verificano in corrispondenza degli esoni 7 e 9. degli esoni 7 e 9 del gene WT1. DEFINIZIONE DEL RISCHIO DI DIFETTI DEL TUBO NEURALE La somministrazione di acido folico a donne in periodo periconcezionale riduce l incidenza di DTN nella prole sino al 70%. L analisi dei polimorfismi dei geni CBS, MTHFR C677T, MTHFR A1298C, MTRR, MTHFD1, RFC1 è importante per definire il rischio di ricorrenza di DTN, la sua tipologia (folato-sensibile o folato-resistente), l approccio terapeutico/profilattico periconcezionale Il test viene suggerito per: individuazione coppie a rischio per DTN

10 genitori con precedenti figli affetti da DTN genitori di precedenti figli con malformazioni congenite Il test viene eseguito con PCR, digestione enzimatica ed elettroforesi su gel di agarosio.