SPLICING ALTERNATIVO

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1 SPLICING ALTERNATIVO Biologia molecolare Ilaria Lampronti, Ph.D Biologia molecolare, F. Amaldi et al., Casa Editrice Ambrosiana Biologia molecolare, G. Capranico et al., EdiSES ed.

2 Le cellule possono cambiare l espressione genica In base a stimoli esterni (extracellulari) L espressione genica viene regolata lungo la via DNA-RNA- Proteine (a diversi livelli), controllando: 1. Quando e quanto spesso un gene è trascritto (controllo trascrizionale) 2. Lo splicing (controllo delle modificazioni dell RNA) 3. Scegliendo quali mrna maturi possono essere localizzati nel citosol (controllo di trasporto e localizzazione dell RNA) 4. Scegliendo quali mrna devono essere tradotti dai ribosomi (controllo traduzionale) 5. Destabilizzando selettivamente alcune molecole di mrna (controllo della degradazione dell mrna) 6. Attivando, disattivando, degradando o compartimentando selettivamente proteine specifiche dopo la sintesi (controllo dell attività delle proteine)

3 I sei passaggi del controllo dell espressione genica

4 2. Controllo delle modificazioni dell RNA Mediante un processo particolare che prende il nome di splicing alternativo Il trascritto primario (RNA derivato dalla trascrizione-pre-rna) viene trasformato in mrna mediante lo splicing classico sempre nel nucleo Spesso nella cellula viene effettuato anche lo splicing alternativo da cui si possono ottenere più prodotti Proteine regolatrici specifiche riconoscono i siti di splicing Difetti dello splicing sono alla base di importanti patologie Tumori Malattie genetiche

5 Splicing Maturazione post-trascrizionale degli mrna Le sequenze nucleotidiche degli mrna maturi sono diverse da quelle degli mrna precursori trascritti (pre-mrna) I processi di maturazione avvengono nel nucleo (eucarioti o mitocondri) dopo la trascrizione Attività pressoché assenti nei procarioti Dimostrarono per primi la presenza degli INTRONI: A. Philip Sharp, Genetista e biologo USA B. Richard Robert, Biochimico UK

6 Differenze nella trascrizione di procarioti ed eucarioti

7 Geni procariotici ed eucariotici

8 Geni discontinui e splicing La sequenza di un gene può contenere tratti di sequenza interposti che non compaiono poi nel trascritto maturo funzionale. Tali sequenze interposte sono state chiamate introni, mentre i tratti di sequenza che, unendosi, vanno a formare il trascritto maturo sono stati chiamati esoni.

9 Lo splicing: un evento unico! Evento caratteristico degli eucarioti DNA (introni + esoni) Trascritto primario (pre-mrna) Trascritto secondario (mrna maturo) Nei procarioti la sequenza genica corrisponde all mrna Negli eucarioti il pre-rna corrisponde alla sequenza di DNA L mrna maturo, dopo lo splicing, corrisponde alla sequenza genica codificante (in cui sono stati escusi tutti gli introni) Ogni pre-mrna inizia e finisce con esoni Se n è il # degli esoni, n-1 sarà il # degli introni (v. lezioni Prof. Spisani)

10 Un vecchio concetto superato Un gene, una proteina Oggi sappiamo che tale affermazione non è corretta anche grazie alla scoperta dello splicing alternativo Scoperto perché I trascritti maturi avevano sequenza che non corrispondeva a quella del DNA codificante Le immagini ottenute al microscopio elettronico forniscono le prove Grazie a questo meccanismo un solo gene può generare diversi mrna che codificano per diverse proteine Oltre il 90% dei geni è soggetto a splicing alternativo Fenomeno da cui deriva la complessità del trascrittoma e del proteoma

11 Lo splicing alternativo È il meccanismo attraverso il quale uno stesso pre-mrna può subire eventi di splicing differenti che portano alla creazione di diversi mrna alternativi, che a loro volta possono codificare differenti proteine Scoperto da David Baltimore Esistono vari eventi che portano alla generazione di più trascritti grazie a Siti alternativi di inizio e terminazione Diversi eventi

12 Possibili eventi che portano a splicing alternativo Sito alternativo di inizio Sito alternativo di terminazione facoltativi Possibili even+ elementari che concorrono alla generazione di più trascri7 a par+re da uno stesso gene. Uno stesso gene può esprimere numerosi trascri1 dis3n3 a4raverso l u3lizzo di si3 alterna3vi di inizio (a) e terminazione (b) della trascrizione (AAUAAA è il 3pico segnale di poliadenilazione), e lo splicing alterna3vo che comprende diversi even3 elementari (c- g).

13 Nell istogramma sono indicate le frequenze relative delle diverse modalità di splicing alternativo in varie specie animali

14 Esempio del gene Dscam in Drosofila Lo splicing alternativo può determinare più di trascritti differenti! Grazie alla combinazione di diversi esoni mutuamente esclusivi. In rosso esoni costitutivi; in verde, viola, azzurro e giallo, gli esoni con più siti di splicing alternativo (esoni 4, 6, 9, 17)

15 Regolazione dello splicing Esistono siti di splicing a valle e a monte (in cis) che opportune proteine regolatrici (in trans) riconoscono attraverso due meccanismi: 1. Riconoscimento degli ESONI (uomo) 2. Riconoscimento degli INTRONI (invertebrati, piante, funghi) Alta specificità di riconoscimento dei siti di splicing, grazie alla presenza di sequenze addizionali riconosciute da Attivatori (enhancers) Repressori (silencers) Questi elementi regolatori sono classificati come Enhancer esonici (ESE: Exonic Splicing Enhancers) o Silencers esonici (ESS: Exonic Splicing Silencers) Enhancer intronici (ISE: Intronic Splicing Enhancers) o Silencers intronici (ISS: Intronic Splicing Silencers)

16 Regolazione dello splicing La regolazione dello splicing comporta l interazione tra proteine in grado di legare specifici mo3vi presen3 nel pre- mrna sia negli esoni (ESE, ESS) che negli introni (ISE, ISS). All azione delle proteine SR (serina S, arginina R) che legano le sequenze enhancer negli esoni (ESE) e negli introni (ISE), e che a1vano lo splicing (frecce rosse e verdi a punta), si oppongono le proteine hnrnp (heterogeneus nuclear RiboNucleoProtein), che invece riconoscono le sequenze silencer negli esoni (ESS) e negli introni (ISS) (frecce viola a punta pia4a). Il meccanismo di a1vazione o repressione normalmente comporta l interazione con altre componen3 dello spliceosoma: gli snrnp (small nuclear RiboNucleoProtein)

17 Meccanismi di regolazione L a7vità dei mo+vi di regolazione dello splicing è dipendente dal contesto. (A) Lo stesso mo3vo (1, 2) può fungere sia da a1vatore che da repressore in funzione della sua localizzazione esonica o intronica. (B) Lo stesso mo3vo (1), anche nella stessa localizzazione intronica, può avere a1vità differen3 in diversi geni (mostra3 con un colore diverso). Nel gene mostrato nel pannello a destra, il mo3vo di regolazione, che normalmente agisce come a1vatore, non è in grado di legare il suo intera4ore proteico. Si consideri che l a1vità dei si3 di regolazione dello splicing dipende anche dallo stato epigene3co della croma3na.

18 Lo splicing alternativo tessuto-specifico Uno stesso gene può generare mrna diversi a seconda dei tessuti in cui viene espresso Soprattutto nel tessuto nervoso Numerosi mrna derivanti da splicing alternativo Dovuto a espressioni tessuto-specifiche di fattori coinvolti nello splicing Il ruolo dello splicing alternativo si somma al più conosciuto e classico controllo dell espressione genica (differenziamento e risposta a stimoli) Esempio: gene della CALCITONINA (CT/CGRT)

19 Il gene per la calcitonina Il gene della calcitonina umana (CT/CGRT) rappresenta un interessante esempio di splicing alternativo tessuto-specifico. Si manifesta un fenomeno di exon skipping, a carico di un esone (4) nel quale è presente un sito di poliadenilazione che porta alla terminazione della trascrizione e alla produzione di una forma tronca dell mrna. Il gene è espresso solo in due tessuti: da una parte, in un particolare gruppo di neuroni e dall altra a livello della tiroide. Nell ipofisi è attivo il meccanismo di exon skipping e viene espressa la forma più lunga dell mrna. A livello della tiroide, invece, l esone permane e viene pertanto espressa la forma più lunga dell mrna. L mrna espresso nei neuroni codifica per la proteina cgrt (calcitoninegene-related sequence), un peptide con attività vasodilatatorie. Nelle cellule della tiroide, invece, l mrna prodotto codifica per l ormone calcitonina (CT), un peptide che regola la concentrazione del calcio nel sangue.

20 Difetti dello splicing Che sono coinvolti in malattie neoplastiche Che sono coinvolti in malattie genetiche Thalassemia Fibrosi cistica

21 Difetti dello splicing Mutazioni a carico di molti geni determinano difetti nel meccanismo dello splicing Splicing aberrante Malattie ereditarie Malattie neoplastiche

22 Le mutazioni che interessano lo splicing Sequenze specifiche introniche legano i vari componenti (fattori) dello spliceosoma Mutazioni a carico di tali sequenze si chiamano mutazioni in cis (più frequenti) Mutazioni a carico dei fattori dello spliceosama si dicono mutazioni in trans (molto meno frequenti) Esempi: Beta-talassemia Fibrosi cistica Tumori

23 La beta-talassemia Malattia genetica autosomica recessiva

24 La beta-talassemia (morbo di Cooley)

25 Gravità della malattia e livelli di Hb Pazienti portatori (talassemia minor) Pazienti β+ (talassemia intermedia) Pazienti β 0 (talassemia major) Terapie convenzionali e sperimentali TERAPIA CONVENZIONALE Trasfusioni di sangue Chelanti del ferro TRAPIANTO DI MIDOLLO OSSEO Donatore compatibile TERAPIA GENICA Vettore contenente gene corretto RIATTIVAZIONE DI EMOGLOBINA FETALE Utilizzo di induttori del differenziamento eritroide

26 Come si può fare diagnosi? Diagnosi di I livello RBC, Hb, MCV (Emocromo) Diagnosi di II livello Analisi dei livelli di Hb prodotti Diagnosi di III livello Analisi genetiche (individuare la precisa mutazione) Mutazioni che portano a splicing aberrante

27 Geni globinici

28 Le mutazioni Più di 200 alterazioni del gene beta globinico causano beta-talassemia MUTAZIONI Alterazioni puntiformi sul promotore (inibizione della trascrizione) Alterazioni puntiformi in zone introniche (molte a carico delle sequenze di riconoscimento dello splicing) Delezioni (più rare) Tipologia del fenotipo risultante β+ (emoglobina difettosa o scarsa) β 0 (assenza di emoglobina adulta)

29 Mutazioni che influenzano lo splicing Mutazioni a livello delle sequenze altamente conservate (GT e AG) sui siti di splicing in 5 e in 3 Mancato riconoscimento da parte di snrnp U1 (5 ) e U2AF35 (3 ) Impossibilità di tradurre una proteina normale e funzionale Generazione di fenotipo β 0 (forma grave) Formazione di mrna aberranti Ritenzione di un introne (intron retention) Eliminazione di un esone (exon skipping) Mutazioni che generano nuovi siti di splicing G A nell introne 1 80% di probabilità: si forma mrna con esone 2 più lungo (mancata sintesi di Hb) 20% di probabilità: viene effettuato lo splicing classico Generazione di fenotipo β + (forma attenuata)

30 Difetti dello splicing nella β-talassemia Intron retention esone 2 più lungo Exon skipping

31 La fibrosi cistica Malattia genetica autosomica recessiva Già descritta in precedenti lezioni (v. il TF NF-kB)

32 Le mutazioni Più di 2000 alterazioni del gene CFTR causano CF MUTAZIONI Alterazioni nella sequenza codificante (la maggior parte) Alterazioni in zone introniche e splicing aberrante (circa il 13%) Proteina non funzionale (exon skipping) DELEZIONE Exon skipping

33 Malattie tumorali Cos è il cancro? Splicing aberrante e correlazione con i tumori Tumore del colon Retinite pigmentosa

34 Cos è il cancro? Statistiche: il cancro colpisce una persona su tre! Definizione: il cancro è costituito da una famiglia di malattie caratterizzate da crescita cellulare incontrollata e sregolata e dall invasione e dalla diffusione di cellule cancerose dal sito d origine (sito primario) ad altri distretti dell organismo. Famiglia di malattie: più di 100 tipologie conosciute Classificazione: CARCINOMI SARCOMI ADENOCARCINOMI Cause: luce UV, fumo da sigaretta, esposizione ad agenti chimici, ecc.

35 Il tessuto di origine determina le caratteristiche che distinguono il cancro CARCINOMI Circa 85%, cellule epiteliali SARCOMI Meno frequenti, cellule mesodermiche (tessuto connettivo, cartilagine, osso, muscolo) ADENOCARCINOMI Meno frequenti, tessuto ghiandolare (mammella, prostata, pancreas)

36 Le 6 caratteristiche del cancro

37 Tumore BENIGNO e MALIGNO Il tumore benigno non è evidenza di cancro Il tumore benigno non metastatizza Il tumore benigno può comunque essere pericoloso per la vita a causa della posizione

38 Cancro = malattia genetica La maggior parte degli agenti cancerogeni provocano alterazioni della sequenza di DNA o mutazioni (mutageni) Mutazioni puntiformi Delezioni Traslocazioni L accumulo di mutazioni è alla base della carcinogenesi La vita media che si allunga spiega l aumento dei casi di tumore Quasi tutte le mutazioni causa di cancro avvengono in cellule somatiche (mutazioni somatiche) Tumore non trasmissibile alle generazioni successive Solo alterazioni del DNA dello sperma e delle cellule uovo (mutazioni germinali) sono trasmesse alla progenie

39 Mutazioni somatiche Non trasmissibile all future generazioni Determinato da agenti esogeni: contatto con sostanze chimiche pericolose o con radiazioni ionizzanti Possono determinare cancro o altre malattie

40 Mutazioni germinali Dovute a fattori endogeni ed esogeni: Fattori endogeni: errori durante la replicazione (1) o danno ossidativo (2). 1. Più frequenti nelle cellule spermatiche (maggior numero di divisioni cellulari nell arco della vita dell uomo) che negli oociti. Queste mutazioni puntiformi includono delezioni di singole basi, inserzioni, duplicazioni e cambio degli aminoacidi. 2. Radicali liberi dell ossigeno possono determinare mutazioni del DNA: trasformano la Guanina in 8-oxoguanine che viene scambiata per una Timina dalla DNA polimerasi che commette dunque un errore. Fattori esogeni: esposizione a sostanze chimiche pericolose o radiazioni ionizzanti -Crow JF (October 2000). "The origins, patterns and implications of human spontaneous mutation". Nature Reviews Genetics. 1 (1): Wong WS, Solomon BD, Bodian DL, Kothiyal P, Eley G, Huddleston KC, Baker R, Thach DC, Iyer RK, Vockley JG, Niederhuber JE (2016). New observations on maternal age effect on germline de novo mutations Nature Communications. 7:

41 Crescita, apoptosi, differenziamento Fattori che regolano il numero totale di cellule in un individuo La proliferazione cellulare L apoptosi Il differenziamento terminale Le mutazioni del DNA che alterano queste funzioni influenzano l equilibrio del numero di cellule Crescita non regolata Insorgenza di tumori

42 Oncogeni e geni soppressori dei tumori Protoncogeni: geni normali che possono essere attivati con una mutazione e divenire oncogenici (presenti in tutte le cellule) Oncogeni: gene che produce la rispettiva proteina in modo più abbondante o più attiva per agire in maniera dominante per dare inizio alla formazione di un tumore Geni soppressori (oncosoppressori): codificano per proteine che sono coinvolte nell inibizione della crescita e della formazione dei tumori I principali oncosoppressori sono: p53 RB APC

43 Fattori che influenzano la carcinogenesi Ambiente Posto di lavoro Posti di svago usuali UVB Vita riproduttiva Donne senza figli Età prima gravidanza Inizio e termine menorrea Contraccezione Promisciutà sessuale Dieta Dieta mediterranea (riduzione del rischio) Fumo Polmoni, pancreas, fegato, vescica, reni, bocca, stomaco Altro Fisiologia personale Altre malattie

44 Frequenza annuale di morti (USA) Pazienti maschi normalizzati sull età ( )

45 Principali terapie Chirurgia Rimozione massa tumorale (sito primario) Problema: metastasi (siti secondari) Chemioterapia e radioterapia Per colpire anche le cellule metastatiche EFFETTI citostatici e citotossici Goal: danneggiare il DNA in cellule con alta proliferazione per indurre APOPTOSI Effetti collaterali noti su cellule non tumorali (alopecia, ulcere, anemia) a causa del basso INDICE TERAPEUTICO Nuovi farmaci biologici Per diminuire effetti collaterali Aumentando la selettività

46 Indice terapeutico Differenza tra dose massima tollerata (MTD) e dose minima efficace Esempio: ASPIRINA IT alto ANTITUMORALI classici IT basso

47 Genomica e proteomica del cancro Completamento del progetto GENOMA umano Conoscenza dei dettagli del genoma Riconoscimanto di distinzioni tra cellule normali e cellule cancerose Progettazione di farmaci mirati Chemioterapici con bersaglio preciso (in combinazione con vettori) Piccole molecole (RNA antisenso, sirna, microrna) come nuove classi di biofarmaci Studio del PROTEOMA umano Ampliamento della conoscenza dell espressione proteica differenziata Riconoscimento di distinzioni tra cellule normali e cellule cancerose Scoperta di nuovi biomarcatori tumorali Progettazione di farmaci mirati Per esempio anticorpi diretti contro prodotti genici specifici (Ab coniugati con antitumorali o radiofarmaci)

48 APOPTOSI: morte cellulare programmata APOPTOSI: Suicidio cellulare Modalità intrinseca di morte cellulare Avviata da segnali specifici (extracellulari ed intracellulari) Processo accurato e preciso Poche tracce residue (formazione dei corpi apoptotici) della cellula eliminata per fagocitosi (macrofagi) NECROSI: morte accidentale In condizioni patologiche Riversamento del contenuto cellulare nello spazio circostante e insorgenza di infiammazione (rigonfiamento cellulare) AUTOFAGIA: auto-digestione In caso di carenza di nutrienti Azione di Lisosomi ed enzimi litici in essi contenuti

49 Tumori duvuti a splicing aberrante Esempi Tumore del colon Retinite pigmentosa Mutazioni negli elementi caratteristici della regolazione dello SPLICING Conseguente generazione di mrna aberranti Ingenere disattivazione di geni ONCOSOPPRESSORI Inattivazione di sistemi di protezione Trasformazione tumorale

50 Funzione degli oncosoppressori p53 TF che induce blocco del ciclo e apoptosi cellulare (coinvolto in molti tumori) RB Controllo trascrizione geni coinvolti nel ciclo cellulare (es. retinoblastoma) APC Lega e regola l attività della beta-catenina (es. tumore al colon) Attivatori a monte ed effetti a valle della p53 Lauren Pecorino, Biologia molecolare del cancro, Zanichelli

51 Retinoblastoma Neoplasia rara dell infanzia Forma familiare ereditabile (40%) Entrambi gli occhi colpiti Forma sporadica (60%) Solo un occhio Mutazioni differenti Delezioni, frameshift, nonsenso, missenso Mutazioni di splicing (esoni e introni) Ipotesi dei due colpi di Knudson Sono necessarie 2 mutazioni separate per inattivare le due copie dell allele Rb e inattivare la proteina RB Forme ereditaria e sporadica di retinoblastoma L. Pecorino, Biologia molecolare del cancro, Zanichelli

52 Tumore del colon Gene oncosoppressore APC Regola l attività della β-catenina: Due alterazioni che alterano lo splicing: Mutazione a livello del sito di splicing al 5 dell INTRONE 4 (exon skipping dello stesso esone 4) Sostituzione della sequanza AG del sito di splicing al 3 (un nucleotide più a valle: accorciamento dell ESONE 8 e frame shift conseguente) In entrambi i casi, traduzione di proteine non funzionali